張 偉 謝漢賓 楊 剛 王軍馥 李必成 王天厚 王小明，

(1.上海自然博物館，上海，200041；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海，200433；3.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海，200062)

物種進化和多樣性的產(chǎn)生，長期以來都是生物學(xué)家研究的熱點。近年來的研究表明，人類活動，包括農(nóng)業(yè)、采礦、伐木和城市化等正在改變生物的進化過程[1-2]。其中城市景觀在全球范圍內(nèi)的快速擴張，引發(fā)最嚴重的生物多樣性喪失[3-4]，城市化已經(jīng)成為影響物種進化的重要力量。城市化改變了原有棲息地，引起棲息地的減少和破碎化，城市中的道路和基礎(chǔ)設(shè)施形成擴散屏障，嚴重影響物種的生存和基因交流[5-7]?，F(xiàn)代人類社會正在經(jīng)歷快速的城市化過程。1950年，全球僅有30%的人口生活在城市中。而到2014年，54%的人口居住在城市中，預(yù)計至2050年，全球人口的66%會生活在城市中。近年來，城市化的發(fā)展與城市系統(tǒng)中的物種快速進化的關(guān)聯(lián)，得到了國內(nèi)外研究者們的廣泛關(guān)注。包括Science、Nature、PNAS和Trendsinecology&evolution等知名雜志紛紛報道[2，8-10]。研究發(fā)現(xiàn)城市化不僅加速物種(包括動物、植物、真菌及其他生物)表現(xiàn)型的變化速度，同時也改變了城市種群中等位基因頻率，在現(xiàn)代物種進化過程中扮演重要的角色。

全球兩棲動物(Amphibia)面臨嚴重威脅，43%的兩棲動物數(shù)量急劇下降，遠遠超過鳥類(Aves)和哺乳類(Mammalia)[11-13]。最近的研究證實，城市化導(dǎo)致的棲息地喪失和破碎化是兩棲動物衰退的最直接原因[14-16]。城市的建設(shè)和發(fā)展改變了原有的生境，城市公園、社區(qū)綠地、綠化帶等殘余的棲息地，被分割在城市中。在這些生境內(nèi)生物個體被完全或部分的隔離，從而使種內(nèi)遺傳多樣性減小，種間分化增大[6]，其中擴散能力較弱的兩棲動物遺傳多樣性極大降低，而鳥類和大型的哺乳動物，遺傳多樣性的降低程度不大[17]。

上海市是我國城市化擴張的熱點地區(qū)[18]，也是我國城市化率最高的城市。由于城市建設(shè)發(fā)展及農(nóng)業(yè)用地，這一地區(qū)濕地遭到大量破壞，棲息于此的兩棲動物急劇減少。殘余的兩棲動物被道路、建筑隔離和硬質(zhì)地面分割成不同的小種群，棲息在不同的生態(tài)孤島中。金線側(cè)褶蛙(Pelophylaxplancyi)在上海市的分布較廣，已有的研究表明城市化影響金線側(cè)褶蛙的種群數(shù)量和健康指數(shù)[19-20]，但是城市化對金線側(cè)褶蛙遺傳結(jié)構(gòu)的影響尚不清楚。線粒體基因進化速率快，是研究種內(nèi)群體分化關(guān)系的良好遺傳標記。線粒體Cytb是許多脊椎動物系統(tǒng)發(fā)育最常用的分子標記，也包括對金線側(cè)褶蛙的研究[21]。此外，近年來對城市環(huán)境中兩棲、爬行動物種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究也常常使用該標記[22-23]。因此，本研究選擇mtDNACytb作為分子標記，評估上海市城市化對金線側(cè)褶蛙的遺傳結(jié)構(gòu)的影響，分析不同城市化區(qū)域的金線側(cè)褶蛙遺傳多樣性是否存在差異，城市化是否造成各個種群之間的交流障礙。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本研究在上海市各個地區(qū)包括城市公園、郊區(qū)和近岸島嶼的10個地點，共采集的金線側(cè)褶蛙成體樣本235個，采樣點基本覆蓋了上海市不同城市化程度區(qū)域和不同的兩棲類棲息地類型(圖1)。包括城市公園5個：后灘濕地公園(HT)，金海濕地公園(JH)，世紀公園(SJP)，上海植物園(ZWY)，高東公園(GD)；郊區(qū)半自然-半農(nóng)業(yè)濕地3個：松江(SJ)，青浦(QP)，南匯(NH)；近岸島嶼的半自然-半農(nóng)業(yè)濕地2個：崇明(CM)，長興(CX)。采樣時從后肢剪去少許組織樣品，放置于95%的乙醇中固定，儲存在-20℃冰箱中待用。

1.2 DNA擴增

用于擴增線粒體DNA細胞色素b基因片段的引物來自文獻[21]，分別為B104：5′-AAC ATC TCT GCA TGA TGA AAC TTC GG-3′和B829：5′-ATT GAG CGA AGG ATG GCG TAG GCGAA-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR的反應(yīng)總體積為20 μL，包括TaKaRa EmeraldAmp PCR Master Mix 10 μL，引物(10 μmol/L)各0.4 μL，DNA模板2 μL，使用雙蒸水將反應(yīng)總體積補足20 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)設(shè)置：95℃預(yù)變性5 min，之后94℃變性40 s，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，反應(yīng)35個循環(huán)之后，72℃10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物工程有限公司雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Clustal X 2.0進行序列比對[24]，比對后的序列使用DnaSP 5.1篩選單倍型[25]。各個不同種群之間的遺傳分化和基因流，使用Arlequin 3.5軟件計算[26]。使用MEGA 7 軟件，采用最大似然法、鄰接法和最大簡約法進行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自引導(dǎo)檢驗(bootstrap)獲得系統(tǒng)分支的置信度(重復(fù)次數(shù)為1 000)。應(yīng)用PopART 1.7 軟件[27]，基于TCS network分析單倍型之間的發(fā)育關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 遺傳多樣性

從金線側(cè)褶蛙的組織樣品中，成功擴增出235個序列，序列長度659 bp，獲得61個單倍型，其中單倍型多樣性(Hd)為(0.856±0.021)，核苷酸多樣性(Pi)為(0.004 3±0.000 3)，平均核苷酸差異為(k)2.948。

2.2 種群間的遺傳分化

從FST值來看，整個上海市各個金線側(cè)褶蛙種群之間的遺傳分化程度相對較低，最大值僅為0.296。各個城市公園之間的遺傳分化程度很低，F(xiàn)ST值都小于0.1，差異不顯著。郊區(qū)種群和市區(qū)公園，以及郊區(qū)種群之間的遺傳分化程度不高。但是，郊區(qū)的3個種群之間的FST值差異顯著，和部分城市公園之間的遺傳分化差異顯著。長興島(CX)、崇明島(CM)和所有種群之間的遺傳分化差異顯著(表1)。

表1 金線側(cè)褶蛙10個種群之間的FST值(對角線以下)及相應(yīng)的基因流水平Nm(對角線以上)

2.3 單倍型系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和網(wǎng)絡(luò)圖

以黑斑側(cè)褶蛙(Pelophylaxnigromaculatus)(登錄號：AB980779.1)為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。3種不同的系統(tǒng)發(fā)育樹具有基本相同的拓撲結(jié)構(gòu)，最清晰全面的拓撲結(jié)構(gòu)是由最大似然法生成的(圖 1)。系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)聚為4個較大的分支，分別命名A、B、C。來自島嶼、郊區(qū)和城市公園的單倍型，在各個分支上都有分布，表明金線側(cè)褶蛙各種群之間的聚類關(guān)系復(fù)雜。

基于TCS network構(gòu)建的單倍型的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖能夠更加直觀地反映61個單倍型之間的關(guān)系。各個種群中的單倍型呈現(xiàn)一種混雜的分布格局。除了來自島嶼的單倍型和城市公園、郊區(qū)之間突變距離較遠，其余單倍型之間的突變步數(shù)1—3步不等，演化關(guān)系呈現(xiàn)多個星狀輻射。

3 討論

3.1 遺傳多樣性

本研究分析了上海市235份金線側(cè)褶蛙樣品的mtDNACytb基因的部分序列，和更大的地理尺度范圍內(nèi)的研究相比，上海市的金線側(cè)褶蛙在單倍型(Hd0.856)和核苷酸(Pi0.004)多樣性較低。對比Garcia-Gonzalez等[28]在城市化區(qū)域的研究，上海市金線側(cè)褶蛙的遺傳多樣性指數(shù)與之處于同一水平。

基于線粒體和核基因的研究都表明，城市中心區(qū)域的兩棲類和爬行類具有較低的遺傳多樣性，郊區(qū)的種群遺傳多樣性較高[28-32]。本研究結(jié)果證實了城市環(huán)境中的兩棲類種群遺傳多樣性水平較低，郊區(qū)多樣性水平較高。此外，南匯(NH)盡管位于郊區(qū)，但是多樣性較低，推測可能與該地區(qū)為2002年之后采用圍墾促淤的方式成陸有關(guān)。

3.2 遺傳差異

上海市的金線側(cè)褶蛙種群分化程度處于中低的水平(MaxFST=0.296；MinFST=0.004)。相對較低的FST值，反映了在小地理尺度范圍內(nèi)，各種群之間有限的遺傳分化。許多研究側(cè)褶蛙屬(Pelophylax)系統(tǒng)發(fā)生的文獻，主要聚焦在更大地理尺度上的研究[21，33]，相應(yīng)地也發(fā)現(xiàn)了比本研究更高水平的遺傳分化。但是，在一個較小的尺度范圍內(nèi)，例如上海市，以線粒體細胞色素b作為分子標記，分析側(cè)褶蛙的遺傳結(jié)構(gòu)，尚未有人報道。在小尺度范圍內(nèi)使用COI作為分子標記，研究兩棲類的分化水平，發(fā)現(xiàn)Alytesobstetricans(FST=0.029—0.461，20 km距離)分化水平和本研究的相當[28]；而使用微衛(wèi)星標記的遺傳分化水平較低，如Bufobufo(FST=0.016，5.5—14.5 km 距離)，Ranaluteiventris(FST=0.07，3—34 km距離)和R.sylvatica(FST=0.014，0.05—21 km距離)[34-36]。

河流對于兩棲動物種群分化的影響在不同的研究中并不一致。Marsh等[40]發(fā)現(xiàn)溪流促進了低擴散的Plethodoncinereus的遺傳分化，而Zhao等[41]的研究發(fā)現(xiàn)河流并不是兩棲動物種群間基因流動的障礙。Zeisset等[42]認為導(dǎo)致這些不同最大可能性取決于河流的特征，如河流的寬度、流量、至上游的距離和洪峰等，以及兩棲動物的特征，如水生和陸生生活模式及擴散能力等。本研究中島嶼種群的研究結(jié)果很好地支持了這一推測。崇明(CM)和長興(CX)種群，分別位于長江出海口的位置。這2個島嶼是長江河口沖積形成，其中崇明島是我國第三大島嶼。長江的隔離使得這2個島嶼的種群和上海大陸上的種群之間基因差異顯著，2個島嶼之間的種群之間也分化顯著。

3.3 聚類關(guān)系

目前對于大尺度地理范圍的兩棲類系統(tǒng)發(fā)育研究表明，各種群之間分歧明顯[21，43-44]。而在較小尺度本研究中的金線側(cè)褶蛙的61個單倍型在系統(tǒng)發(fā)育上分歧不太明顯，來自城市公園、郊區(qū)和島嶼的種群，并沒有規(guī)律性的聚合為一個或幾個分支。單倍型的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖也更加直觀地體現(xiàn)了這一點。進化樹上3個較大的分支(A、B和C)，聚集的單倍型，也來自不同的地區(qū)。盡管各個種群之間的遺傳差異比較明顯，但是不同種群之間的遺傳差異程度并不足以形成不同的單系。

本研究證實了城市化區(qū)域金線側(cè)褶蛙遺傳多樣性的降低。城市公園、郊區(qū)和島嶼的種群之間的遺傳差異同時也驗證了河流在兩棲動物擴散中的作用，較大的河流可能阻礙了兩棲動物的交流，而較小的河流可能有助于兩棲動物的擴散和交流，一定程度上緩解了城市化導(dǎo)致的兩棲類遺傳障礙。