宋 貝，楊勁松 *，湯 凱，譚海生，仵云學(xué)

（1.海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 海口 570228；2.海南大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228；3.海南金芝麟保健食品有限公司，海南 ?？?570228）

木薯（Manihot esculentaCrantz）屬于熱帶和亞熱帶根莖作物，是全球第六大糧食作物[1-2]。華南9號(hào)木薯塊根富含淀粉、維生素、膳食纖維和鉀、鈣、磷等礦物質(zhì)元素，營(yíng)養(yǎng)豐富且口感清甜，是一種對(duì)人體健康有益的優(yōu)質(zhì)雜糧[3-5]。

針葉櫻桃（Malpighia glabra）原產(chǎn)于熱帶美洲，在我國(guó)于20世紀(jì)50年代引種栽培成功[6]。針葉櫻桃果實(shí)中含有多種維生素、糖類、果酸、礦物質(zhì)元素以及特有的抗衰老因子，其鮮果中維生素C（vitamin C，VC）含量為1 215～3 024 mg/100 g[7]，因此被譽(yù)為“天然維C果王”[8]。維生素C是維持人體生命活動(dòng)不可欠缺的重要成分，可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力，對(duì)預(yù)防壞血病以及抗腫瘤有一定功效[9]。新鮮的針葉櫻桃水分含量高，儲(chǔ)藏不穩(wěn)定，易腐敗，從而造成經(jīng)濟(jì)損失。因此，針葉櫻桃的深加工是一種減少損失及提高其附加值的有效方式。

目前，木薯已被加工成木薯汁[1]、木薯糕、木薯酥性餅干[9]等食物，但產(chǎn)品較為單一且加工新技術(shù)尚未完善，從而致使木薯產(chǎn)值受到制約。目前碳酸飲料、果汁飲料、乳制品飲料占據(jù)國(guó)內(nèi)飲料市場(chǎng)，而糧食飲料相對(duì)較少[10]，尤其是以谷物和水果為基礎(chǔ)的復(fù)合型飲料產(chǎn)品。因此，開(kāi)發(fā)木薯針葉櫻桃飲料不僅可以促進(jìn)木薯產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，拓寬糧食飲料的市場(chǎng)，還能滿足人們對(duì)健康飲食的需求。本研究以木薯和針葉櫻桃為主要原料，對(duì)其飲料的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化及對(duì)發(fā)酵飲料的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為開(kāi)發(fā)功能性復(fù)合益生飲料提供理論依據(jù)，對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)木薯與針葉櫻桃的價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

華南9號(hào)木薯：中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所基地；針葉櫻桃：海南省定安縣；植物乳桿菌（Lac-tobacillus plantarum）HCN7、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）YLC92：海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室；耐高溫α-淀粉酶（2 000 U/g）、MRS培養(yǎng)基、葡萄糖、果糖和乳酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-30F中試?yán)鋬龈稍锵到y(tǒng)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；JYL-Y11高速破壁打漿機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；YM50FGN全自動(dòng)高滅菌鍋：上海瀘譽(yù)貿(mào)易公司；Agilent 1200高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；BCD-201D容聲冰箱：海信容聲冰箱有限公司；SW-CJ-17-D型超凈工作臺(tái)：蘇州佳寶凈化工作設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

從-80 ℃超低溫冰箱中分別取出含有凍存菌株（植物乳桿菌HNC7和副干酪乳桿菌YLC92）的凍存管，置于室溫條件下溶解，在無(wú)菌條件下吸取原菌液100 mL接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，傳代2次，活化后的菌液經(jīng)離心（4 000×g，4 ℃）后重懸于無(wú)菌蒸餾水，得到菌懸液。將菌懸液按1∶1混合，制得的菌懸液備用。

1.3.2 木薯針葉櫻桃飲料的工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

木薯去皮后切成小塊（2 cm×2 cm×2 cm），于-20 ℃冰箱中冷凍。冷凍的木薯塊取出于室溫條件下解凍，按料液比1∶6（g∶mL）加水打漿，加入耐高溫α-淀粉酶進(jìn)行酶解，酶解后煮沸10 min滅酶，后迅速冷卻至室溫后用紗布（80目）過(guò)濾木薯勻漿，再用循環(huán)水式真空泵（功率60 W，真空度0.089 MPa，抽速10 L/min）抽濾得到木薯汁[11]。

新鮮的針葉櫻桃經(jīng)挑選、洗凈、除核后，進(jìn)行真空冷凍干燥[12]并將其打粉，果粉置于4 ℃冰箱備用。按果粉與水1∶8（g∶mL）的料液比混合后抽濾得到針葉櫻桃汁。

考點(diǎn)“古希臘和古羅馬”由三大知識(shí)點(diǎn)構(gòu)成：一是古希臘的民主制度，二是古希臘的人文精神，三是古羅馬的法律。在備課中，教師應(yīng)當(dāng)充分挖掘課外信息，可以通過(guò)學(xué)術(shù)期刊、網(wǎng)絡(luò)、書(shū)籍等多種方式搜集資料，補(bǔ)充相關(guān)知識(shí)。

木薯汁與針葉櫻桃汁以4∶1（V/V）進(jìn)行調(diào)配，經(jīng)滅菌（85 ℃水浴保溫5 min）、冷卻至37 ℃后，接入菌液進(jìn)行發(fā)酵，所得飲料110 ℃殺菌15 s后迅速冷卻[6]，得到產(chǎn)品。

1.3.3 木薯漿酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

表1 木薯漿酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for cassava pulp enzymolysis conditions optimization

依據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果[13]，以酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）為3個(gè)因素，原料利用率[3]為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)以確定最佳木薯漿酶解條件，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

1.3.4 木薯針葉櫻桃飲料發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

分別考察發(fā)酵劑接種量（1%、2%、3%、4%、5%），發(fā)酵溫度（33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃），發(fā)酵時(shí)間（6 h、12 h、18 h、24 h、30 h）對(duì)木薯針葉櫻桃飲料感官評(píng)分的影響。

1.3.5 木薯針葉櫻桃飲料發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在發(fā)酵單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以發(fā)酵劑接種量（D）、發(fā)酵溫度（E）、發(fā)酵時(shí)間（F）為試驗(yàn)因素，感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值。根據(jù)Box-Behnken中心組合原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)以確定木薯針葉櫻桃飲料的最佳發(fā)酵工藝，其因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 木薯針葉櫻桃飲料發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for cassava-acerola cherry juice fermentation conditions optimization

感官評(píng)價(jià)：由10名食品科學(xué)與工程學(xué)院老師及同學(xué)組成評(píng)鑒小組，參考GB/T 31121—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)果蔬汁類及其飲料》[14]，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行單項(xiàng)與綜合評(píng)分，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3。

表3 木薯針葉櫻桃飲料感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation standards of the cassava-acerola cherry beverage

1.3.7 理化指標(biāo)測(cè)定

可溶性固形物：用便攜式折光儀測(cè)定；pH：用酸度計(jì)測(cè)定；總酸：滴定酸法測(cè)定[15]；乳酸、葡萄糖和果糖：采用高效液相色譜法測(cè)定[16]；抗氧化性：按照參考文獻(xiàn)[17]的方法測(cè)定；菌落總數(shù)：采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定[18]；大腸桿菌：采用大腸菌群計(jì)數(shù)法測(cè)定[19]；維生素C：按照參考文獻(xiàn)[20]的方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯漿酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

由表4可知，各因素對(duì)木薯汁原料利用率的影響大小順序?yàn)槊附鉁囟龋久附鈺r(shí)間＞酶添加量。木薯漿最佳酶解條件為A3B2C2，即酶添加量為100 U/g、酶解溫度85 ℃、酶解時(shí)間2 h，在此條件下，木薯汁的原料利用率最高達(dá)84.63%。

表4 木薯漿酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for cassava pulp enzymolysis condition optimization

2.2 飲料發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵劑接種量對(duì)木薯針葉櫻桃飲料感官品質(zhì)的影響

圖1 發(fā)酵劑接種量對(duì)木薯針葉櫻桃飲料感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of starter inoculum on sensory quality of the cassava-acerola cherry beverage

由圖1可知，隨著接種量的增加，木薯針葉櫻桃飲料的感官評(píng)分及乳酸含量均呈先升高后降低的趨勢(shì)。接種量為3%時(shí)，感官評(píng)分最高為96分，乳酸含量最高為4.6 g/L。當(dāng)接種量＞3%后，乳酸含量隨之降低導(dǎo)致飲料的乳酸風(fēng)味不足，感官評(píng)分降低。因此，選擇木薯針葉櫻桃飲料的最佳接種量為3%。

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)木薯針葉櫻桃飲料感官品質(zhì)的影響

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)木薯針葉櫻桃飲料感官品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on sensory quality of the cassava-acerola cherry beverage

由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，木薯針葉櫻桃飲料的感官評(píng)分及乳酸含量均呈先升高后降低的趨勢(shì)。發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，感官評(píng)分最高為91分，乳酸含量最高為4.47 g/L。發(fā)酵溫度高于或者低于37 ℃時(shí)，感官評(píng)分均較低。因此，選擇木薯針葉櫻桃飲料的最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)木薯針葉櫻桃飲料感官品質(zhì)的影響

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)木薯針葉櫻桃飲料感官品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of fermentation time on sensory quality of the cassava-acerola cherry beverage

由圖3可知，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，木薯針葉櫻桃飲料的感官評(píng)分呈先升高后降低的趨勢(shì)，乳酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高。發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，感官評(píng)分最高為94分，乳酸含量為5.38 g/L。發(fā)酵時(shí)間短會(huì)導(dǎo)致乳酸菌數(shù)少，從而不能完全發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為30 h時(shí)，感官評(píng)分最高為84分，乳酸含量為5.60 g/L。與發(fā)酵24 h相比，飲料發(fā)酵30 h后，其感官評(píng)分下降較多而乳酸含量增加不明顯。因此，選擇木薯針葉櫻桃飲料的最佳發(fā)酵時(shí)間為24 h。

2.3 飲料發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

以發(fā)酵劑接種量（D）、發(fā)酵溫度（E）、發(fā)酵時(shí)間（F）為試驗(yàn)因素，感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表5，模型方差分析見(jiàn)表6。

表5 木薯針葉櫻桃飲料發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Design and results of response surface experiments for cassava juice enzymolysis conditions optimization

通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而得到木薯針葉櫻桃飲料感官評(píng)分（Y）的回歸方程：

Y=89.8+0.88D-0.37E-6.5F-DE-2.25DF+3.25EF-8.15D2-9.65E2-15.40F2

由表6可以看出，回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.128 0＞0.05），表明木薯針葉櫻桃飲料數(shù)據(jù)模型的選取具有合理性。模型的決定系數(shù)R2=0.979 8，校正決定系數(shù)R2adj=0.953 8，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=3.48%，表明試驗(yàn)?zāi)M較好，可以用該模型對(duì)木薯針葉櫻桃飲料的加工工藝參數(shù)進(jìn)行可靠的預(yù)測(cè)。由F值大小可以得出各因素對(duì)木薯針葉櫻桃飲料的感官品質(zhì)的影響大小順序?yàn)镕＞D＞E。一次項(xiàng)F及二次項(xiàng)D2、E2、F2的P值均小于0.01，表明其對(duì)飲料感官品質(zhì)的影響極顯著，交互項(xiàng)EF的P＞0.05，表明其對(duì)飲料感官品質(zhì)的影響顯著。綜上所述，該模型能較好地反映接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間與飲料感官品質(zhì)之間的關(guān)系。

圖4 發(fā)酵劑接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)木薯針葉櫻桃飲料感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between starter inoculum,fermentation temperature and time on sensory scores of cassava-acerola cherry beverage

發(fā)酵劑接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的交互作用響應(yīng)面及等高線圖見(jiàn)圖4。響應(yīng)面圖和等高線圖能較為直觀的反映兩兩因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，響應(yīng)面的坡度越陡表明因素間的交互作用越顯著[21]。由圖4可以看出，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的響應(yīng)面曲面較陡，這說(shuō)明二者的交互作用對(duì)飲料的感官評(píng)分的影響較大，而其余兩兩因素的交互作用影響較小，與方差分析結(jié)果較為一致。

通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)得到的飲料最佳加工工藝為：接種量3.089%、發(fā)酵溫度36.88 ℃、發(fā)酵時(shí)間22.65 h，飲料感官評(píng)分的預(yù)測(cè)值為90.578分?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將飲料的加工工藝條件調(diào)整為接種量3%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間23 h。在此優(yōu)化加工工藝條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到飲料感官評(píng)分的均值90.2分，與預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)采用的回歸模型具有實(shí)際指導(dǎo)意義。

2.4 木薯針葉櫻桃發(fā)酵飲料產(chǎn)品品質(zhì)分析

木薯針葉櫻桃發(fā)酵飲料的可溶性固形物含量為5.83%；pH為3.17；乳酸含量為5.38 g/100 mL；總酸含量為60.53 g/L；葡萄糖含量為1.30 g/L；果糖含量為0.06 g/L；抗氧化性為78.39%；維生素C含量為346.7 mg/100 mL；菌落總數(shù)＜100 CFU/mL；大腸桿菌總數(shù)＜3 MPN/100 mL，未檢測(cè)出致病菌，各項(xiàng)指標(biāo)均在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別采用正交試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)木薯酶解條件及飲料的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)發(fā)酵飲料的理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，木薯漿最佳酶解條件為耐高溫α-淀粉酶添加量100 U/g、酶解時(shí)間2 h、酶解溫度85 ℃；木薯針葉櫻桃飲料的最佳發(fā)酵條件為乳酸菌接種量3%，發(fā)酵時(shí)間23 h，發(fā)酵溫度37 ℃。根據(jù)最佳條件制得的發(fā)酵飲料的感官評(píng)分為90.2分，具有針葉櫻桃特有果香及一定的抗氧化活性，且富含維生素C。本研究得出的最佳發(fā)酵工藝具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，能促進(jìn)新型發(fā)酵木薯產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。木薯針葉櫻桃發(fā)酵飲料作為一種非乳制品功能飲料，尤其適用于具有乳糖不耐癥的人群。