許引虎，李 輝*，熊 濤，覃先武，陽慧慈，聶文強(qiáng)，張方方，李志軍

（安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443200）

全球變暖對(duì)葡萄的采收和品質(zhì)都有不同程度的影響，葡萄果實(shí)中的總糖增加，與此同時(shí)果糖的濃度也在增加[1]。高糖度的發(fā)酵條件下，在發(fā)酵的初期酵母會(huì)受到高糖造成的高滲透壓脅迫，另外在發(fā)酵的后期高濃度的酒精會(huì)對(duì)酵母有強(qiáng)烈的抑制作用[2-4]，尤其乙醇含量的增加對(duì)酵母對(duì)于果糖的利用的抑制作用要高于葡萄糖[5-6]，因此在發(fā)酵后期往往導(dǎo)致發(fā)酵不徹底，殘?zhí)沁^高尤其是果糖，而果糖的甜度是葡萄糖的兩倍對(duì)葡萄酒的口感及后期儲(chǔ)存帶來不利影響[7-8]。

酵母在酒精發(fā)酵過程中所需要的營養(yǎng)成分以氮源最為重要，葡萄汁中的氮源可分為有機(jī)氮和無機(jī)氮，有機(jī)氮主要包括氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)，無機(jī)氮主要是銨態(tài)氮和硝態(tài)氮，其中酵母能夠直接利用的氮源稱為可同化氮（yeast assimilable nitrogen，YAN），包括游離氨基酸（脯氨酸除外）、小分子多肽和銨態(tài)氮[9-11]。酵母可以直接吸收氨基酸用于蛋白質(zhì)合成，不需要通過自身代謝合成所需要的氨基酸[12]，氨基酸的添加可以增強(qiáng)合成葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的能力，代謝糖的能力更強(qiáng)。研究表明添加可同化氮刺激酵母對(duì)果糖的利用要高于對(duì)葡萄糖的利用。因此對(duì)于高糖度的葡萄原料在酒精發(fā)酵過程中通過合理補(bǔ)充氮源可以預(yù)防發(fā)酵不徹底[13]，避免果糖殘留過多。酵母細(xì)胞壁又叫酵母皮（yeast hull），占細(xì)胞干質(zhì)量的10%～25%，酵母細(xì)胞壁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有助于吸附酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的中鏈脂肪酸（如己酸、辛酸和癸酸）、農(nóng)藥殘留、赭曲霉素A等有害物質(zhì)[14-15]。另外酵母細(xì)胞壁中富含甾醇和不飽和脂肪酸等生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子有助于保持膜的流動(dòng)性，維持細(xì)胞膜的生物活性，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)乙醇的耐受性[16]。氧氣的存在是酵母合成麥角甾醇和不飽和脂肪酸所必須的，在酒精發(fā)酵的無氧條件下，酵母可以吸收發(fā)酵液中的不飽和脂肪酸和甾醇并結(jié)合到細(xì)胞膜中。此外酵母細(xì)胞壁在加入葡萄醪/葡萄汁后部分不溶的成分懸浮在發(fā)酵液中可以作為二氧化碳的成核中心，降低二氧化碳的溶解度，減輕二氧化碳對(duì)酵母的毒害[17]。

在寧夏和新疆葡萄產(chǎn)區(qū)經(jīng)常會(huì)遇到葡萄原料糖度過高發(fā)酵緩慢甚至停滯的問題，為了提高葡萄酒酵母在高糖度條件下的發(fā)酵性能使酒精發(fā)酵更為徹底，本研究在高糖度條件下通過在發(fā)酵過程中添加酵母源有機(jī)營養(yǎng)和酵母細(xì)胞壁進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)比了單一有機(jī)氮源和酵母細(xì)胞壁在不同添加時(shí)期的效果的差異，以及有機(jī)氮源與酵母細(xì)胞壁配合添加與單一添加的差異，以期為高糖度葡萄原料的酒精發(fā)酵提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄汁（寧夏紅寺堡產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄，總糖286.2 g/L，調(diào)整后總酸8.8 g/L，發(fā)酵液濁度332 NTU）：寧夏長(zhǎng)城天賦酒莊。

葡萄酒活性干酵母CEC01、酵母源有機(jī)氮源FN502、酵母細(xì)胞壁CW101：安琪酵母股份有限公司。

L-酒石酸（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、果糖（均為分析純）：美國Sigma公司；無水乙醇（色譜純），硫酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-系列生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；BSA2202S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；LKTC-B1-T恒溫水浴鍋：金壇市城東新瑞儀器廠；PHS-3C酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ZORBAX碳水化合物分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、HP1100高效液相色譜儀（具有示差折光檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器）：美國安捷倫公司；SHZ曲型循環(huán)水真空泉：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KQ100DB型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒精發(fā)酵

選擇晚采收的赤霞珠葡萄作為發(fā)酵原料，為減小葡萄原料不均勻帶來的誤差，本實(shí)驗(yàn)采用未澄清的葡萄汁進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。取260 mL發(fā)酵原料置于500 mL三角瓶中，然后接種酵母，酵母接種量250 mg/L，放入恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，溫度設(shè)為25 ℃。每隔24 h在同一時(shí)間點(diǎn)測(cè)定一次發(fā)酵處理樣的質(zhì)量，通過前后的質(zhì)量差代表CO2的生成量，并根據(jù)每天的CO2生成量繪制發(fā)酵曲線。根據(jù)CO2的生成量確定營養(yǎng)的添加時(shí)間，首先根據(jù)每個(gè)三角瓶中發(fā)酵液的體積及發(fā)酵液的糖濃度估算出總的CO2的生成量（約為41 g），然后根據(jù)CO2的生成量分別在發(fā)酵的初始階段、發(fā)酵的1/6、1/3、1/2、2/3（對(duì)應(yīng)的CO2的生成量分別為0、6.8 g、13.7 g、20.5 g、27.3 g）添加酵母源有機(jī)氮FN502或者酵母細(xì)胞壁CW101，添加量為200 mg/L，分別用FN0、FN1、FN2、FN3、FN4和CW0、CW1、CW2、CW3、CW4表示。另外設(shè)置了4種有機(jī)氮FN502和酵母細(xì)胞壁CW101的組合添加方案：（1）在發(fā)酵進(jìn)行1/3時(shí)同時(shí)添加FN502和CW101（各添加200 mg/L）；（2）在發(fā)酵進(jìn)行1/6時(shí)添加FN502，在發(fā)酵進(jìn)行1/2時(shí)添加CW101（各添加200 mg/L）；（3）在發(fā)酵進(jìn)行1/3時(shí)添加FN502，發(fā)酵進(jìn)行2/3時(shí)添加CW101（各添加200 mg/L）；（4）在發(fā)酵進(jìn)行1/2時(shí)同時(shí)添加FN502和CW101（各添加200 mg/L），分別用FC1、FC2、FC3、FC4表示。當(dāng)24 h間隔CO2的生成量＜1.0 g時(shí)，可以判定酒精發(fā)酵基本結(jié)束。每個(gè)處理樣設(shè)置2個(gè)重復(fù)。

1.3.2 酒樣常規(guī)理化指標(biāo)測(cè)定

酒精參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析法》[18]測(cè)定。

1.3.3 葡萄糖、果糖、總殘?zhí)呛康臏y(cè)定

發(fā)酵樣品的處理：將發(fā)酵樣品在取樣容器中混勻，取混勻后的適量樣品4 000 r/min離心10 min，精密稱取一定質(zhì)量離心后的上清液至容量瓶中，用純水定容并稀釋合適的倍數(shù)，使其濃度在曲線范圍內(nèi)，將稀釋后溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上機(jī)測(cè)試。

色譜條件：用0.005 mol/L H2SO4溶液作為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，柱溫65 ℃，平衡流動(dòng)相待儀器基線走平穩(wěn)后進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20 μL。

通過液相檢測(cè)出葡萄糖和果糖的含量，總殘?zhí)?葡萄糖+果糖。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 22.0軟件在0.05水平下進(jìn)行單因素方差分析和鄧肯氏多重比較，采用Origin Pro 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵曲線

圖1 不同發(fā)酵時(shí)期添加有機(jī)氮FN502的發(fā)酵曲線Fig.1 Fermentation curve of adding organic nitrogen FN502 in different fermentation periods

由圖1可知，與對(duì)照（未添加FN502或CW101）相比，當(dāng)有機(jī)氮FN502和酵母同時(shí)加入葡萄汁后，在最開始并沒有明顯的提高酒精發(fā)酵的速度，而在酒精發(fā)酵進(jìn)行1/6時(shí)添加有機(jī)氮FN502明顯提高了酒精發(fā)酵速度，在酒精發(fā)酵后期二者的發(fā)酵速度基本一致；在酒精發(fā)酵進(jìn)行1/3時(shí)添加有機(jī)氮FN502，酒精發(fā)酵速度得到迅速提升；在發(fā)酵進(jìn)行1/2時(shí)添加有機(jī)氮FN502，對(duì)酒精發(fā)酵速度的提升較為緩慢；而在酒精發(fā)酵進(jìn)行2/3時(shí)添加有機(jī)氮FN502，則對(duì)酒精發(fā)酵的速度沒有明顯的影響，葡萄酒酵母在指數(shù)生長(zhǎng)期之后由于代謝所產(chǎn)生的酒精及中鏈脂肪酸（如己酸、辛酸和癸酸）的抑制作用使酵母的細(xì)胞膜流動(dòng)性變差，同時(shí)細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性降低[19]，導(dǎo)致對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力下降[20]，因此需要在酵母活性生長(zhǎng)過程中提供給細(xì)胞營養(yǎng)及生存因子，在酒精發(fā)酵的中后期一旦生長(zhǎng)停止，即使補(bǔ)充營養(yǎng)和生存因子也不能達(dá)到理想的效果[21]。

發(fā)酵結(jié)束時(shí)，在酒精發(fā)酵進(jìn)行1/3時(shí)添加有機(jī)氮FN502的處理組最終產(chǎn)生的CO2總質(zhì)量顯著高于對(duì)照和其他處理組（P＜0.05），在酵母接種時(shí)同時(shí)添加有機(jī)氮FN502和在酒精發(fā)酵進(jìn)行1/6及1/2時(shí)添加有機(jī)氮FN502，三種處理之間最終產(chǎn)生的CO2總質(zhì)量沒有明顯差異（P＞0.05），但均顯著高于對(duì)照和在酒精發(fā)酵進(jìn)行2/3時(shí)添加有機(jī)氮FN502的處理組（P＜0.05）。而在酒精發(fā)酵進(jìn)行2/3時(shí)添加有機(jī)氮FN502則與對(duì)照沒有明顯差異（P＞0.05）。說明在發(fā)酵進(jìn)行1/3時(shí)添加有機(jī)氮FN502效果最好，此時(shí)正值酵母生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，酵母生長(zhǎng)繁殖活躍，酵母吸收營養(yǎng)的能力更強(qiáng)，同時(shí)也需要更多的營養(yǎng)來促進(jìn)細(xì)胞合成，在酒精發(fā)酵的中后期對(duì)酒精的耐受性和代謝糖的能力也相對(duì)更強(qiáng)。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)期添加酵母細(xì)胞壁CW101的發(fā)酵曲線Fig.2 Fermentation curve of adding yeast cell wall CW101 in different fermentation periods

由圖2可知，與對(duì)照相比，在酒精發(fā)酵的不同時(shí)期添加酵母細(xì)胞壁CW101對(duì)整個(gè)酒精發(fā)酵速度沒有顯著的影響，尤其酵母細(xì)胞壁CW101在酵母接種后立即添加，在發(fā)酵的起始階段還會(huì)對(duì)發(fā)酵速度產(chǎn)生一定的抑制作用，但在發(fā)酵3 d后發(fā)酵速度開始逐漸超過對(duì)照。在酒精發(fā)酵結(jié)束后，不同時(shí)期添加酵母細(xì)胞壁CW101的處理組最終產(chǎn)生的CO2總質(zhì)量與對(duì)照相比沒有明顯差異（P＞0.05）。對(duì)于過度澄清的葡萄汁，其中懸浮的顆粒同時(shí)被去除，濁度降低的同時(shí)，顆粒表面吸附的營養(yǎng)和生存因子也會(huì)被除去，因此會(huì)更容易出現(xiàn)發(fā)酵緩慢甚至發(fā)酵停滯，而酵母細(xì)胞壁的添加可以增加葡萄汁的濁度，NICOLINI G等[22]研究認(rèn)為葡萄汁的濁度在100 NTU上下是能夠保持果香又能夠防止發(fā)酵停滯的最佳折中濁度。另外酵母細(xì)胞壁含有豐富的甾醇和不飽和脂肪酸等生存因子，酵母在生長(zhǎng)繁殖過程中可以吸收這些生存因子以提高對(duì)酒精的耐受性，促進(jìn)糖的消耗，另外酵母細(xì)胞壁可以作為CO2的成核中心，細(xì)小的CO2聚集在細(xì)胞壁周圍形成更大的氣泡析出，從而降低CO2的溶解度，減輕CO2對(duì)酵母細(xì)胞的毒害。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)期組合添加有機(jī)氮FN502和酵母細(xì)胞壁CW101的發(fā)酵曲線Fig.3 Fermentation curve of adding organic nitrogen FN502 and yeast cell wall CW101 in different fermentation periods

由圖3可知，與對(duì)照相比，處理組FC-1可以明顯的快速提高酒精發(fā)酵速度（P＜0.05）；處理組FC-3與FC-1的作用效果相近，二者沒有明顯的差異（P＞0.05）。與對(duì)照相比，處理組FC-2對(duì)酵母的酒精發(fā)酵速度沒有明顯的提升（P＞0.05），而處理組FC-4與對(duì)照相比雖然對(duì)酒精發(fā)酵速度有明顯的提升（P＜0.05），但是與FC-2相比差異不明顯（P＞0.05）。在發(fā)酵結(jié)束后，F(xiàn)C-1和FC-3最終產(chǎn)生的CO2總質(zhì)量沒有顯著差異（P＞0.05），二者均顯著的高于對(duì)照和FC-2和FC-4（P＜0.05）；FC-4顯著高于對(duì)照（P＜0.05），但與FC-2相比差異不顯著（P＞0.05）；FC-2與對(duì)照相比沒有顯著的差異（P＞0.05）。以上結(jié)果說明FC-1和FC-3處理組對(duì)酵母酒精發(fā)酵的促進(jìn)作用最好。

2.2 發(fā)酵結(jié)束后酒精度與乙酸結(jié)果分析

由表1可知，單獨(dú)添加有機(jī)氮FN502時(shí)，在酒精發(fā)酵進(jìn)行1/3時(shí)添加有機(jī)氮FN502，酵母最終的發(fā)酵酒精度最高，最高為16.6%vol；單獨(dú)添加酵母細(xì)胞壁CW101時(shí)，處理組CW-3的最終酒精度最高，為16.4%vol；當(dāng)有機(jī)氮FN502和酵母細(xì)胞壁CW101組合使用時(shí)，F(xiàn)C-1和FC-3的最終酒精度最高，均為16.9%vol，均顯著的高于對(duì)照和其他添加方式（P＜0.05）。與對(duì)照相比，酵母有機(jī)氮FN502和酵母細(xì)胞壁CW101的添加均顯著降低了乙酸的產(chǎn)生（P＜0.05），其中有機(jī)氮FN502在酒精發(fā)酵進(jìn)行2/3之前效果最好，酵母細(xì)胞壁CW101在酒精發(fā)酵進(jìn)行1/2時(shí)效果最好。

表1 酒樣酒精度和乙酸含量檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of alcohol content and acetic acid contents of wine samples

2.3 發(fā)酵結(jié)束后葡萄糖和果糖結(jié)果分析

圖4 不同酒樣酒精發(fā)酵結(jié)束后葡萄糖、果糖含量和果糖/葡萄糖對(duì)比Fig.4 Comparison of glucose,fructose contents and fructose/glucose in different wine samples after alcoholic fermentation

由圖4可知，有機(jī)氮FN502單獨(dú)添加時(shí)，在酒精發(fā)酵進(jìn)行1/3時(shí)添加有機(jī)氮FN502，最終總殘?zhí)亲畹?，總殘?zhí)菫?.60 g/L；與對(duì)照相比，在酒精發(fā)酵的不同時(shí)期添加有機(jī)氮FN502均降低了最終的總殘?zhí)牵蛔罱K殘?zhí)且怨菫橹?，果糖的含量大概是葡萄糖含量?～24倍。酵母對(duì)于葡萄糖和果糖的代謝存在明顯的差異，雖然果糖與葡萄糖同時(shí)使用，但葡萄糖首先從發(fā)酵液中耗盡，這導(dǎo)致發(fā)酵過程中消耗的葡萄糖和果糖數(shù)量之間的差異[23-24]。FN-0、FN-1、FN-2和FN-3的果糖/葡萄糖的比值均比對(duì)照小4～5倍左右，由此可見有機(jī)氮FN502的添加促進(jìn)了果糖的消耗，這與左松等[25]的研究結(jié)果一致，而由于果糖和葡萄糖共用一套膜運(yùn)輸和酶催化體系，所以就導(dǎo)致葡萄糖的利用相對(duì)下降，因此FN-0、FN-1、FN-2和FN-3處理組發(fā)酵結(jié)束后葡萄糖的含量反而均高于對(duì)照。而在酒精發(fā)酵進(jìn)行2/3時(shí)添加有機(jī)氮FN502對(duì)果糖消耗的促進(jìn)作用則相對(duì)其他4種處理更小。酵母細(xì)胞壁CW101單獨(dú)添加時(shí)，5種添加方式對(duì)酵母果糖消耗的促進(jìn)作用均高于對(duì)照，但不如有機(jī)氮FN502。CW-1、CW-2和CW-3處理組對(duì)酵母對(duì)果糖消耗的促進(jìn)作用較小，而又限制了葡萄糖的消耗，所以最終總殘?zhí)窍鄬?duì)于CW-0和CW-4要高。有機(jī)氮FN502和酵母細(xì)胞壁CW101組合添加時(shí)，F(xiàn)C-1和FC-3處理組對(duì)果糖消耗的促進(jìn)作用最好，最終總殘?zhí)且沧畹?，總殘?zhí)欠謩e為1.50 g/L和1.58 g/L。

綜合對(duì)比有機(jī)氮FN502和酵母細(xì)胞壁CW101組合添加時(shí)FC-1和FC-3對(duì)于酵母對(duì)果糖的消耗促進(jìn)作用最好，總殘?zhí)且沧畹?。與對(duì)照相比，酵母源有機(jī)營養(yǎng)和酵母細(xì)胞壁的添加均降低了最終的總殘?zhí)恰?/p>

3 結(jié)論

通過酵母源有機(jī)營養(yǎng)和酵母細(xì)胞壁的添加，可以提高葡萄酒酵母在高糖度葡萄原料條件下的發(fā)酵速度和最終發(fā)酵酒度，降低乙酸的產(chǎn)量和最終總殘?zhí)呛?。酵母源有機(jī)氮FN502單獨(dú)添加時(shí)，在不同的添加時(shí)期對(duì)葡萄酒酵母的酒精發(fā)酵影響存在差異，其中在酒精發(fā)酵進(jìn)行1/3時(shí)添加對(duì)葡萄酒酵母的發(fā)酵速度促進(jìn)作用最強(qiáng)，并能促進(jìn)葡萄酒酵母對(duì)果糖的消耗，總殘?zhí)且沧畹汀＝湍讣?xì)胞壁CW101單獨(dú)添加時(shí)，在不同添加時(shí)期對(duì)葡萄酒酵母的發(fā)酵速度均沒有明顯的促進(jìn)作用，與對(duì)照相比，在酒精發(fā)酵進(jìn)行2/3之前添加均能降低殘總糖，但作用效果不如有機(jī)氮FN502。在酒精發(fā)酵進(jìn)行1/3時(shí)同時(shí)添加有機(jī)氮FN502和酵母細(xì)胞壁CW101（各200 mg/L），或在酒精發(fā)酵進(jìn)行1/3時(shí)添加有機(jī)氮FN502（200 mg/L），進(jìn)行2/3時(shí)添加酵母細(xì)胞壁CW101（200 mg/L），對(duì)葡萄酒酵母的酒精發(fā)酵速度及果糖消耗促進(jìn)作用均高于對(duì)照及二者分別單獨(dú)使用，最終酒精度均為16.9%vol，總殘?zhí)欠謩e為1.50 g/L和1.58 g/L。有機(jī)氮FN502和酵母細(xì)胞壁CW101的添加均可顯著（P＜0.05）降低乙酸的產(chǎn)量。