周靜茹，吳飛，陳學(xué)秋，黃艷，時(shí)恒枝，杜愛芳，楊怡

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲拯救血紅素缺陷型酵母生長(zhǎng)表型

周靜茹，吳飛，陳學(xué)秋，黃艷，時(shí)恒枝，杜愛芳，楊怡

浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/浙江省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058

【】已有研究表明捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（）屬于血紅素應(yīng)答基因，高濃度血紅素的刺激可導(dǎo)致該基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，但其在血紅素調(diào)控中的功能尚缺乏研究。研究通過同源重組技術(shù)構(gòu)建血紅素合成缺陷型釀酒酵母（）敲除株，通過異源表達(dá)對(duì)該敲除株進(jìn)行表型拯救試驗(yàn)，以期驗(yàn)證參與細(xì)胞內(nèi)血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。以BY4741基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得（SGD:S000002640）基因序列5'和3'側(cè)翼區(qū)同源臂；同時(shí)以pYES2-CT質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得篩選標(biāo)記URA3序列；利用兩次重疊PCR技術(shù)依次將測(cè)序正確的上游同源臂、URA3、下游同源臂序列串聯(lián)成基因敲除組件，并通過醇沉法對(duì)敲除組件進(jìn)行純化。采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將純化的敲除組件轉(zhuǎn)化至BY4741感受態(tài)細(xì)胞中, 經(jīng)SD/- URA（含250 μmol·L-15-氨基乙酰丙酸（ALA））培養(yǎng)基篩選，并利用多對(duì)引物進(jìn)行PCR鑒定，以驗(yàn)證敲除株的正確性。同時(shí)以含有浙江株序列（GenBank：MK371241）及其功能域缺失序列和的質(zhì)粒為模板，利用特異性引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過無縫克隆將擴(kuò)增得到的目的片段插入酵母pESC-LEU表達(dá)載體，經(jīng)PCR鑒定以及測(cè)序驗(yàn)證后，采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，通過SD/- URA/- LEU（含250 μmol·L-1ALA）培養(yǎng)基篩選以及PCR鑒定驗(yàn)證陽性異源表達(dá)株的正確性。通過比較敲除株及其各異源表達(dá)株在含有或不含有250 μmol·L-1ALA的SD/- URA/- LEU液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證敲除株的表型同時(shí)排除表達(dá)載體對(duì)表型的影響。用2%半乳糖對(duì)含有陽性表達(dá)質(zhì)粒的敲除株進(jìn)行誘導(dǎo)，取部分菌液進(jìn)行超裂破碎，收集蛋白，通過Western Blot鑒定目的蛋白的表達(dá)；剩余菌體用去離子水重懸至OD600= 0.2，用去離子水進(jìn)行5倍比稀釋，取4 μl稀釋后的菌液點(diǎn)至含有250 μmol·L-1ALA或者不同濃度血紅素的誘導(dǎo)平板上，28℃培養(yǎng)2—3 d后比較敲除株的生長(zhǎng)情況。成功獲得基因敲除株，與野生株相比，不能合成血紅素，需外源添加ALA（250 μmol·L-1）或血紅素（≥ 10 μmol·L-1）才能生長(zhǎng)，且異源表達(dá)株和敲除株的表型一致。Western Blot結(jié)果表明2%半乳糖能誘導(dǎo)及其功能域缺失基因在敲除株中成功表達(dá)，且表達(dá)能夠在低血紅素濃度下（≤ 1 μmol·L-1）促進(jìn)酵母對(duì)血紅素的攝取，拯救敲除株的生長(zhǎng)缺陷，其硫氧還蛋白樣結(jié)構(gòu)域（GST-N）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶C末端結(jié)構(gòu)域（GST-C）的缺失會(huì)降低拯救的效果。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲血紅素應(yīng)答基因可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)血紅素的攝取，其GST-N和GST-C功能域在該過程中發(fā)揮著重要作用，研究成果為后續(xù)深入研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲；血紅素；；釀酒酵母；敲除株；異源表達(dá)；拯救

0 引言

【研究意義】捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（）是世界分布的具有重大經(jīng)濟(jì)意義的反芻動(dòng)物寄生性線蟲[1]，嚴(yán)重地區(qū)感染率可達(dá)100%[2]。該線蟲寄生宿主皺胃以吸食血液為生[3-4]，可引起宿主消化不良，貧血及貧血綜合征，嚴(yán)重影響宿主的健康[5-6]。目前捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的防控主要以藥物使用為主，隨著耐藥問題日益嚴(yán)重，迫切需要新型抗線蟲藥物緩解現(xiàn)狀[7-9]。血紅素作為多種蛋白質(zhì)的輔助因子，在能量代謝、氧氣運(yùn)輸和存儲(chǔ)、細(xì)胞色素依賴性的電子轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[10]。然而，包括捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在內(nèi)的絕大多數(shù)線蟲（營(yíng)自由生活和寄生）都缺乏完整的功能性血紅素生物合成途徑，需要攝取和利用源自于宿主的血紅素[11]。因此，合理調(diào)控血紅素的攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)寄生蟲的生存和繁殖至關(guān)重要，探明該機(jī)制可能為尋找藥物潛在靶標(biāo)提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】作為一種自由生活的血紅素缺陷型線蟲，秀麗隱桿線蟲（）是研究血紅素依賴性信號(hào)通路的最佳模式生物，在血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究上取得了很多進(jìn)展。通過轉(zhuǎn)錄組分析、RNAi篩選和表型分析，目前已經(jīng)鑒定了幾種介導(dǎo)腸細(xì)胞血紅素?cái)z取以及胞內(nèi)胞間血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)如Ce-HRG-1、HRG-2、HRG-3、HRG-4、MRP-5、HRG-7等[12]，為寄生性線蟲的相關(guān)研究奠定了重要基礎(chǔ)。介于生活史的復(fù)雜性和研究手段的局限性，寄生性線蟲血紅素?cái)z取和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究相對(duì)滯緩。目前研究明確了巴西日?qǐng)A線蟲（）和馬來絲蟲（）對(duì)宿主血紅素的攝取和利用，并且對(duì)馬來絲蟲中Ce-HRGs的同源物BmHRG-1、BmHRG-2和BmMRP-5進(jìn)行了功能探究[13-14]。同時(shí)已有研究通過高通量液相質(zhì)譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（High throughput LC-MS/MS）對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲排泄分泌蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，推測(cè)其體內(nèi)存在由天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶以及外肽酶構(gòu)成的蛋白酶水解級(jí)聯(lián)體系，該體系能參與血紅蛋白的降解[15]。血紅素作為血紅蛋白的重要組成部分，血紅蛋白的降解必然伴隨著血紅素的產(chǎn)生[16]。但是目前捻轉(zhuǎn)血矛線蟲血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的研究甚少。本研究團(tuán)隊(duì)前期對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中Ce-HRG-2的同源物Hc-HRG-2進(jìn)行了功能探究，結(jié)果表明Hc-HRG-2作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，能夠在體外與血紅素結(jié)合并抑制蛋白的GST酶活性[17]。在多細(xì)胞生物中對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行功能研究時(shí)往往會(huì)受到其旁系同源物的干擾，因此在血紅素合成缺陷型釀酒酵母（）基因敲除株中對(duì)寄生蟲血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證得到了廣泛運(yùn)用，目前已經(jīng)成功運(yùn)用于秀麗隱桿線蟲、利什曼原蟲（）、克魯氏錐蟲（）、曼氏血吸蟲（）等[18-21]。【本研究切入點(diǎn)】前期研究表明，屬于血紅素應(yīng)答基因，其蛋白具有血紅素結(jié)合特性。本研究擬通過構(gòu)建血紅素合成缺陷型釀酒酵母基因敲除株，驗(yàn)證捻轉(zhuǎn)血矛線蟲參與細(xì)胞內(nèi)血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)的生物學(xué)功能?！緮M解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建血紅素缺陷型釀酒酵母敲除株，異源表達(dá)進(jìn)行酵母生長(zhǎng)拯救試驗(yàn)，并探明其發(fā)揮作用的關(guān)鍵功能域，以期為進(jìn)一步研究參與調(diào)控捻轉(zhuǎn)血矛線蟲血紅素穩(wěn)態(tài)的相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019 年 4月至 2020 年 1月在浙江大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)研究所寄生蟲病理生物學(xué)研究室進(jìn)行。

1.1 菌株與質(zhì)粒

釀酒酵母菌株BY4741購自德國EUROSCARF，大腸桿菌（）菌株TOP10由浙江省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并保存；質(zhì)粒pYES2-CT（攜帶URA3篩選基因）和pESC-LEU （攜帶LEU篩選基因和GAL1啟動(dòng)子）購自淼靈質(zhì)粒平臺(tái)，質(zhì)粒 pMD19-T vector 購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試劑與試劑盒

LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、各種限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程（大連）有限公司。高保真性KOD-FX PCR酶購自東洋紡（上海）生物科技有限公司。NovoRec Plus PCR一步定向克隆試劑盒購自上海近岸科技有限公司。質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒均購自浙江易思得生物科技有限公司。

酵母YPD培養(yǎng)基、葡萄糖、瓊脂粉購自生工生物工程（上海）股份有限公司；篩選培養(yǎng)基SD/- URA和酵母轉(zhuǎn)化試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基（YNB）、Minimal SD Base Gal/Raf培養(yǎng)基以及缺陷型氨基酸DO Supplement -Leu/-Ura購自北京酷來博科技有限公司；酵母基因組提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

5-氨基乙酰丙酸（ALA）、血紅素和抗Flag標(biāo)簽鼠源單克隆抗體購自Sigma公司，DNA提取酚試劑購自索萊寶試劑平臺(tái)，苯甲基磺酰氟（PMSF）、二硫蘇糖醇（DTT）和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購自杭州弗德生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)釀酒酵母基因組數(shù)據(jù)庫（Saccharomyces genome database）中（SGD:S000002640）及其5' 和3' 側(cè)翼區(qū)序列設(shè)計(jì)敲除引物；根據(jù)圖1，設(shè)計(jì)鑒定酵母敲除株的引物。以pESC-LEU為載體，設(shè)計(jì)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的引物。所有引物的合成和測(cè)序均有浙江易思得生物科技有限公司完成，引物序列見表1。

A和B位于hem15'和3'側(cè)翼區(qū)（FR）的兩側(cè)；C、D、E、F位于ORF上；G、H、I、J位于篩選標(biāo)記URA3上

表1 本試驗(yàn)所用的引物序列

加粗：的部分序列；下劃線加粗：全序列；小寫字母：PESC-LEU載體的部分序列

Bold: partial sequence of; Underlined bold: full sequence of; Lowercase letters: partial sequences of the PESC-LEU vector

1.4 酵母hem1敲除組件的構(gòu)建

以BY4741基因組為模板，采用引物5' FR-F/R、3' FR-F /R（5' FR-R和3' FR-F含18 bp序列）分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的上下游同源臂序列。以質(zhì)粒pYES2-CT為模板，用引物URA3-F/R（上下游引物含方向相同的序列）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得篩選基因URA3序列。分別利用引物5' FR-F /URA3-R和5' FR-F / 3' FR-R，通過兩次重疊PCR技術(shù)依次將上游同源臂、URA3、下游同源臂序列串聯(lián)成基因敲除組件，總長(zhǎng)度為3 088 bp。普通PCR擴(kuò)增的條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。第一次重疊PCR擴(kuò)增的條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。第二次重疊PCR擴(kuò)增的條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收目的片段，連接至 pMD19-T載體，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入TOP10 感受態(tài)細(xì)胞中，菌液 PCR 鑒定陽性菌落，將陽性菌液送至浙江易思得生物科技有限公司測(cè)序分析。

以測(cè)序正確的pMD19-T-基因組敲除組件質(zhì)粒為模板，用高保真KOD-FX酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增（100 μL體系），PCR條件：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)。按照PCR產(chǎn)物﹕DNA提取酚試劑﹕氯仿 = 2﹕1﹕1的比例（體積比），劇烈混勻，12 000′離心10 min，取最上層上清。按照上述步驟重復(fù)一次。上清用1/10 體積的3 mol·L-1醋酸鉀（pH 5.5）溶液和2.5倍體積的無水乙醇在-20℃條件下沉淀1 h，12 000′離心10 min，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌一次，開蓋風(fēng)干，用20 μL去離子水溶解備用。

1.5 酵母hem1敲除株的篩選與鑒定

制備釀酒酵母BY4741感受態(tài)細(xì)胞，利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化1 μg敲除組件片段到50 μL BY4741感受態(tài)細(xì)胞中[22]。轉(zhuǎn)化后的菌液涂在含有250 μmol·L-1ALA的SD/-URA平板上，28℃培養(yǎng)2—3 d，將單菌落在含有250 μmol·L-1ALA的SD/-URA平板上劃線，28℃培養(yǎng)2—3 d，挑選單克隆接種含有250 μmol·L-1ALA的SD/-URA液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)2 d，收集菌體。利用基因組提取試劑盒提取菌體DNA基因組作為模板，用引物A-B、C-D、A-E、F-B、G-H、A-I、J-B進(jìn)行PCR驗(yàn)證，PCR條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 4 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析并將條帶回收送至浙江易思得生物科技有限公司測(cè)序。

1.6 酵母表達(dá)載體構(gòu)建和表達(dá)株的表型鑒定

以含有捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ZJ株基因序列（GenBank number: MK371241）及其功能域缺失序列和的質(zhì)粒為模板[17]，分別以-F/R為引物，用KOD-FX酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增；同樣地，以秀麗隱桿線蟲的cDNA為模板，用-F/R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得參與腸道血紅素?cái)z入的序列（WBGene00009493），上述PCR條件：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收目的片段。酵母表達(dá)載體pESC-LEU經(jīng)限制性內(nèi)切酶Not I單酶切后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收載體片段。目的片段和載體片段用無縫克隆試劑盒連接，轉(zhuǎn)入TOP10 感受態(tài)細(xì)胞中，菌液 PCR 鑒定陽性菌落，將陽性菌液送至浙江易思得生物科技有限公司測(cè)序分析。

用質(zhì)?；厥赵噭┖刑崛y(cè)序正確的陽性菌質(zhì)粒，制備酵母感受態(tài)，利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化1 μg質(zhì)粒到50 μL感受態(tài)細(xì)胞中, 轉(zhuǎn)化后的菌液涂在含有250 μmol L-1ALA的SD/-URA/-LEU平板上，28 ℃培養(yǎng)2—3 d，挑選單克隆直接用通用引物pESC-F/R進(jìn)行PCR鑒定。PCR條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，37個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，有目的帶的均為含有表達(dá)質(zhì)粒的陽性克隆。

將鑒定成功的轉(zhuǎn)化子用牙簽蘸取少許分別接種到3 mL含有或不含有250 μmol L-1ALA的SD/-URA/ -LEU液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)2 d，拍照記錄轉(zhuǎn)化子在兩種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。

1.7 斑點(diǎn)生長(zhǎng)試驗(yàn)

參照YUAN等的方法[23]，對(duì)該試驗(yàn)進(jìn)行了優(yōu)化，具體步驟如下：將含有表達(dá)質(zhì)粒的陽性克隆接種到5 mL含有250 μmol·L-1ALA的SD/-URA/-LEU液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)2 d，收集菌體，接種部分菌體到5 mL含有250 μmol·L-1ALA的SD(Gal/Raf)/-URA/-LEU液體培養(yǎng)基（不含葡萄糖）中，使得OD600= 0.4，30℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)酵母表達(dá)目的蛋白。收集菌液，用5 mL SD (Gal/Raf)/-URA/-LEU液體培養(yǎng)基（不含葡萄糖）重懸，30 ℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)18 h（耗盡酵母本身含有的血紅素）。菌體用去離子水重懸至OD600= 0.2，用去離子水進(jìn)行5倍比稀釋，取4 μL稀釋后的菌液點(diǎn)到含有250 μmol·L-1ALA或者不同濃度血紅素 (0、0.04、0.1、1、10 μmol·L-1) 的SD(Gal/Raf)/-URA/ -LEU固體平板上，28 ℃培養(yǎng)2—3 d后，拍照記錄酵母生長(zhǎng)狀況，根據(jù)斑點(diǎn)的數(shù)目比較生長(zhǎng)狀況，斑點(diǎn)數(shù)相差N個(gè)，則生長(zhǎng)倍數(shù)相差5N倍。

1.8 誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白的鑒定

斑點(diǎn)生長(zhǎng)試驗(yàn)多余的菌體用1 mL PBS緩沖液重懸，加入蛋白酶抑制劑PMSF（1 mmol·L-1）和二硫蘇糖醇DTT（1 mmol·L-1），用超裂儀超裂破碎，45%功率，工作2 s / 間隔1.5 s，4 ℃超裂40 min，12 000′離心10 min，收集溶解于PBS中的蛋白；沉淀用8 mol·L-1尿素溶解，12 000′離心10 min，收集溶解于尿素中的蛋白。將上述兩種蛋白混合后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印到NC膜上，以mouse anti-flag tag（1﹕1 000）為一抗，山羊抗鼠（1﹕5 000）為二抗，進(jìn)行Western Blot鑒定。

2 結(jié)果

2.1 酵母hem1敲除組件的構(gòu)建

以BY4741基因組為模板，用設(shè)計(jì)的引物分別進(jìn)行上下游同源臂序列的擴(kuò)增，PCR結(jié)果可見約1 kb的條帶（圖2）。以質(zhì)粒pYES2-CT為模板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行篩選基因URA3的擴(kuò)增，PCR結(jié)果可見約1 kb的條帶（圖2）。通過兩次重疊PCR技術(shù)依次將測(cè)序正確的上游同源臂、URA3、下游同源臂序列串聯(lián)成基因敲除組件，PCR結(jié)果可見約3 kb的條帶（圖2），回收目的片段，連接至 pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，陽性菌落送測(cè)序。以測(cè)序正確的pMD19-T-基因組敲除組件質(zhì)粒為模板，用高保真KOD-FX酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行醇沉，獲得高濃度的敲除組件片段。

M1：DL250 DNA marker; M2：DL10000 DNA marker; 1-3：依次為上游同源臂、URA3、下游同源臂的PCR產(chǎn)物；4：敲除組件的兩次重疊PCR的終產(chǎn)物

2.2 酵母hem1敲除株的篩選與鑒定

采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將敲除組件轉(zhuǎn)化至釀酒酵母BY4741中，其兩端與酵母基因組同源的序列進(jìn)行同源重組，最終以loxP-URA3-loxP取代基因組中的，使得轉(zhuǎn)化子能在SD/-URA平板上（含250 μmol·L-1ALA）存活，轉(zhuǎn)化結(jié)果見圖3。為避免假陽性，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖3 Δhem1敲除株的篩選

提取轉(zhuǎn)化子的基因組，用引物A-B、C-D、A-E、F-B、G-H、A-I、J-B進(jìn)行PCR驗(yàn)證。正確重組了敲除組件的轉(zhuǎn)化子用C-D、A-E、F-B 3對(duì)引物擴(kuò)增沒有條帶，而用G-H、A-I、J-B 3對(duì)引物擴(kuò)增目的帶大小分別為1 357、1 251和1 088 bp, 用引物A-B擴(kuò)增目的帶為3 495 bp。以野生株BY4741基因組為對(duì)照用引物C-D、A-E、F-B 3對(duì)引物擴(kuò)增目的帶大小分別為1 358、1 246和1 647 bp，而用G-H、A-I、J-B 3對(duì)引物擴(kuò)增沒有條帶，用引物A-B擴(kuò)增目的帶為4 054 bp。PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致，說明成功獲得了基因敲除株。

M1：DL10000 DNA marker; M2：DL250 DNA marker; 1-7：依次為以A-B、C-D、A-E、F-B、G-H、A-I、J-B為引物時(shí)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 Δhem1表達(dá)載體構(gòu)建與異源表達(dá)株的表型分析

已有研究表明，秀麗隱桿線蟲基因參與線蟲腸道血紅素的攝取，在低血紅素濃度下（＜1 μmol·L-1）可以拯救酵母缺失株的生長(zhǎng)[23-24]，因此本研究將作為酵母斑點(diǎn)生長(zhǎng)試驗(yàn)的陽性對(duì)照組。將成功連接到pESC-LEU的的陽性質(zhì)粒及空載轉(zhuǎn)化到敲除株中，挑選單克隆直接進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明（圖5），目的條帶符合預(yù)期大小，5種表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)化到敲除株內(nèi)。

為排除載體對(duì)酵母缺失株的影響，對(duì)轉(zhuǎn)化成功的異源表達(dá)株進(jìn)行表型驗(yàn)證，結(jié)果表明（圖6），和添加250 μmol·L-1ALA的培養(yǎng)基相比，在不添加ALA的培養(yǎng)基中，敲除株以及異源表達(dá)株的生長(zhǎng)受到明顯抑制，證明確實(shí)是血紅素合成缺陷株且單純轉(zhuǎn)化5種表達(dá)載體對(duì)缺失株的表型沒有拯救作用。

2.4 目的蛋白的鑒定與斑點(diǎn)生長(zhǎng)試驗(yàn)

預(yù)測(cè)各蛋白大小，Hc-HRG-2約為33.6 kD，Ce-HRG-4約為20.3 kD，Hc-HRG-2 (ΔGST-N) 約為25 kD，Hc-HRG-2 (ΔGST-C) 約為25.7 kD，利用Western Blot對(duì)含有陽性表達(dá)質(zhì)粒敲除株的目的蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明（圖7），除了空載組沒有目的帶，其余4種目的片段都在酵母中得到了表達(dá)，蛋白大小與預(yù)期一致。

將剩余菌液5倍比稀釋后點(diǎn)至含有250 μmol·L-1ALA或者不同濃度血紅素的平板上，生長(zhǎng)情況見圖8。在0.04 μmol·L-1血紅素濃度下，與空載組相比，表達(dá)Hc-HRG-2的酵母生長(zhǎng)提高了5倍，表達(dá)Ce-HGR-4的酵母生長(zhǎng)提高了25倍，表達(dá)功能域缺失蛋白的酵母的生長(zhǎng)沒有明顯提高。在0.1 μmol·L-1血紅素濃度下，與空載組相比，表達(dá)Hc-HRG-2的酵母的生長(zhǎng)提高了25倍，表達(dá)Ce-HGR-4的酵母生長(zhǎng)提高了625倍；表達(dá)Hc-HRG-2 (ΔGST-N) 的酵母生長(zhǎng)提高了25倍，但是生長(zhǎng)狀況與Hc-HRG-2組相比稍差一些；表達(dá)Hc-HRG-2 (ΔGST-C) 的酵母生長(zhǎng)僅提高了5倍。隨著血紅素濃度的增加，試驗(yàn)組和空載組之間的酵母生長(zhǎng)差異會(huì)逐漸減少。上述結(jié)果表明，表達(dá)能夠在低血紅素濃度下（≤1 μmol·L-1）促進(jìn)酵母對(duì)血紅素的攝取，拯救敲除株的生長(zhǎng)缺陷；的硫氧還蛋白樣結(jié)構(gòu)域（GST-N）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶C末端結(jié)構(gòu)域（GST-C）在敲除株的表型拯救中發(fā)揮重要作用, 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶C末端結(jié)構(gòu)域相對(duì)更重要一些。

M: DL250 DNA marker; 1: pESC-LEU-Ce-hrg-4; 2: pESC-LEU-Hc-hrg-2; 3: pESC-LEU-Hc-hrg-2(Δgst-n); 4: pESC-LEU-Hc-hrg-2 (Δgst-c); 5: pESC-LEU

圖6 Δhem1敲除株及其異源表達(dá)株的表型驗(yàn)證

3 討論

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲是一種以吸食宿主血液為生的寄生性線蟲，探明其對(duì)血液中血紅素的利用及調(diào)控機(jī)制可以為藥靶的篩找以及疫苗的開發(fā)提供新的思路。由于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲寄生階段的離體培養(yǎng)比較復(fù)雜[25]，借助結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單且研究技術(shù)成熟的真核模式生物進(jìn)行功能研究成為了普遍的技術(shù)手段[26-28]。

M：蛋白marker; *表示目的條帶

釀酒酵母編碼5-氨基乙酰丙酸合成酶是血紅素合成途徑中的第一個(gè)酶，在血紅素合成過程中發(fā)揮著重要作用[29]。因此缺失菌株需要在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加5-氨基乙酰丙酸或者血紅素（≥10 μmol·L-1）才能生長(zhǎng)[30]。根據(jù)上述特性，已有團(tuán)隊(duì)成功在血紅素缺陷型釀酒酵母中對(duì)血液寄生原蟲以及秀麗隱桿線蟲等進(jìn)行了建模，對(duì)血紅素應(yīng)答相關(guān)基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證[18, 20-21]，但是對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的建模尚未見報(bào)道。以釀酒酵母中缺失的同源物為前提，本研究首次成功在血紅素缺陷型釀酒酵母中對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲進(jìn)行建模，并初步探究了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的功能。

前期試驗(yàn)表明，是血紅素應(yīng)答基因，高濃度血紅素的刺激可導(dǎo)致該基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，其蛋白能夠在體外和血紅素結(jié)合并抑制蛋白的GST酶活性[17]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證是否參與血紅素的轉(zhuǎn)運(yùn)，本試驗(yàn)在真核模式生物釀酒酵母中進(jìn)行了相關(guān)功能的驗(yàn)證。以BY4741為模板，通過同源重組技術(shù)成功獲得敲除株。與野生株BY4741相比，只有在培養(yǎng)基中添加5-氨基乙酰丙酸時(shí)才能生長(zhǎng)，說明該敲除株的血紅素合成通路的確存在缺陷，可以用于建模。利用無縫克隆技術(shù)成功構(gòu)建及其功能域缺失序列的酵母表達(dá)載體，對(duì)轉(zhuǎn)化成功的異源表達(dá)株進(jìn)行表型驗(yàn)證，結(jié)果表明，和添加250 μmol·L-1ALA的培養(yǎng)基相比，在不添加ALA的培養(yǎng)基中，敲除株以及異源表達(dá)株的生長(zhǎng)受到明顯抑制。理論上，敲除株以及異源表達(dá)株在不添加ALA的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，由于在本試驗(yàn)中酵母是從含有ALA的培養(yǎng)基中直接挑選單克隆至不添加ALA的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，酵母內(nèi)源ALA可以維持酵母進(jìn)行有限的擴(kuò)增，所以結(jié)果中可以看到不添加ALA的培養(yǎng)基組酵母存在一定程度的生長(zhǎng)。Western Blot鑒定結(jié)果表明C端標(biāo)記有FLAG表位的Hc-HRG-2系列蛋白能夠在酵母敲除株內(nèi)被半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，且其分子量的大小與預(yù)測(cè)一致。在酵母斑點(diǎn)生長(zhǎng)試驗(yàn)中，在≤0.1μmol·L-1血紅素濃度下表達(dá)Ce-HRG-4對(duì)酵母生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用，與前人的研究結(jié)果相一致[23]，說明本試驗(yàn)條件下完全能夠?qū)崿F(xiàn)在血紅素缺陷型釀酒酵母中對(duì)秀麗隱桿線蟲的建模。以此為前提，在≤1μmol·L-1血紅素濃度下表達(dá)Hc-HRG-2對(duì)酵母的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，表明確實(shí)能拯救敲除株的生長(zhǎng)缺陷，促進(jìn)酵母細(xì)胞攝入外源血紅素，利用血紅素缺陷型釀酒酵母對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的建模確實(shí)可行。研究中還發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)關(guān)鍵功能域硫氧還蛋白樣結(jié)構(gòu)域和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶C末端結(jié)構(gòu)域在敲除株的表型拯救中都發(fā)揮重要作用, 且在≤1μmol·L-1血紅素濃度下可以觀察到谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶C末端結(jié)構(gòu)域的缺失會(huì)導(dǎo)致拯救程度降低，表明該功能域相對(duì)更關(guān)鍵。值得注意的是，在低血紅素濃度下對(duì)敲除株的拯救程度明顯弱于，該結(jié)果與CHEN等在敲除株中對(duì)秀麗隱桿線蟲Ce-HRG-2進(jìn)行建模時(shí)的結(jié)果類似[31]，表明促進(jìn)細(xì)胞對(duì)血紅素的攝取可能不是的主要功能。參考Ce-HRG-2能夠介導(dǎo)參與隔離和再分配胞內(nèi)血紅素的功能[31]，作為同源物的在血紅素調(diào)控中扮演的角色還需要進(jìn)一步探究。

圖8 Δhem1敲除株及其各異源表達(dá)株在不同血紅素濃度的平板上的生長(zhǎng)情況

4 結(jié)論

本試驗(yàn)首次成功在血紅素缺陷型釀酒酵母中對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲進(jìn)行建模，證明了血紅素應(yīng)答基因能促進(jìn)細(xì)胞對(duì)血紅素的利用，并且其兩個(gè)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶相關(guān)功能域發(fā)揮重要作用。

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ofRescues the Growth of Heme Deficient Yeast Strain

ZHOU JingRu, WU Fei, CHEN XueQiu, HUANG Yan, SHI HengZhi, DU AiFang, YANG Yi

College of Animal Science, Zhejiang University/Key Laboratory of Animal Preventive Medicine of Zhejiang Province, Hangzhou 310058

【】In previous study, we have identified a heme responsive gene(), with a high transcriptional level in the presence of high concentration of heme. However its function in heme regulation is still lacking research. To verify thatwas involved in the intracellular heme transport, agene knockout strain of, which was heme deficient, was constructed by homologous recombination technique and then exogenously expressedofto rescue the growth of the knockout strain. 【】The genomic DNA ofBY4741 was used as a template to obtain the upstream and downstream homology sequences of(SGD: S000002640) gene. The plasmid pYES2-CT was used to obtain the screening marker URA3 sequence. Two overlapping PCR techniques were used to sequentially connect upstream homology sequence, URA3, and downstream homology sequence to form the knockout components which was purified and then transformed into BY4741 competent cells by lithium acetate transformation method, and the transformants were selected on SD /-URA plates supplemented with 250 μmol·L-15-aminolevulinic acid (ALA). PCR identification using multiple primer pairs was further performed to verify the correctness ofstrain. Thesequence (GenBank: MK371241) of Zhejiang strain and its functional domain deleted sequenceandwere amplified from the plasmids and inserted into the yeast expression vector pESC-LEU through a seamless cloning kit. The expression vectors, which were identified and sequenced to be correct, were then transformed intocompetent cells and selected on SD/-URA/-LEU (containing 250 μmol·L-1ALA) plates. PCR identification was performed to verify the positive exogenous expression strain. By comparing the growth ofstrain and its exogenous expression strains in SD/-URA/-LEU liquid medium with or without 250 μmol·L-1ALA, the phenotype of the knockout strain were further verifiedand the effects of expression vectors on phenotype were excluded. The exogenous expression strains were induced by 2% w/v galactose and then sonicated to identify the protein expression by Western Blot. The induced strains were resuspended to an OD600of 0.2 and 4 μL of 5-fold serial dilutions of each induced strain was spotted onto 2% w/v galactose plates supplemented with either 250 μmol·L-1ALA or different concentrations of heme for 2 to 3 days at 28 ℃to compare the growth of the strains.【】Thegene knockout strain was successfully obtained. Compared with wild strain,cannot synthesis hemeand requires ALA (250 μmol·L-1) or heme (≥10 μmol·L-1) for growth. The phenotypes of the exogenous expression strains were consistent with that of the knockout strain. Western Blot results indicated that 2% w/v galactose could successfully induce the expression ofand its functional domain deleted gene in the knockout strain.expression allowedto import heme from the environment, and rescued the growth ofstrainNotably, the deletion of two signature domains of, a thioredoxinlike (GST-N) and a glutathione S-transferase C-terminal domain-like (GST-C), could reduce the effect of rescue. 【】could facilitate heme uptake in cellsand its functional domains, GST-N and GST-C, played an important role in this process. This study laid a solid foundation for further exploring heme transport mechanism of

; heme;;;strain; exogenously expression; rescue

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.08.018

2020-05-06；

2020-10-15

國家自然科學(xué)基金（31602041）、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0501200）、浙江省基礎(chǔ)公益研究計(jì)劃（LGN20C180005）

周靜茹，Tel：18868105390；E-mail：1134684756@qq.com。通信作者杜愛芳，E-mail：afdu@zju.edu.cn。通信作者楊怡，E-mail：yangyi0607 @zju.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）