劉知非，周 婷，胡曉磊，劉慧燕*，方海田，潘 琳，胡明珍，李旭陽

（寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院 寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021）

枸杞（Lycium barbarumL.）亦稱枸杞子，是茄科枸杞屬的多分支灌木植物，中寧枸杞為寧夏枸杞中的優(yōu)品[1-3]。研究結(jié)果表明，枸杞具有降低膽固醇、減輕動(dòng)脈硬化、降低血糖等作用[4-6]。不僅能夠有效增強(qiáng)各臟腑的機(jī)能[7-10]，還能夠優(yōu)化腸道菌群，提高人體免疫力[11-13]。諸多研究都印證了枸杞具有極大的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

對(duì)于枸杞發(fā)酵也有很多報(bào)道，喬博鑫等[14]研究了保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌組合發(fā)酵枸杞過程中理化指標(biāo)及風(fēng)味物質(zhì)的變化，從發(fā)酵后的枸杞液中分離出酯類、醛類、酮類、醇類、酸類、芳香雜環(huán)類共63種揮發(fā)物質(zhì)；吳昊等[15]以石榴、枸杞為主要原料釀造石榴枸杞酒，并對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化分析，制成的石榴枸杞酒的酒精度達(dá)到9.94%vol，酒體醇厚、酒味怡人、口感尚佳；李彩霞等[16]利用葡萄和枸杞為主要原料，接種酵母菌及醋酸菌發(fā)酵釀造復(fù)合果醋，制成的果醋中總酸（以醋酸計(jì)）為4.27 g/100 mL，還原糖（以葡萄糖計(jì)）為2.5 g/L，產(chǎn)品風(fēng)味純正，具有特殊的水果香味及較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；楊電增等[17]利用響應(yīng)面優(yōu)化山藥枸杞酸奶最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)為山藥漿添加量7.64%、枸杞粉添加量0.40%、蔗糖添加量8.56%、發(fā)酵劑接種量0.21%，此條件下得到的山藥枸杞酸奶在總可溶性固形物、蛋白含量、脂肪等指標(biāo)均高于國(guó)家規(guī)定的理化值且感官評(píng)價(jià)良好。但現(xiàn)在的研究多是基于單一菌種通過發(fā)酵工藝優(yōu)化得到的純種發(fā)酵產(chǎn)品，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及風(fēng)味物質(zhì)的種類單一且含量有限，在發(fā)酵過程中嚴(yán)重受到菌種自身制約。雖可對(duì)其進(jìn)行工藝優(yōu)化，但對(duì)營(yíng)養(yǎng)及風(fēng)味物質(zhì)的增加與豐富影響有限，影響了發(fā)酵產(chǎn)品的進(jìn)一步升級(jí)優(yōu)化。多菌種復(fù)合發(fā)酵通過利用菌種之間的代謝組學(xué)多樣性和生長(zhǎng)特性，為解決發(fā)酵產(chǎn)品中產(chǎn)物種類單一、產(chǎn)物產(chǎn)量有限、菌種自身瓶頸等問題提供一定的參考。

本研究采用新鮮寧夏枸杞干果，加水磨漿后，接入腸膜明串珠菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵。通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵枸杞汁的最佳工藝參數(shù)，以期為復(fù)合益生菌發(fā)酵枸杞汁的實(shí)際應(yīng)用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧夏枸杞（特優(yōu)級(jí)，≤280粒/50 g）：市售；小蘇打、白砂糖：市售；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）：寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏；D-異抗壞血酸鈉：江西省德興市百勤異VC鈉有限公司；氫氧化鈉：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；酚酞：天津市大茂化學(xué)劑廠；MRS肉湯、MRS固體培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白：北京索萊寶科技有限公司；所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

V-5100紫外分光光度計(jì)：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；RZ-988e Royalstar 打漿機(jī)：合肥榮事達(dá)小家電公司；PLD-HDE2.0手持糖量計(jì)：陜西普洛帝測(cè)控技術(shù)有限公司；PB-LO pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；LRH-150-B生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合益生菌發(fā)酵枸杞汁工藝流程及操作要點(diǎn)

取出在-80 ℃條件下甘油保藏的4種菌株（嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、腸膜明串珠菌、植物乳桿菌），解凍至室溫。在無菌操作臺(tái)上進(jìn)行平板劃線，隨后置于生化培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)8～10 h，重復(fù)操作3次，使其充分活化。在無菌條件下挑取單菌落，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)8～10 h后取出，獲得發(fā)酵用菌懸液。

挑除枸杞干果中的爛果、霉果，用自來水沖洗表面，去除雜質(zhì)后按一定的料水比加入蒸餾水，加入0.15 g/kgD-異抗壞血酸鈉，混合均勻，封口置于干燥陰涼處浸泡10～12 h后進(jìn)行打漿，并用無菌紗布過濾。隨后向?yàn)V液中加入5%的白砂糖，用小蘇打調(diào)pH至6.5～7.0后巴氏殺菌（65 ℃、30 min）。待枸杞汁冷卻至30～35 ℃后進(jìn)行分裝，接種一定比例制備好的菌懸液，37 ℃恒溫培養(yǎng)一定時(shí)間，終止發(fā)酵后放入4 ℃冰箱冷藏。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

固定其他條件，以感官評(píng)分和乳酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察復(fù)合益生菌配比（植物乳桿菌∶腸膜明串珠菌∶嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=1∶1∶1∶1、1∶2∶2∶2、1∶3∶3∶3、2∶1∶2∶3、3∶3∶2∶1，V/V）、料水比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g∶mL））、接種量（3%、4%、5%、6%、7%）和發(fā)酵時(shí)間（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h）對(duì)發(fā)酵枸杞汁品質(zhì)的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料水比（A）、接種量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）為3個(gè)考察因素，發(fā)酵枸杞汁的感官評(píng)分（Y）為考察指標(biāo)，利用Design-Expert v8.0.6.1軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面分析和優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1[19]。

表1 發(fā)酵枸杞汁發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermented Lycium barbarum juice fermentation conditions optimization

1.3.4 測(cè)定方法

乳酸含量：參照GB 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測(cè)定》[20]；乳酸菌菌落數(shù)：參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[21]；總糖：參照GB 5009.7—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測(cè)定》[22]；總黃酮：參照SN/T 4592—2016《出口食品中總黃酮的測(cè)定》[23]；蛋白質(zhì)：參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[24]；致病菌：參照GB 4789.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》[25]。

感官評(píng)價(jià)：由10名不同年齡、性別、具有豐富評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員組成評(píng)定小組，從發(fā)酵產(chǎn)品的口感、組織狀態(tài)、色澤、香氣4個(gè)方面綜合進(jìn)行評(píng)定，滿分為100分，取平均分進(jìn)行評(píng)定。發(fā)酵枸杞汁感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 發(fā)酵枸杞汁感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of fermented Lycium barbarum juice

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 菌種比例對(duì)發(fā)酵枸杞汁乳酸含量和感官評(píng)分的影響

圖1 復(fù)合益生菌配比對(duì)發(fā)酵枸杞汁乳酸含量和感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of composite probiotics ratio on lactic acid content and sensory score of fermented Lycium barbarum juice

由圖1可知，隨著復(fù)合益生菌配比的變化，發(fā)酵枸杞汁乳酸含量為370～430 mg/100 mL，表明所有復(fù)合益生菌配比均可較好地使菌種利用體系中的可發(fā)酵糖進(jìn)行乳酸的積累。雖然各水平間乳酸含量較為接近，但感官評(píng)分差異較大。可能是由于菌種之間生長(zhǎng)和代謝特性不同，不同時(shí)期發(fā)酵枸杞汁中的主導(dǎo)菌群不同，從而影響揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量，最終導(dǎo)致感官評(píng)分出現(xiàn)較大差異。當(dāng)植物乳桿菌∶腸膜明串珠菌∶嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=3∶3∶2∶1時(shí)，乳酸含量為429 mg/100 mL，感官評(píng)分達(dá)到85分。綜合考慮，確定最佳復(fù)合益生菌配比為植物乳桿菌∶腸膜明串珠菌∶嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=3∶3∶2∶1（V/V）。

2.1.2 料水比對(duì)發(fā)酵枸杞汁乳酸含量和感官評(píng)分的影響

圖2 料水比對(duì)發(fā)酵枸杞汁乳酸含量和感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on lactic acid content and sensory score of fermented Lycium barbarum juice

由圖2可知，發(fā)酵枸杞汁乳酸含量隨料水比中水含量的增加而增加，可能是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)水含量的增加有助于提高多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散傳質(zhì)效率，提高浸出率[26]，使得乳酸菌更易于利用底物產(chǎn)生乳酸。料水比為1∶10（g∶mL）時(shí)，發(fā)酵枸杞汁中乳酸含量為439 mg/100 mL，當(dāng)料水比為1∶12（g∶mL）時(shí)，乳酸含量達(dá)到448 mg/100 mL。

隨著水含量的增加，發(fā)酵枸杞汁的感官評(píng)分先升高后降低，料水比為1∶10（g∶mL）時(shí)，感官評(píng)分最高達(dá)83分。綜合考慮，選取料水比1∶8、1∶10、1∶12（g∶mL）進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.3 接種量對(duì)發(fā)酵枸杞汁乳酸含量和感官評(píng)分的影響

圖3 接種量對(duì)發(fā)酵枸杞汁乳酸含量和感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of inoculum on lactic acid content and sensory score of fermented Lycium barbarum juice

由圖3可知，發(fā)酵枸杞汁乳酸含量隨接種量的增加而增加，在接種量達(dá)到6%時(shí)，乳酸含量為432 mg/100 mL；在接種量達(dá)到7%時(shí)，乳酸含量為最大值485 mg/100 mL。在接種量為6%～7%時(shí)，乳酸含量上升幅度較小，可能是由于負(fù)責(zé)產(chǎn)生乳酸的菌體由于發(fā)酵后期發(fā)酵枸杞汁中可發(fā)酵性糖的缺乏，不能維持菌體生長(zhǎng)，在競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)，逐漸喪失優(yōu)勢(shì)菌種地位。

隨著接種量的增加，發(fā)酵枸杞汁的感官評(píng)分先升高后降低，接種量為5%時(shí)，感官評(píng)分最高達(dá)88分。綜合考慮，選取接種量4%、5%、6%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵枸杞汁乳酸含量和感官評(píng)分的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵枸杞汁乳酸含量和感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on lactic acid content and sensory score of fermented Lycium barbarum juice

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵枸杞汁乳酸含量呈逐漸增加趨勢(shì)，在發(fā)酵時(shí)間6～8 h時(shí)，乳酸含量增幅最大，為150 mg/100 mL?？赡苡捎谠诖藭r(shí)間段內(nèi)，菌體加速生長(zhǎng)繁殖進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，發(fā)酵枸杞汁中可發(fā)酵性糖的消耗速率大大增加，乳酸含量大幅上升。8 h后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體生長(zhǎng)代謝速度放緩，乳酸含量增幅不顯著。發(fā)酵10 h時(shí)，發(fā)酵枸杞汁乳酸含量最大，為485 mg/100 mL。

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵枸杞汁感官評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)。在發(fā)酵進(jìn)行到8 h時(shí)，發(fā)酵枸杞汁感官評(píng)分最高，達(dá)89分。綜合考慮，選取發(fā)酵時(shí)間6 h、8 h、10 h進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

枸杞汁發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表3，根據(jù)表3進(jìn)行多元回歸擬合，得到響應(yīng)面回歸模擬方程為：Y=94.60-6.38A+5.13B-5.75C+4.25AB-1.00AC+2.50BC-7.68A2-6.17B2-14.43C2

表3 枸杞汁發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken design for fermented Lycium barbarum juice fermentation conditions optimization

表4 以感官評(píng)分為響應(yīng)值的回歸模型及方差分析Table 4 Regression model and variance analysis with sensory score as response value

由表4可知，該模型P＜0.01，說明該模型極顯著；失擬誤差P＞0.05，說明沒有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象。校正決定系數(shù)R2adj為0.972 7，表明有約97.27%的感官評(píng)分由此模型進(jìn)行解釋；方程的決定系數(shù)R2為0.988 0，說明擬合度良好，方程的顯著性及可靠性極高。各項(xiàng)方差分析表明，一次項(xiàng)A、B、C，交互項(xiàng)AB，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)感官評(píng)分有極顯著影響（P＜0.05）；交互項(xiàng)BC對(duì)感官評(píng)分有顯著影響（P＜0.05）；交互項(xiàng)AC對(duì)感官評(píng)分影響不顯著。模型的F值可以反映各因素對(duì)試驗(yàn)響應(yīng)值的重要性，F(xiàn)值越大，表明對(duì)試驗(yàn)響應(yīng)值的影響越大，重要性越大[27]。根據(jù)F值大小可知，各因素對(duì)乳酸含量影響的主次因素為A＞C＞B，即料水比＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量。

等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示2個(gè)因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[28-29]。由圖5可知，AB、BC交互作用存在最大值，交互作用顯著（P＜0.05），AC交互作用不顯著（P＞0.05）。

圖5 料水比、接種量、發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)發(fā)酵枸杞汁感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction of solid-liquid ratio,inoculum and fermentation time on sensory evaluation of fermented mash

復(fù)合益生菌發(fā)酵枸杞汁的最佳工藝為料水比1∶9.35（g∶mL），接種量5.26%，發(fā)酵時(shí)間7.67 h，在此條件下，復(fù)合益生菌發(fā)酵枸杞汁感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為97.172 3分?？紤]試驗(yàn)可操作性，修正最佳工藝條件為：料水比1∶9（g∶mL），接種量5%，發(fā)酵時(shí)間8 h。在此條件下，復(fù)合益生菌發(fā)酵枸杞汁的感官評(píng)分達(dá)到96分，與預(yù)測(cè)值接近。說明模型擬合性良好，驗(yàn)證了模型的有效性。

2.3 發(fā)酵枸杞汁品質(zhì)分析

制得的發(fā)酵枸杞汁的最終pH 4.32，乳酸含量432 mg/100 mL，活菌數(shù)為2.3×108CFU/mL，總糖含量為155 mg/100 mL，總黃酮含量0.25 mg/100 mL，蛋白質(zhì)含量0.2 g/100 mL。

3 結(jié)論

以寧夏枸杞干果為原料，利用多種乳酸菌對(duì)枸杞汁進(jìn)行混合發(fā)酵，得出最優(yōu)發(fā)酵條件為復(fù)合益生菌配比植物乳桿菌∶腸膜明串珠菌∶嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=3∶3∶2∶1（V/V），料水比1∶9（g∶mL），接種量5%，發(fā)酵時(shí)間8 h。在此優(yōu)化工藝條件下制得的發(fā)酵枸杞汁的最終pH 4.32，乳酸含量432 mg/100 mL，活菌數(shù)為2.3×108CFU/mL，總糖含量為155 mg/100 mL，總黃酮含量0.25 mg/100 mL，蛋白質(zhì)含量0.2 g/100 mL。該飲料為橘紅色，色澤明亮，酸甜平衡，具有枸杞的特征滋味，感官評(píng)分達(dá)到96分。