周藝萍，熊 智，李選文，韓 龍*

（1.西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 繼續(xù)教育學(xué)院，云南 昆明 650224）

新平酸腌菜是以當(dāng)?shù)胤Q為青菜的葉用芥菜（Brassica juncea）加鹽及各種調(diào)料經(jīng)多種微生物發(fā)酵而成，滋味酸爽、香氣濃郁，是我國云南極具地方特色的一種傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜[1-3]?？芍苯邮秤茫部勺鳛樗嵛墩{(diào)味品，風(fēng)味獨(dú)特，具有開胃、促食欲等功能[4-5]。目前，針對(duì)酸菜的主要研究集中在微生物的分離與鑒定、發(fā)酵過程中亞硝酸鹽的控制、發(fā)酵工藝的優(yōu)化以及酸菜中有機(jī)物動(dòng)態(tài)變化等方面，而生產(chǎn)實(shí)踐中，生產(chǎn)者會(huì)經(jīng)驗(yàn)性地添加食鹽以保證酸菜的順利發(fā)酵，但對(duì)鹽分如何影響其中的微生物相關(guān)研究報(bào)道則相對(duì)較少[6-8]。因此，科學(xué)闡明食鹽與酸菜發(fā)酵微生物的關(guān)系將有助于生產(chǎn)工藝標(biāo)準(zhǔn)化、控制產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性以及指導(dǎo)工藝改進(jìn)，也有助于更好地利用和發(fā)展酸菜菌種資源。研究酸菜中的微生物多樣性主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法。雖然傳統(tǒng)方法能對(duì)分離的菌種進(jìn)行鑒定并分析其多樣性，但步驟繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力，無法分離大部分不可培養(yǎng)的微生物且檢出率及靈敏度不高，還易受到環(huán)境因素的影響，無法全面分析酸菜中微生物群落多樣性[9-11]。非培養(yǎng)法不依賴培養(yǎng)過程，大大縮短了樣品的分析時(shí)間，而且還能顯示環(huán)境樣品中不可培養(yǎng)的微生物的遺傳信息，有助于快速、準(zhǔn)確地對(duì)復(fù)雜微生物區(qū)系菌群結(jié)構(gòu)演替和多樣性進(jìn)行分析[12-13]。近年來，高通量測(cè)序以其速率快、準(zhǔn)確定量、實(shí)時(shí)檢測(cè)等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用到環(huán)境樣本的微生物多樣性分析中。

本實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)無鹽和有鹽（鹽度10%）腌制的新平酸腌菜在主發(fā)酵期理化指標(biāo)波動(dòng)較大的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品細(xì)菌多樣性進(jìn)行測(cè)序分析，研究鹽分對(duì)新平酸腌菜細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異的影響，同時(shí)對(duì)無鹽和有鹽（鹽度10%）腌制的新平酸腌菜理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，建立理化指標(biāo)與細(xì)菌群落之間的相關(guān)性，為今后酸菜制作工藝改進(jìn)提供一定理論參考，并為深入機(jī)理研究奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葉用芥菜：云南省玉溪市新平縣平甸鄉(xiāng)菜市場(chǎng)；食鹽及輔料等（均為食用級(jí)）：云南昆明盤龍區(qū)東華家樂福超市；發(fā)酵壇子（5 L，容量、形狀及材質(zhì)統(tǒng)一）：云南昆明華森試劑公司；食品中亞硝酸鹽含量測(cè)定試劑盒：蘇州科銘生物技術(shù)有限公司；樣品脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取，16S rRNA V3-V4區(qū)引物合成及測(cè)序建庫：委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25型雷磁pH計(jì)：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；UV-1000紫外可見分光光度計(jì)：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；YXQ-75G立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HH-2數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：金壇市丹瑞電器廠；universial 32R高速冷凍離心機(jī)：華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司；CP64C電子天平：上海志榮電子科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酸菜的制備

本實(shí)驗(yàn)的酸菜樣品均取于采用傳統(tǒng)方法自制的新平酸腌菜。發(fā)酵方法如下：挑選結(jié)實(shí)飽滿，無腐爛及病蟲害的葉用芥菜，將其在通風(fēng)且陽光充足的室外晾曬2 d后，去除老黃葉片并清洗干凈，將其切碎，加輔料，之后按無鹽、有鹽（鹽度10%）分別處理，反復(fù)揉搓，按同等體積比（1∶3）放入5 L的玻璃壇子，每個(gè)鹽濃度32罐，置于室內(nèi)密封常溫發(fā)酵30 d。從第1天開始取樣，之后每隔2 d取樣，進(jìn)行pH、總酸、亞硝酸鹽（nitrite，NIT）含量跟蹤檢測(cè)[14-15]。通過理化指標(biāo)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，加之考慮亞硝酸鹽含量影響酸菜的食用安全性，從兩個(gè)鹽濃度腌制的酸菜系列樣品中，于pH值持續(xù)降低，總酸含量持續(xù)快速升高的主發(fā)酵期，分別選取亞硝酸鹽含量上升、頂峰、明顯降低三個(gè)時(shí)間拐點(diǎn)的樣品，進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析。

1.3.2 發(fā)酵酸菜的指標(biāo)測(cè)定

發(fā)酵酸菜罐的多方位置混合取樣25 g，加250 mL無菌蒸餾水混勻，用研缽研磨成勻漿四層紗布過濾，分別對(duì)濾液進(jìn)行測(cè)定[16-18]：采用pH計(jì)測(cè)定對(duì)應(yīng)樣品的pH值；參考GB/T 12456—2016《食品中總酸的測(cè)定》對(duì)酸菜樣品的總酸進(jìn)行測(cè)定；亞硝酸鹽含量測(cè)定參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測(cè)定》中的鹽酸萘乙二胺法，采用食品中亞硝酸鹽含量測(cè)試盒測(cè)定，其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.234x+0.000 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。

1.3.3 細(xì)菌總DNA提取及多樣性分析

選取對(duì)應(yīng)指標(biāo)變化明顯的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的無鹽和有鹽（鹽度10%）酸菜樣品各25 g，于250 mL裝有7～8 mm的玻璃珠的無菌水中搖床（180 r/min）振蕩1 h，用滅菌后的紗布進(jìn)行過濾處理，除去其中所含雜質(zhì)，放入高速冷凍離心機(jī)之后4 ℃、10 000×g條件下離心5 min收集菌體沉淀，無鹽腌制的酸菜樣品編號(hào)為SCL1、SCL2、SCL3（SCL1對(duì)應(yīng)亞硝酸鹽含量上升時(shí)間點(diǎn)，SCL2對(duì)應(yīng)亞硝酸鹽含量高峰點(diǎn)，SCL3對(duì)應(yīng)亞硝酸鹽含量明顯降低時(shí)間點(diǎn)）；有鹽（鹽度10%）腌制的酸菜樣品編號(hào)為SCG1、SCG2、SCG3（SCG1對(duì)應(yīng)亞硝酸鹽含量上升時(shí)間點(diǎn)，SCG2對(duì)應(yīng)亞硝酸鹽含量高峰點(diǎn)，SCG3對(duì)應(yīng)亞硝酸鹽含量明顯降低時(shí)間點(diǎn)），冷藏保存。采用16SrRNA基因的V3-V4區(qū)[19-21]引物對(duì)338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'），806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行樣品DNA提取及Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，并使用Novomagic V2.0云平臺(tái)進(jìn)行多樣性分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

理化指標(biāo)數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3 次，使用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±SD）表示。利用Cutadapt軟件對(duì)高通量初始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理[22]；然后用Usearch軟件和Uchime軟件進(jìn)行序列的質(zhì)量篩選和優(yōu)化[23]，得到最終的原始數(shù)據(jù)；利用Uparse軟件對(duì)所有樣品的有效序列以97%的一致性進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類[24]；用Mothur結(jié)合SILVA的SSUr-RNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析[25-26]，獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成；使用Qiime軟件計(jì)算Shannon、Simpson、Chao1、Goods-coverage指數(shù)，以及計(jì)算Unifrac距離、構(gòu)建UPGMA樣本聚類樹；使用R軟件繪制稀釋曲線，進(jìn)行Alpha和Beta多樣性指數(shù)組間差異分析以及環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸菜基本理化指標(biāo)

如表1所示，無鹽和有鹽（鹽度10%）酸菜樣品理化指標(biāo)變化明顯的起始點(diǎn)和平緩點(diǎn)時(shí)間一致，高峰點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)間稍微不同。兩個(gè)鹽濃度處理的酸菜pH 值均介于5～6之間，有一定的變化趨勢(shì)，無鹽腌制的酸菜pH 值較有鹽腌制的降低得更快，而有鹽腌制的酸菜pH值起始就比無鹽的低；而無鹽腌制的酸菜總酸含量相對(duì)于有鹽腌制增加得更快；酸腌菜屬于發(fā)酵蔬菜制品，其亞硝酸鹽含量應(yīng)符合國標(biāo)限量（以NaNO2計(jì)）為20 mg/kg[17-18]，無鹽處理組的亞硝酸鹽含量高峰點(diǎn)（20.264 mg/kg）稍微超出國標(biāo)限量，而有鹽（鹽度10%）處理組整個(gè)發(fā)酵期間亞硝酸鹽含量均符合國標(biāo)限量?？偹崾撬岵怂嵛兜闹饕w現(xiàn)者，亞硝酸鹽含量多少影響著酸菜食用安全性，于pH值持續(xù)降低，總酸含量持續(xù)快速升高的主發(fā)酵期，分別選取亞硝酸鹽含量上升、頂峰、明顯降低三個(gè)時(shí)間拐點(diǎn)的樣品對(duì)后續(xù)分析其細(xì)菌多樣性具有重要意義。

表1 無鹽與有鹽腌制酸菜的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of salt-free and salt-treated pickle

2.2 細(xì)菌多樣性

2.2.1 樣本16S rRNA基因序列質(zhì)量評(píng)估

稀釋曲線可直接反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度[25-27]。如圖1所示，稀釋曲線在序列數(shù)達(dá)到30 000條左右后趨向平坦，再增加測(cè)序量對(duì)于發(fā)現(xiàn)新物種的邊際貢獻(xiàn)很小。說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，所含菌種數(shù)較多，現(xiàn)有測(cè)序量已經(jīng)可以反映樣品中細(xì)菌豐度信息。

圖1 酸菜樣品的細(xì)菌稀釋曲線圖Fig.1 Rarefaction curves for bacteria in pickle samples

2.2.2 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性用于分析樣品內(nèi)部微生物群落的物種豐富度[27]。對(duì)Illumina NovaSeq 測(cè)序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)（Raw PE）進(jìn)行拼接和質(zhì)控，得到Clean Tags，再進(jìn)行嵌合體過濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。對(duì)所有樣品的Effective Tags進(jìn)行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），基于OTU對(duì)6個(gè)酸菜樣品中細(xì)菌的Alpha多樣性進(jìn)行分析評(píng)估，其中Shannon指數(shù)反映樣本的各物種均勻度，指數(shù)越高，物種分布越均勻；Simpson指數(shù)反映物種的多樣性，指數(shù)越小，多樣性越高；Chao1指數(shù)常用來估計(jì)物種總數(shù)，反映物種豐富度。Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果見表2。

表2 酸菜樣品中細(xì)菌Alpha多樣性Table 2 Alpha diversity of bacteria in pickle samples

由表2可知，共獲得細(xì)菌群落3 界、22 門、36 綱、87目、166 科、339屬，902個(gè)OTU。通過高通量測(cè)序，從6個(gè)酸菜樣本中共獲得397 292條有效序列，其中SCL3獲得的OTU數(shù)最多，SCG3獲得的OTU數(shù)最少，而SCG1獲得的OTU數(shù)高于SCL1，SCL2和SCL3獲得的OTU數(shù)則相對(duì)高于SCG2和SCG3；無鹽腌制組的樣品發(fā)酵后期均勻度高，而有鹽腌制均勻度相對(duì)變化不大，且無鹽腌制組的均勻度高于有鹽腌制組；無鹽和有鹽（鹽度10%）腌制的樣品發(fā)酵前期物種多樣性均高于后期，且有鹽（鹽度10%）腌制組的物種多樣性均高于無鹽腌制組；無鹽腌制組的樣品發(fā)酵后期物種豐富度高，有鹽（鹽度10%）腌制組的樣品發(fā)酵前期物種豐富度高，且SCG1物種豐富度高于SCL1，SCL3物種豐富度最高，SCG3物種豐富度最低。說明鹽分的存在會(huì)抑制某些細(xì)菌，從而導(dǎo)致物種豐富度降低。所有樣品的覆蓋率（Coverage）指數(shù)均＞0.9，說明樣品文庫中序列的覆蓋率高，可反映樣品測(cè)序的真實(shí)情況。

2.2.3 Venn圖分析

Venn 圖分析可以展示多樣品（或分組）共有和各自特有OTU數(shù)目，直觀的表現(xiàn)環(huán)境樣本間（或分組）的組成相似性及重疊情況[27-28]，基于OTU的花瓣圖和Venn圖結(jié)果見圖2。由圖2a可知，6個(gè)酸菜樣品共產(chǎn)生了902個(gè)OTU，6個(gè)酸菜樣品共同擁有的OTU數(shù)達(dá)152個(gè)，約占各樣品OTU數(shù)量的28.82%～33.19%，說明各樣品間有較多相似物種，而各樣品又含獨(dú)有OTU，SCL3獨(dú)有OTU數(shù)量最多，達(dá)100個(gè)，SCG3最少，只有22個(gè)。由圖2b可知，無鹽處理的酸菜樣品與有鹽處理組共有的OTU數(shù)達(dá)487個(gè)，約占總數(shù)的54.00%，說明兩組酸菜樣品微生物群落組成結(jié)構(gòu)相似，而無鹽處理組獨(dú)有的OTU數(shù)262個(gè)，有鹽處理組獨(dú)有OTU數(shù)133個(gè)，說明加鹽壞境會(huì)造成獨(dú)特的微生物群落。

圖2 基于OTU的花瓣圖（a）和Venn圖（b）Fig.2 Petal graph (a) and Venn graph (b) based on OTU

2.2.4 酸菜樣品的優(yōu)勢(shì)菌群分析

如圖3a所示，酸菜樣品中細(xì)菌群落在門分類水平上具有較高的多樣性，其中平均相對(duì)豐度占比排名前10的依次為變形菌門（Proteobacteria，57.46%）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria，29.70%）、厚壁菌門（Firmicutes，10.27%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，1.56%）、放線細(xì)菌門（Actinobacteria，0.54%）、酸桿菌門（Acidobacteria，0.38%）、梭桿菌門（Fusobacteria，0.13%）、綠彎菌門（Chloroflexi，0.03%）、疣微菌門（Verrucomicrobia，0.02%）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae，0.01%）。本實(shí)驗(yàn)自定義相對(duì)豐度＞10%的為優(yōu)勢(shì)菌群。據(jù)此，變形菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度占各樣品比例為44.39%～79.05%，由低到高依次為SCG1、SCG2、SCL2、SCG3、SCL3、SCL1。說明在門水平下，兩個(gè)鹽濃度處理的酸菜樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相近，僅組成比例存在一定差異。

如圖3b所示，在屬水平下，6個(gè)酸菜樣品共檢測(cè)出339個(gè)細(xì)菌屬，相對(duì)豐度前10的物種分別是未分類的藍(lán)細(xì)菌屬（unidentified-Cyanobacteria，30.02%）、水桿菌屬（Aquabacterium，17.65%）、未分類的根瘤菌屬（unidentified-Rhizobiaceae，11.44%）、未分類的立克氏體屬（unidentified-Rickettsiales，2.41%）、明串珠菌屬（Leuconostoc，19.56%）、代爾夫特菌屬（Delftia，6.34%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，3.06%）、甲基桿菌屬（Methylobacterium，2.44%）、假紅育菌屬（Pseudorhod oferax，3.19%）、魏斯氏菌屬（Weissella，1.16%）。本實(shí)驗(yàn)定義相對(duì)豐度＞10%的為優(yōu)勢(shì)菌群。其中無鹽腌制組的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為未分類的藍(lán)細(xì)菌屬、明串珠菌屬、水桿菌屬、未分類的根瘤菌屬，分別占15.13%、16.17%、21.05%、14.26%；有鹽腌制組的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為未分類的藍(lán)細(xì)菌屬、水桿菌屬、明串珠菌屬，分別占46.20%、14.25%、11.62%。說明在屬水平下兩個(gè)鹽濃度腌制的酸菜樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成比例存在差異，鹽分的存在會(huì)抑制某些細(xì)菌屬。

圖3 酸菜樣品在門（a）和屬（b）分類水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)構(gòu)成Fig.3 Bacterial community structure at phylum (a) and genus (b) level in pickle samples

2.3 組間群落差異分析

2.3.1 UPGMA分析

為了研究不同樣本間的相似性，還可以通過對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樣本的聚類樹。在環(huán)境生物學(xué)中，非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）是一種較為常用的聚類分析方法[28-29]。由圖4a可知，在不同時(shí)考察物種有無及豐度時(shí)，有鹽處理組SCG1和SCG2細(xì)菌物種相似，SCG3細(xì)菌物種類型相似性相對(duì)發(fā)生了變化，說明有鹽（鹽度10%）腌制會(huì)影響發(fā)酵后期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；無鹽處理組的三個(gè)樣品細(xì)菌物種類型均在發(fā)生改變，說明無鹽處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化更明顯。由圖4b可知，在同時(shí)考察物種數(shù)量和豐度時(shí)，無鹽腌制組與有鹽（鹽度10%）腌制組的樣品能各自聚為一類，無鹽腌制組內(nèi)SCL2和SCL3聚為一類，有鹽（鹽度10%）腌制組內(nèi)SCG1和SCG2聚為一類，但樣品物種類型及豐度依然有差異。說明鹽分的存在會(huì)明顯影響細(xì)菌群落的差異，且在發(fā)酵后期會(huì)抑制某些細(xì)菌物種。

圖4 酸菜樣品非加權(quán)組（a）與加權(quán)組（b）的UPGMA聚類樹Fig.4 UPGMA cluster tree of unweighted group (a) and weighted group (b) in pickle samples

2.3.2 Anosim分析

Anosim分析[26]是一種非參數(shù)檢驗(yàn)，用來檢驗(yàn)組間的差異是否顯著大于組內(nèi)差異，從而判斷分組是否有意義?；贐ray-Curtis距離值的秩次進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，對(duì)Anosim的分析結(jié)果，基于兩兩樣本之間的距離值排序獲得的秩（組間的為between，組內(nèi)的為within），這樣任一兩兩組的比較可以獲得三個(gè)分類的數(shù)據(jù)，并進(jìn)行箱線圖的展示（若兩個(gè)箱的凹槽互不重疊，則表明它們的中位數(shù)有顯著差異），結(jié)果見圖5。

圖5 Anosim組間差異分析Fig.5 Difference analysis of Anosim group

結(jié)果表明，無鹽組和有鹽（鹽度10%）組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著（P＜0.05），且R值為0.852＞0，統(tǒng)計(jì)分析有意義。由圖5可知，無鹽腌制組與有鹽腌制組各自組內(nèi)和相互比較的箱圖有凹槽且互不重疊，說明鹽分的有無會(huì)影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致的差異顯著（P＜0.05）。

2.4 組間差異物種分析

2.4.1 物種豐度聚類熱圖分析

根據(jù)OTU的豐度數(shù)據(jù)，選取豐度排名前35的屬，從物種和樣本兩個(gè)層面進(jìn)行聚類，繪制成熱圖，并根據(jù)顏色梯度反映不同樣品中細(xì)菌群落相似性、差異性及物種聚類關(guān)系[26-27]。由圖6可知，每份樣品均含有相對(duì)于其他樣品含量更高的菌屬，且各個(gè)樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬各不相同。無鹽處理組中SCL3中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬最多，且三個(gè)樣品是隨時(shí)間的變化而變化；鹽度10%處理組中三個(gè)樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬數(shù)目相似，種類卻相對(duì)于無鹽處理組要少，說明加鹽處理會(huì)導(dǎo)致酸菜中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬產(chǎn)生明顯組成差異。

圖6 酸菜樣品屬水平物種豐度聚類熱圖Fig.6 Heat map of species richness of pickle samples at the genus level

2.4.2 組間差異物種檢驗(yàn)

LEfSe（linear discriminant analysis Effect Size）法適合物種豐度差異檢驗(yàn)，LDA值豐度柱狀圖可清楚展示不同組中豐度差異的物種，柱狀圖的長度代表差異物種的影響大小[22-23]。由圖7可知，有鹽（鹽度10%）腌制組的酸菜樣品中，硫堿螺旋菌屬（Thioalkalispira）、unidentified-Rickettsiales、unidentified-Cyanobacteria等菌群具有特異性；無鹽腌制組SCL樣品中，代爾夫特菌屬（Delftia）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）具有特異性。說明鹽分會(huì)造成菌群的相對(duì)豐度差異，導(dǎo)致差異的細(xì)菌物種可能更利于產(chǎn)品風(fēng)味。

圖7 有鹽與無鹽樣品細(xì)菌菌群LEfSe法比較分析Fig.7 Comparison and analysis of the bacterial flora of saline and non-saline samples by LEfSe method

2.5 樣品理化指標(biāo)與微生物菌群相關(guān)性分析

典型相關(guān)分析（canonical correlation analysis，CCA）主要反映菌群與理化指標(biāo)之間的關(guān)系，可以檢測(cè)樣品理化指標(biāo)與菌群之間的關(guān)系，可得到影響樣品群落分布的重要理化指標(biāo)[28-30]。在細(xì)菌屬水平下分析6個(gè)酸菜樣品與pH值、總酸值（total acid number，TAN）、亞硝酸鹽（NIT）的相關(guān)性，結(jié)果見圖8。

圖8 樣品與環(huán)境因子間典型相關(guān)分析散點(diǎn)圖Fig.8 Scatter plot of canonical correlation analysis between samples and environmental factors

由圖8可知，排序軸CCA1貢獻(xiàn)率80.02%，排序軸CCA2貢獻(xiàn)率為13.23%。箭頭連線的長度代表某個(gè)理化指標(biāo)與群落分布和種類分布之間相關(guān)程度的大小，箭頭越長，說明相關(guān)性越大，反之越小。由此可知，理化指標(biāo)與群落分布的相關(guān)性大小依次為TAN、NIT、pH值，理化指標(biāo)之間的夾角代表兩個(gè)理化指標(biāo)之間相關(guān)關(guān)系，pH與NIT、TAN與NIT之間的夾角為銳角，相互呈正相關(guān)關(guān)系，pH與TAN之間的夾角為鈍角，呈負(fù)相關(guān)。由表3可知，理化因子對(duì)物種分布影響顯著相關(guān)的為TAN（P＜0.05），說明三個(gè)理化因子均會(huì)影響酸菜菌群變化，且總酸值對(duì)細(xì)菌物種影響顯著。

表3 樣品與環(huán)境因子間典型相關(guān)分析結(jié)果Table 3 Results of canonical correlation analysis between samples and environmental factors

3 結(jié)論

以無鹽、有鹽（鹽度10%）兩個(gè)鹽濃度處理的6個(gè)對(duì)應(yīng)指標(biāo)變化關(guān)鍵點(diǎn)的新平酸腌菜為研究對(duì)象，通過Illumina NovaSeq測(cè)序分析酸菜樣品中細(xì)菌多樣性，結(jié)果表明，有鹽處理組的三個(gè)酸菜樣品較無鹽處理組均具有較高的細(xì)菌多樣性；在門水平下各酸菜樣品菌群結(jié)構(gòu)組成相似，變形菌門占主導(dǎo)地位；屬水平下各酸菜樣品中共有相對(duì)豐度較高的菌屬為未分類的藍(lán)細(xì)菌屬（unidentified-Cyanobacteria），水生桿菌屬（Aquabacterium），明串珠菌屬（Leuconostoc）；兩個(gè)鹽濃度腌制的酸菜樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬各有差異，例如有鹽腌制的酸菜樣品中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）等發(fā)酵相關(guān)菌屬更占優(yōu)勢(shì)；且有鹽腌制組的特異菌屬較無鹽腌制組多；理化指標(biāo)對(duì)菌群分布影響大小順序依次為總酸值＞亞硝酸鹽含量＞pH值。本研究系統(tǒng)解析無鹽、有鹽兩個(gè)鹽濃度腌制下新平酸腌菜中細(xì)菌結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)鹽分會(huì)造成細(xì)菌物種差異，后續(xù)發(fā)酵過程中鹽分的存在會(huì)引起某些特異細(xì)菌物種的繁盛從而導(dǎo)致其他一些細(xì)菌物種的消減，進(jìn)而影響酸菜的風(fēng)味口感與貯存時(shí)間。