王有琴，黃飛，張睿，樊麗君，吳利利，吳安鵬，寧澤洋，林堯，王小菊

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州市中心醫(yī)院，湖北隨州 441300)

單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)有HSV1型和HSV2型兩種血清型，95%的單純皰疹病毒腦炎由HSV1引起[1]。單純皰疹病毒腦炎(herpes simplex virusen-cephalitis，HSE)是非流行性腦炎中常見的類型，具有病死率高、預(yù)后差和后遺癥嚴(yán)重等特點(diǎn)[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，HSE的發(fā)病機(jī)制不僅包括病毒直接侵襲導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞功能障礙，還包括免疫反應(yīng)引起的繼發(fā)性炎性改變和腦水腫[4]。而Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是HSE發(fā)病過程中誘導(dǎo)宿主抗病毒免疫反應(yīng)和組織損傷相關(guān)的主要分子，其中Toll樣受體3(TLR3)是識(shí)別雙鏈RNA(dsRNA)病毒入侵的關(guān)鍵免疫分子[5]。TLR3接收到病毒信號(hào)刺激后，激活干擾素誘導(dǎo)鏈接蛋白(TRIF)信號(hào)途徑，進(jìn)一步將信號(hào)通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡蛋白(TRADD)傳遞給TAB2-TAB3-TAK1激酶復(fù)合體，從而激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)分子和NF-κB基本調(diào)節(jié)因子(NEMO)，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生；同時(shí)，通過將信號(hào)傳遞給腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TRAF3)，進(jìn)而通過干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)途徑刺激 Ⅰ 型干擾素的產(chǎn)生[6-8]。各種趨化因子(chemokines)和細(xì)胞因子如干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)又會(huì)促進(jìn)產(chǎn)生更多的趨化因子，從而擴(kuò)大抗病毒的免疫反應(yīng)，過度的免疫反應(yīng)也導(dǎo)致了神經(jīng)元和組織的損傷[9-10]。由此可見，治療HSE的關(guān)鍵在于阻斷TLR3分子識(shí)別HSV后產(chǎn)生“過激”免疫反應(yīng)所造成的炎性損傷。因此，若能找到一種可以抑制TLR3信號(hào)通路，降低這種有害免疫反應(yīng)的藥物來妥善管理先天免疫反應(yīng)，HSE可能會(huì)有良好的預(yù)后。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用3周齡的Balb/c雄性小鼠60只，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量11～13 g，飼養(yǎng)在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院的普通動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。所有動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)性操作均遵守華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的護(hù)理及使用準(zhǔn)則，并在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)下進(jìn)行。

1.2 試劑

柯里拉京標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%滴定)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)所。聚肌甘酸-聚胞苷酸Poly(I∶C)購(gòu)自美國(guó)InvivoGen公司。IFN-α ELISA試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司。TLR3、TRIF引物合成自武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司。兔抗鼠TLR3和TRIF抗體均購(gòu)自美國(guó)Affinity公司。RNAiso Plus、Prime Script TM RT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司(中國(guó)大連)，ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。

1.3 病毒

HeLa細(xì)胞、HSV1由武漢協(xié)和醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，當(dāng)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%時(shí)向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加100 μL HSV1病毒液，然后加適量含5%血清的培養(yǎng)液(DMEM)高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每隔4 h于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化情況，HeLa細(xì)胞感染病毒后可見細(xì)胞病變Cytopathic effect(CPE)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變大，折光性增強(qiáng)，胞質(zhì)內(nèi)可見氣球樣的空泡，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。當(dāng)>80%的細(xì)胞出現(xiàn)了病變，在9 000 g離心機(jī)中離心30 min，收集上清液放于-80 ℃冰箱備用。

1.4 動(dòng)物造模與分組

1.4.1 LD50測(cè)定 用DMEM高糖培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)按照對(duì)數(shù)滴度稀釋HSV1原液分別為0、10-1、10-2、10-3、10-4、10-56個(gè)濃度梯度備用。取30只小鼠隨機(jī)分為6組，每組5只，分別為0、10-1、10-2、10-3、10-4、10-56個(gè)濃度梯度組，用10%水合氯醛溶液按3.5 mL/kg的劑量腹腔注射使小鼠麻醉，然后將小鼠置于腦立體定位儀上，從右側(cè)眼角與右側(cè)外耳道口連線中點(diǎn)處進(jìn)針2～3 mm，感受到針突破顱骨后直接向顱內(nèi)注射入不同濃度梯度的 20 μL HSV1懸液制造HSE小鼠模型。觀察小鼠癥狀，感染HSV1后，小鼠從第2天開始出現(xiàn)聳毛、蜷縮、發(fā)抖、驚恐、消瘦、食欲低下等，感染第4～5天癥狀達(dá)高峰，最后部分小鼠衰竭死亡。每天記錄不同病毒滴度下小鼠發(fā)病后的癥狀及存活情況，并通過改良寇氏法計(jì)算LD50。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組 取30只小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組10只、Poly(I∶C)陽性對(duì)照組10只、HSV1感染組10只。每組小鼠分別通過上法注入體積為20 μL的DMEM培養(yǎng)基、Poly(I∶C)(100 μg/kg)、HSV1(LD50，10-4/20 μL)，1 h后，每組分2個(gè)亞組各5只小鼠(對(duì)照組和治療組)，實(shí)驗(yàn)小鼠均于造模后第1天開始灌胃等體積柯里拉京或生理鹽水(normal saline，NS)，30只小鼠分為DMEM/NS、DMEM/Cor、Poly(I∶C)/NS、Poly(I∶C)/Cor、HSV1/NS、HSV1/Cor 6組?？吕锢﹨⒖嘉墨I(xiàn)用量40 mg/(kg·d)灌胃[17]，灌胃前后12 h所有實(shí)驗(yàn)小鼠均禁食，但不禁水，保證藥物充分均勻地吸收，造模后第 5天斷頭取右側(cè)顳葉腦組織檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.5 腦組織病理改變

取小鼠右側(cè)顳葉病變腦組織，經(jīng)過4%多聚甲醛固定、石蠟包埋切片之后，用蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察病理變化情況。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TLR3、TRIF的mRNA表達(dá)

提取小鼠模型病變側(cè)腦組織中的總RNA，并檢測(cè)RNA質(zhì)量；合成樣品cDNA，配制反應(yīng)體系，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書使用StepOne Plus(Applied Biosystems)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，最后采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有引物均由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成，其序列如下：TLR3(5’-GTGAGATA CAACGTAGCTGACTG-3’，5’-TCCTGCATCCAAGATAG CAAGT-3’)，TRIF(5’-GCAGAGTCGGGGTAACAAGA-3’，5’-CCAGAAGGTGGTGCTCAAATA-3’)，GAPDH(5’-AG GTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，5’-TGTAGACCATGTAG TTGAGGTCA-3’)。

1.7 Western blot測(cè)定TLR3、TRIF的蛋白質(zhì)表達(dá)

提取蛋白樣品，經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育后ECL檢測(cè)，拍照，應(yīng)用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。

1.8 ELISA法檢測(cè)腦組織中IFN-α的表達(dá)

取綠豆大小的顳側(cè)腦組織，用PBS清洗后放入配套研磨器內(nèi)充分研磨，將研磨液轉(zhuǎn)移入1.5 mL EP管中，做好標(biāo)記，于12 000 r/min離心機(jī)離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移入新1.5 mL EP管中，做好標(biāo)記，凍存于-20 ℃冰箱待用。上清液中IFN-α含量按照ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟說明進(jìn)行操作。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LD50測(cè)定

感染HSV-1病毒的第2天，小鼠開始出現(xiàn)聳毛、蜷縮、發(fā)抖、驚恐、消瘦、食欲低下等癥狀，感染后的第4～5天癥狀達(dá)高峰，部分小鼠最后衰竭死亡。詳細(xì)記錄不同病毒滴度組每天小鼠存活只數(shù)，用改良寇氏法計(jì)算LD50。見表1。

表1 小鼠顱內(nèi)注射各濃度梯度的HSV1后不同時(shí)間的存活情況 只

2.2 腦組織病理改變

Poly(I∶C)/NS組、HSV1/NS組腦組織可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、顳葉壞死、大面積出血、腦組織水腫；HSV1/Cor組、Poly(I∶C)/Cor組小鼠腦組織水腫減輕，神經(jīng)細(xì)胞變性減輕，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減少；DMEM/NS組、DMEM/Cor組結(jié)構(gòu)完整，無明顯炎癥浸潤(rùn)。見圖1。

圖1 小鼠腦組織HE染色病理切片(×200)

2.3 Cor對(duì)Poly(I∶C)和HSV1感染小鼠腦組織TLR3/TRIF信號(hào)通路的影響

用IMAGE Quant程序?qū)Ω鳁l帶中心密度進(jìn)行測(cè)定。蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度以蛋白A值/GAPDH值進(jìn)行計(jì)算，見表2。Poly(I∶C)和HSV1感染小鼠腦組織后TLR3、TRIF的蛋白表達(dá)均升高，見圖2。

表2 Poly(I∶C)和HSV1感染小鼠腦組織后TLR3、TRIF的蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度

圖2 Western blot檢測(cè)各組小鼠腦組織中TLR3、TRIF的蛋白表達(dá)

Poly(I∶C)和HSV1感染小鼠腦組織后TLR3及下游分子TRIF的mRNA表達(dá)量高于正常對(duì)照組(P<0.01)；與Poly(I∶C)+NS組或HSV1+NS組比較，經(jīng)柯里拉京灌胃治療后Poly(I∶C)+Cor組或HSV1+Cor組mRNA表達(dá)量減少(P<0.01)。見表3。

表3 PCR檢測(cè)腦組織中TLR3及下游分子TRIF的mRNA表達(dá)情況

Poly(I∶C)和HSV1感染小鼠腦組織后TLR3下游IFN-α的分泌均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，提示小鼠感染Poly(I∶C)和HSV1后，TLR3通路被激活，刺激了炎性因子IFN-α的分泌。與Poly(I∶C)+NS組或HSV1+NS組比較，經(jīng)柯里拉京灌胃治療后Poly(I∶C)+Cor組或HSV1+Cor組IFN-α的分泌減少(P<0.01)。見表4。

表4 ELISA試劑盒檢測(cè)腦組織中IFN-α的分泌 pg/mL

3 討論

HSE是一種常見的散發(fā)性腦炎，在治療上尚無特效藥物。目前，阿昔洛韋(acyclovir，ACV)作為一線用藥仍然是治療HSE的主要抗病毒藥物[18]，皮質(zhì)類固醇在改善病情方面也起著重要作用[19]。然而，隨著臨床抗病毒藥物治療劑量的增加和療程的延長(zhǎng)，治療效果卻有限，無輕度神經(jīng)損害并能恢復(fù)日常生活能力的幸存者百分比為40%～55%[20]。同時(shí)，病毒對(duì)阿昔洛韋或其他抗病毒藥物產(chǎn)生了耐藥性。此外，皮質(zhì)類固醇具有一定的副作用，有學(xué)者提出激素可引起病毒復(fù)制及播散，因此在臨床使用中存在爭(zhēng)議[10]。因此，尋找能顯著改善HSE病情的廣譜抗病毒藥物顯得尤為重要。

Poly(I∶C)是一種dsRNA類似物，能誘導(dǎo)IFN-β和fl細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而被廣泛用于復(fù)制病毒感染的確切階段的實(shí)驗(yàn)[21-22]。Poly(I∶C)可以在實(shí)驗(yàn)中特異性激活TLR3信號(hào)通路，因此作為本研究中的陽性對(duì)照。

本研究發(fā)現(xiàn)用HSV-1感染小鼠后，小鼠存活率下降，TLR3和TRIF的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，炎性因子IFN-α的表達(dá)也明顯增加，表明HSV-1在小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中激活TLR3，并通過TLR3-TRIF通路來加強(qiáng)炎癥反應(yīng)。當(dāng)使用Cor治療病毒感染時(shí)，小鼠存活率顯著改善；此外，TLR3和TRIF的mRNA和蛋白水平降低，并且炎性因子IFN-α的表達(dá)明顯降低。且病理實(shí)驗(yàn)證明柯里拉京治療后的小鼠腦組織水腫減輕，神經(jīng)細(xì)胞變性減輕，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減少，病死率降低，重型顱腦損傷與炎性細(xì)胞因子的分泌有關(guān)。因此，柯里拉京對(duì)腦損傷的治療作用也與抑制體內(nèi)釋放的促炎細(xì)胞因子有關(guān)，Cor可以通過抑制TLR3-TRIF信號(hào)通路和控制炎性因子IFN-α的表達(dá)從而減輕HSV1誘導(dǎo)的腦炎的損傷。

本研究結(jié)果提供了一種新的治療方法。柯里拉京是一種細(xì)胞毒性低的天然產(chǎn)物，是一種有效的藥物，具有潛在的安全性，與其他現(xiàn)有藥物相比，具有不同的抗病毒機(jī)制。柯里拉京可以抑制TLR3-TRIF通路，減少神經(jīng)元的損傷，讓病毒感染后宿主的炎癥反應(yīng)減弱，同時(shí)抑制炎癥信號(hào)分子IFN-α的分泌，表明柯里拉京通過多重效應(yīng)來減輕HSV1導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的損傷。

柯里拉京能明顯抑制小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TLR3-RIF通路達(dá)到緩解HSV1引起的腦組織的損傷，為柯里拉京治療HSV1引起的腦炎提供了一個(gè)新靶點(diǎn)。