金瑋鋆 張鳳杰 張曉蒙

摘要：釀酒葡萄種植、果實貯存保鮮和葡萄酒貯存時期均會發(fā)生不同程度的真菌性病害，影響葡萄酒釀造品質(zhì)，造成一定的生產(chǎn)損失。利用解淀粉芽孢桿菌B15對真菌的抑制作用，在一定條件下制備得到生物農(nóng)藥——解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑，并對其在葡萄種植病害防治、葡萄酒窖抑菌及葡萄防腐等方面分別進行初步應(yīng)用。藥劑施用結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑施用效果良好，對葡萄種植病害的平均防效在70%以上;在酒窖封閉空間的平均抑菌率為77.32%;在果蔬防腐應(yīng)用試驗中，100 mg/L處理組好果率達到83.3%，在果蔬保鮮劑應(yīng)用領(lǐng)域具有一定的開發(fā)價值。B15可濕性粉劑的初步應(yīng)用為我國釀酒葡萄在葡萄種植、果實保鮮和葡萄酒貯存整個流程中真菌病害的防治提供了有價值的應(yīng)用參考。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;B15可濕性粉劑;真菌病害防治;葡萄種植;酒窖抑菌;葡萄防腐

葡萄酒品質(zhì)的好壞極大程度上取決于所挑選的釀酒葡萄的品質(zhì)，而葡萄種植階段的病害侵擾會極大影響葡萄品質(zhì)，進而影響葡萄酒釀造品質(zhì)及口感，嚴重制約著行業(yè)發(fā)展。葡萄病害一般以真菌為主，常見病害主要有葡萄霜霉病、葡萄灰霉病等。早期防控葡萄病害一般以種植抗病品種、溫室栽培和化學防治為主[1]。與化學防治手段相比，生物農(nóng)藥（biological pesticide）具有很好的生物安全性和環(huán)境友好性，是目前全球農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新趨勢[2]。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillm amyloliquefaciens）對外界有害因子抵抗力強且易培養(yǎng)繁殖，近幾年被優(yōu)選為研發(fā)穩(wěn)定生物農(nóng)藥的菌種，是一種效果理想的生防菌株，市場上以可濕性粉劑和水劑最為常見[3-7]。相關(guān)文獻已證實，解淀粉芽孢桿菌對西瓜生長枯萎病、番茄枯萎病等田間果蔬真菌性病害具有一定的抑菌防治效果[8-11]，但鮮有提到對田間葡萄種植病害及葡萄酒貯存污染有抑制效果的相關(guān)研究。

基于實驗團隊前期的理論研究成果[12-14]，將篩選得到的具有有效抑制灰葡萄孢的解淀粉芽孢桿菌B15發(fā)酵液在一定條件下制備成可濕性粉劑，并在葡萄種植期間的病害防治、葡萄酒貯存期酒窖內(nèi)的抑菌情況和葡萄果實貯存期間的防腐保鮮等3個方面進行施藥應(yīng)用，并對施用效果進行評價，以期為我國釀酒葡萄的真菌性病害防治提供有價值的應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗主要材料有解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens） B15，保藏于國家酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心（ICAB）國家級重點實驗室。表面活性劑（分散劑2425，潤濕劑200），由北京格林泰姆科技有限公司提供。

1.2 試驗儀器

試驗儀器主要有LGJ-30FD真空冷凍干燥機（德國FRITSCH公司）、微型行星式球磨機PULVERISETTE6（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）、SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）、LDZX-50KBS立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、DHZ-B高溫全溫振蕩器（太倉市豪誠實驗儀器制造有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 生物抑菌劑的劑型合成 解淀粉芽孢桿菌B15發(fā)酵液經(jīng)真空冷凍干燥成固體粉末，按4%添加量與20%表面活性劑和76%膨潤土混合，用行星式球磨機充分粉碎混勻，制備得到解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑（圖1）。

1.3.2 生物抑菌劑的指標測定方法 解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑經(jīng)一定比例無菌水稀釋后，制備得到B15生物抑菌劑。

抑菌劑的孢子計數(shù)方法為稀釋一定倍數(shù)后，在1 000倍光學顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)。

可濕性粉劑pH值的測定參考GB/T 1601—93《農(nóng)藥pH值的測定方法》，細度的測定參考GB/T 16150—1995《農(nóng)藥粉劑、可濕性粉劑細度測定方法》，懸浮率測定方法參考GB/T 14825—2006《農(nóng)藥懸浮率測定方法》，熱穩(wěn)定性測定參考GB/T 19136—2003《農(nóng)藥熱貯穩(wěn)定性測定方法》。

1.3.3 葡萄田間抑菌應(yīng)用試驗方法 試驗于2019年7—8月，在北京市密云區(qū)某葡萄園區(qū)實施，試驗藥劑為B15生物抑菌劑，對照藥劑為常見防治葡萄霜霉病的生物農(nóng)藥嘧菌酯懸浮劑，推薦濃度為 250 g/L。試驗藥劑用水稀釋，采用DFH-16A型背負式手動噴霧器對葡萄植株雙面均勻噴霧。

選擇5個面積在1 hm2左右的相鄰葡萄地塊，抑菌劑施藥濃度按75、150、300 g/hm2等分別噴灑在3個地塊上，施藥液量均為90 L/hm2，另外2個地塊分別為對照和空白對照（清水）。噴灑時間為葡萄霜霉病發(fā)病初期，每隔7 d施藥1次，連續(xù)4次。當對照組明顯發(fā)病時開始調(diào)查，1周后調(diào)查防治效果。

調(diào)查方法為每個地塊隨機調(diào)查10個當年抽生新蔓，自上而下調(diào)查全部葉片，采用鄧肯氏新復(fù)極差（DMRT）法記錄各級病葉數(shù)及總?cè)~數(shù)，具體各級標準及藥效計算方法參考錢一鑫等的調(diào)查方法[15]。

1.3.4 葡萄酒窖抑菌應(yīng)用試驗方法 試驗于2019年11—12月于北京市密云區(qū)某酒莊酒窖內(nèi)進行，試驗藥劑為B15生物抑菌劑，對照組為無菌水。選取合適的大空間酒窖，將酒窖空間均分為前部相對通風、有空氣擾動的流動空間和后部氧氣濃度較低、氣流相對封閉的空間等2個部分進行。在2個空間分別挑選3處互不干擾的不同位置，每個位置放置均勻高度的平臺桌，在桌上均勻放置3個干凈的孟加拉紅平板用于收集空氣中的菌體。

施藥前，打開平板2 h收集菌體，設(shè)為空白對照組。然后，向2個空間的空氣中均勻噴灑抑菌劑，施藥濃度為1.2 g/L，藥液量為1 L，噴灑體積為8 m3，然后換一組新平板在相同條件下重復(fù)取樣。平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中，2 d后計數(shù)，觀察并記錄酒窖空氣中霉菌的數(shù)量。之后每天固定時間重復(fù)取樣和培養(yǎng)操作。1周后重復(fù)噴灑、取樣和培養(yǎng)操作，試驗共進行4周。

1.3.5 果蔬防腐應(yīng)用試驗方法 試驗于2019年12月在實驗室完成，試驗藥劑為B15生物抑菌劑，對照組為無菌水。

在市場購買當日現(xiàn)摘同一品種鮮食葡萄，將葡萄果實單粒完整剪下，每組30粒。將葡萄分別在無菌水和濃度為1.25、2.50 g/L的抑菌劑中各浸泡 2 min，然后取出自然晾干，置于干燥、潔凈的塑封袋中，每個袋子上中下位置分別扎一些小孔。1周后重復(fù)施藥處理，共重復(fù)施藥4周，每周觀察并記錄霉爛果粒數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物抑菌劑的指標測定

2.1.1 解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑孢子計數(shù) 選取105作為稀釋倍數(shù)，經(jīng)血球計數(shù)板計數(shù)，結(jié)果得到解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑中活性孢子數(shù)為5.02×107個/g。

2.1.2 解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑pH值的測定 測定3組后，得到該可濕性粉劑pH值的平均值為7.58。對照文獻[7-10]可知，可濕性粉劑的pH值在6～8為宜，中性最佳。該可濕性粉劑的pH值處于適宜范圍。

2.1.3 解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑細度的測定 3組可濕性粉劑試樣取樣量均為20.00 g，經(jīng)3組平行試驗得到的數(shù)據(jù)帶入GB/T 16150—1995《農(nóng)藥粉劑、可濕性粉劑細度測定方法》中的公式計算，得到的結(jié)果如表1所示。由表1可知，可濕性粉劑的細度為（97.97±013）%，符合推薦可濕性粉劑細度范圍。

2.1.4 解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑懸浮率的測定 經(jīng)3組平行試驗得到的數(shù)據(jù)帶入GB/T 14825—2006《農(nóng)藥懸浮率測定方法》中的公式計算，得到結(jié)果如表2所示。由表2可知，可濕性粉劑的懸浮率為（85.60±0.63）%，符合推薦可濕性粉劑懸浮率范圍。

2.1.5 解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑熱穩(wěn)定性的測定 將可濕性粉劑在54 ℃的恒溫箱中放置 14 d 后取出，分別按“1.3.2”節(jié)中所述方法測定pH值、細度和懸浮率，每個試驗設(shè)3組平行。測定結(jié)果顯示，孢子數(shù)為4.55×107個/g，pH值為7.55，細度為98.92%，懸浮率為85.58%，與初始測定結(jié)果相比變化不大?？梢钥闯觯摽蓾裥苑蹌岱€(wěn)定性良好。

2.2 生物抑菌劑的初步應(yīng)用

2.2.1 果蔬田間抑菌試驗 試驗結(jié)果表明，5.02×107個/g B15可濕性粉劑防治葡萄霜霉病試驗在75、150、300 g/hm2處理濃度均呈現(xiàn)出一定的抑菌效果，其平均防效分別為69.8%、72.3%、76.7%，在5%和1%水平上均具有顯著性影響。其中，處理濃度為300 g/hm2時對葡萄霜霉病的防治效果優(yōu)于75、150 g/hm2，且與對照藥劑22 400 g/hm2嘧菌酯懸浮劑的防治效果相當，平均防效在70%以上（表3、表4），達到農(nóng)藥防效的水平（70%～80%）。同時，B15可濕性粉劑對葡萄安全無藥害，藥劑在水中分散性能良好。

據(jù)此建議，B15可濕性粉劑在葡萄田間的施藥濃度控制在150～300 g/hm2，施藥時間為葡萄發(fā)病前噴施，會對夏季露地葡萄霜霉病有較好的防治效果。

2.2.2 葡萄酒窖抑菌試驗 酒窖陰暗潮濕的環(huán)境利于霉菌生長，會對葡萄酒品質(zhì)造成影響，一些霉菌代謝產(chǎn)生的霉菌毒素還會危害消費者的身體健康。對酒窖前后2個空間分別進行施藥試驗，結(jié)果如圖2所示。試驗結(jié)果表明，封閉空間施藥效果較好，平均抑菌率為77.32%，持續(xù)時間為3 d;流動空間受空氣擾動的影響，結(jié)果穩(wěn)定性較差，平均抑菌率為6472%，持續(xù)時間為1.8 d。

2.2.3 果蔬防腐實驗 由表5可知，試驗第1周所有試驗組和對照組均無霉爛果粒，第2周開始出現(xiàn)霉爛果粒，隨著周數(shù)的增加，對照組霉爛果粒數(shù)逐漸增多，好果率逐漸降低，最后1周好果率僅為267%。相比對照組，經(jīng)過抑菌劑處理的2個試驗組的葡萄果粒大部分仍保持完整，最后1周50、100 mg/L 試驗組好果率分別為76.7%、83.3%。試驗結(jié)果表明，B15抑菌劑在果蔬保鮮方面確實存在一定的防腐效果，因其為天然生物抑菌劑，易降解沖洗，對果蔬危害較小，在果蔬保鮮劑方面具有一定的應(yīng)用前景。

3 討論與結(jié)論

本研究根據(jù)解淀粉芽孢桿菌對葡萄霜霉病、葡萄炭疽病等真菌病原的抑制作用，制備了解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑，并對其在葡萄種植病害防治、葡萄酒窖抑菌及葡萄防腐等方面分別進行了初步應(yīng)用。3種施藥應(yīng)用試驗結(jié)果表明，B15可濕性粉劑在葡萄酒廠中的葡萄園種植、酒窖貯存和葡萄防腐方面均具有一定的效果，尤其在果蔬保鮮劑的應(yīng)用領(lǐng)域，具有一定的應(yīng)用前景和潛力。

總體來說，解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑在具體試驗中顯示出良好的應(yīng)用效果，具有很好的應(yīng)用潛力和開發(fā)價值，為我國釀酒葡萄在葡萄種植、果實保鮮和葡萄酒貯存整個流程中的真菌病害防治提供了有價值的應(yīng)用參考。

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