樊曉靜，于文濤，蔡春平，林浥，王澤涵，房婉萍，張見明，葉乃興

利用SNP標記構建茶樹品種資源分子身份證

樊曉靜1，于文濤2，蔡春平2，林浥1，王澤涵1，房婉萍3，張見明4，葉乃興1

1福建農林大學園藝學院/茶學福建省高校重點實驗室，福州 350002；2福州海關技術中心/福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福州 350001；3南京農業(yè)大學園藝學院，南京 210095；4武夷學院科研處，福建武夷山 354300

【】建立茶樹品種的SNP分子標記數據庫，結合茶樹品種基本信息，將SNP位點組成的DNA指紋圖譜構建28位數字組成的茶樹品種資源分子身份證，便于茶樹品種資源的保護與精準管理，避免“同名異物、同物異名”的現象。通過挖掘茶樹的表達序列標簽，獲得大量的高質量表達序列標簽，將其進行裝配后，開發(fā)候選位點，將候選位點與茶樹全基因組進行BLAST，得到其在全基因組染色體上的位置與具體關聯基因。以鐵觀音、福鼎大白茶、龍井43、云抗10號等103份國內外不同類型的茶樹品種資源為供試材料，提取基因組DNA，利用預擴增技術和微流體芯片法對供試茶樹品種資源進行SNP基因分型，獲得SNP位點數據及候選SNP位點的信息指數、觀測雜合度、期望雜合度等信息，將多態(tài)性從高到低進行排序，進行SNP位點組合篩選，得到最優(yōu)SNP位點組合后，結合茶樹品種基本信息構建茶樹品種資源分子身份證。從茶樹的表達序列標簽數據庫中挖掘出1 786個候選SNP位點。根據序列保守性，篩選出96個SNP標記位點，與最新茶樹基因組比對發(fā)現候選位點較均勻地分布于茶樹全基因組的15條染色體上；對茶樹品種資源的候選SNP位點的多態(tài)性信息進行分析，剔除10個不具多態(tài)性的位點，剩余86個位點的信息指數平均值為0.517，觀測雜合度平均值為0.370，期望雜合度平均值為0.346，固定指數平均值為-0.036，次等位基因頻率平均值為0.269。從86個SNP位點中篩選出24個多態(tài)性高的SNP位點，組成DNA指紋圖譜，可區(qū)分出全部參試茶樹品種資源。對24個SNP位點組成的DNA指紋圖譜并結合茶樹品種資源基本信息進行數字編碼，最終形成由28位數字組成的茶樹品種資源分子身份證。依據SNP標記的多態(tài)性信息，篩選SNP位點，精準區(qū)分全部供試茶樹品種，并將24個SNP位點所構建的茶樹品種資源DNA指紋圖譜及品種資源的基本屬性信息編碼成特定的數字串，使每份茶樹品種資源具有唯一的分子身份證，并生成相應的條形碼和二維碼，可快速被掃碼設備識別。

茶樹；品種資源；SNP；分子身份證；DNA指紋圖譜

0 引言

【研究意義】茶樹（(L.) O. Kuntze）為多年生異花授粉植物，具有高度異質性和雜合性[1]。中國西南地區(qū)是茶樹的起源地[2]，茶樹從起源地向中國其他地區(qū)和國外的自然傳播和人為傳播過程中，積累了自然演化和人工選擇的變異，從而在各茶區(qū)形成了豐富的茶樹品種資源[3]。然而在茶樹品種資源的大量引種及頻繁的品種資源交換過程中，造成同名異物、同物異名的現象[4-5]，不僅給茶樹品種資源保護利用帶來諸多困難，也損害了消費者的權益。因而科學準確地區(qū)分和鑒定茶樹品種資源具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】傳統(tǒng)使用形態(tài)標記、細胞標記等方法來區(qū)分、鑒定植物品種均有一定局限性。如形態(tài)學標記容易受環(huán)境和植物發(fā)育階段等影響；細胞學標記容易受制片技術的影響，且對于染色體小數量多的物種，其染色體核型不易區(qū)分清楚[6]。隨著生物信息技術的進步，以生物的遺傳物質核酸的多態(tài)性為基礎的分子標記得到了快速發(fā)展，DNA分析技術開始大量應用于植物學研究。RAPD、SSR等分子標記技術在研究茶樹遺傳多樣性、指紋圖譜及分子身份證構建等方面已有較多運用[7-13]。如安徽茶樹群體中的SSR遺傳多樣性分析[8]、茶樹SSR指紋圖譜的構建[9-10]、野生茶樹的RAPD分子標記鑒定[11]和名山茶樹基因身份證的構建[13]。Lander[14]在1996年提出SNP的遺傳標記技術，作為繼SSR為代表的第二代分子標記技術之后發(fā)展起來的第三代分子標記技術，是指個體間基因組DNA序列同一位置單個核苷酸變異所引起的多態(tài)性。SNP標記具有高密度性，且廣泛存在于基因組中，如人類基因組中平均每1 000 bp就會出現一個SNP，玉米中平均每57 bp出現一個SNP[15]。SNP作為第三代分子標記，其優(yōu)點在于快速、自動化、高通量[16]，其多態(tài)性幾乎在所有被研究物種中都被用作有效的遺傳標記，包括動物[17]和植物[18]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關于茶樹SNP分子標記的研究，主要集中在品種資源鑒定、遺傳多樣性、遺傳關系的分析及指紋圖譜的構建[19-20]，對茶樹品種資源的分子身份證進行構建鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究通過收集國內外103份茶樹種質，利用SNP標記并結合茶樹品種資源基本信息構建茶樹品種資源分子身份證，以期為茶樹品種資源保護鑒定提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試茶樹品種資源來源于武夷學院茶樹種質資源圃（福建省武夷山市）和福建省農業(yè)科學院茶葉研究所茶樹種質資源圃（福建省福安市），其中，中國茶樹品種資源有101份，來自華南、西南、江南、江北四大茶產區(qū)的10個茶葉主產區(qū)省份；國外茶樹品種2份，包括日本的玉綠和格魯吉亞的格魯吉亞1號。茶樹品種資源詳細信息見電子附表1。

1.2 DNA的提取

采用新型植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，DP320，北京）提取基因組DNA，利用超微量紫外分光光度計（Implen，S60716，德國）測定DNA濃度和純度。提取的基因組DNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SNP基因分型

中國烏龍茶產業(yè)協同創(chuàng)新中心課題組前期從國家生物信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih. gov/）中下載了茶樹的表達序列標簽（express sequence tags，EST），獲得大量可用于數據挖掘的高質量EST。經過軟件CAP3程序將序列裝配，再利用Quality SNP在含有6條以上同源序列重疊群中開發(fā)候選SNP位點，得到了1 786個候選EST-SNP位點。為確保獲得高質量的SNP用于后期驗證，之后進入人工選擇，要求篩選出的SNP位點前后有60 bp堿基完全保守，最終篩選出用于茶樹種質資源的96個SNP標記位點[20-21]。目前，已有多個茶樹全基因組數據公布[22-25]，將96個候選位點與最新發(fā)表的茶樹全基因組[25]進行局部序列比對搜索[26]，得到候選SNP位點序列在全基因組染色體與具體基因上的位置。利用Fluidigm 96.96 Dynamic Array? IFC芯片（Integrated Fluidic Circuit; Fluidigm? Corp，USA）進行基因分型，該芯片可同時檢測96個樣品和96個SNP位點，且上樣后可自動進行PCR反應，芯片讀取圖如電子附圖1。96.96 Dynamic Array? IFC芯片使用方法需根據樣品實際情況進行改進；而后使用EP1?成像儀（Fluidigm? Corp, USA）獲得96.96 IFC熒光圖像。

1.4 數據處理

利用Fluidigm SNP Genotyping Analysis軟件（https://www.fluidigm.com/software）進行數據導出和分析，并確定每個SNP位點處的樣品基因型是純合子或雜合子。使用GenAlEx6.503軟件分析等位基因頻率（allele frequency）、信息指數（information index，）、觀察雜合度（observed heterozygosity，o）、預期雜合度（expected heterozygosity，e）、固定指數（fixation index，F）和次等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）。將茶樹品種資源基本信息與其DNA指紋圖譜信息結合，利用在線條碼生成器（http://barcode. cnaidc.com）和二維碼在線生成軟件（http://qr-batch. com/）以數字條碼的形式構建茶樹品種資源分子身份證。

2 結果

2.1 茶樹SNP標記多態(tài)性描述統(tǒng)計

采用的96個SNP標記位點較均勻地分布于茶樹全基因組15條染色體上（電子附表2）。對103份茶樹品種資源進行分析，剔除10個不具多態(tài)性的引物后，剩余86個SNP位點多態(tài)性的相關信息列于電子附表3。根據統(tǒng)計，這些SNP標記多態(tài)性信息指數（）為0.071—0.693，平均值為0.517。觀測雜合度（o）范圍為0.027—0.982，平均值為0.370。期望雜合度（e）的范圍在0.026—0.500，平均值為0.346。固定指數（F）為-0.964—0.462，平均值為-0.036。次等位基因頻率（MAF）范圍在0.013—0.500，平均值為0.269。

2.2 茶樹品種資源最佳SNP位點的篩選及指紋圖譜的構建

信息指數常用來評價群落的遺傳多樣性，如果每一個體都屬于不同的種，多樣性指數就最大；如果每一個體都屬于同一種，則其多樣性指數就最小，即多樣性指數越高，其區(qū)分品種能力卻強。因此，基于103份茶樹品種資源材料，對SNP數據進行統(tǒng)計分析，從86個SNP位點中優(yōu)化篩選了24個多態(tài)性較高的SNP位點（電子附表4，圖1），可將103份茶樹品種資源完全區(qū)分開。DNA指紋圖譜（圖2）顯示每個SNP位點處的樣品是雜合子（XY）或純合子（XX，YY）。

2.3 茶樹DNA指紋圖譜編碼

對篩選獲得的最佳SNP數據進行數字編碼，作為構建分子身份證基本信息。在24個SNP標記，共有24種基因型，3種等位基因（XY、XX和YY），因此，每個位點分別用1—3代表等位基因多態(tài)性。以福鼎大白茶為例，在CS3處的基因型為TC，對應XY，編碼為1，以此類推，將基因型全部轉換成24數字編碼為131132311121332112313231。

藍色：雜合子（XY）；紅色：純合子（XX）；綠色：純合子（YY） Blue: Heterozygote (XY); Red: Homozygote (XX); Green: Homozygote (YY)

藍色：雜合子（XY）；紅色：純合子（XX）；綠色：純合子（YY）

2.4 茶樹品種資源信息編碼

茶樹的基本信息由4位數字組成，其中，茶樹品種資源類型分類參考陳亮等[27-28]方法。第1位數字代表茶組植物具體物種，茶樹（(L.) O.Kuntze）為1，大廠茶（F. C. Zhang）為2，厚軸茶（Chang）為3，大理茶（(W. W. Smith) Melchior）為4，禿房茶（Chang）為5；第2—3位數字代表行政區(qū)劃代碼，如福建為35，浙江為33，云南為53，國外為00；第4位數字代表茶樹品種資源類型，野生茶樹為1，地方品種和地方種質為2，優(yōu)良品種（含育成品種）為3，新選品系、株系為4，國外品種為5。以福鼎大白茶舉例，4位數字商品碼為1353，其中“1”表示是分類上茶組植物種類，“35”代表該茶樹種質原產地是福建，“3”表示為優(yōu)良品種。

2.5 茶樹品種資源分子身份證的構建

基本商品信息和DNA指紋圖譜共同組成由28位數字編碼的茶樹品種資源分子身份證（表1）。以國家級品種福鼎大白茶舉例，其品種資源基本信息為：屬茶組植物中的茶樹（），原產于福建，品種資源類型為優(yōu)良品種，轉換成數字碼為1353；其24個SNP分子標記的基因型分別為TC、TT、AT、CT、GG、GG、CC、TC、TG、TC、TT、AG、GG、TT、CC、AG、CT、TT、CC、AT、GG、GG、CC、TC，轉換成24位數字碼為131132311121332112313231。則福鼎大白茶的分子身份證為1353131132311121332112313231（圖3-A），將其轉化為條形碼和二維碼如圖3-B所示。

圖3 福鼎大白茶分子身份證

3 討論

3.1 茶樹品種資源SNP標記的基因分型

本研究103份茶樹品種資源樣品來源于中國的四大茶產區(qū)，以及日本和格魯吉亞，來源范圍廣，茶樹品種資源遺傳多樣性豐富，其中也有遺傳背景相近的茶樹品種親子代，如福鼎大白茶和云南大葉種的自然雜交后代福云6號、福云7號和福云595，及以四川中葉種為母本、云南大葉種為父本的蜀永2號、蜀永3號和蜀永703。本研究中所選用的96個SNP標記位點中，多態(tài)性標記為86個，占比為89.6%。SNP標記一般只有2種堿基組成，因此，被認為具有二態(tài)性；由于具有等位基因性的特點，其等位基因在任何種群中都可被估算出來。除此之外，SNP標記在不同條件下具有較高的重復性和準確性[29-30]，這是指紋圖譜和分子身份證建立的重要前提。本研究通過SNP技術對這些茶樹品種資源進行基因分型及統(tǒng)計分析，使每份品種資源具有唯一的SNP基因型，驗證了SNP標記技術的準確性。與SSR相比，SNP分析不基于DNA大小片段的分離，因此，可通過高通量的形式自動化檢測。目前常用的高通量、自動化程度較高的檢測分析SNP的方法之一是DNA芯片法[31]。本研究所采用的高通量微流體芯片法具有高通量、試劑和樣品用量少、IFC技術自動操作、試驗重復性好的優(yōu)點[32]。

3.2 茶樹最佳引物的篩選確認

篩選較少的引物，可以縮短茶樹品種資源鑒定的時間，降低應用成本。最佳引物的選擇是構建指紋圖譜和分子身份證的重要步驟。Pan[33]利用21對引物對1 025份甘蔗種質構建了分子身份證。李春花等[34]采用15對引物構建了48份苦蕎資源的分子身份證。冉昆等[35]利用10對引物構建了45份山東地方種質梨的分子身份證。高源等[36]利用TP-M13-SSR分子標記技術，通過篩選引物，對蘋果分子身份證進行了構建。在本研究的96個SNP標記中，去除10個在試驗樣品中表現出多態(tài)性差的標記位點，再依據引物的信息指數（），通過從高到低排序，逐步增加引物組合數量，使其能夠區(qū)分更多的品種資源，以獲得最佳的引物。經過分析，本研究最終篩選了24個SNP標記位點能夠將103份茶樹品種資源完全區(qū)分，24個SNP標記位點位于茶樹全基因組的12條染色體上，染色體覆蓋度為80%，覆蓋度較高，有利于茶樹品種資源的有效鑒別。

表1 103份茶樹品種資源的分子身份證

3.3 茶樹品種資源DNA分子身份證的價值與應用

作物品種資源的分子身份證與DNA指紋圖譜的功能相同，都是為了區(qū)分不同生物個體。相對于指紋圖譜，分子身份證是將作物品種資源的基本信息用特定的數字編碼為數字串，并且輔以條形碼、二維碼的形式展現，更加簡明直觀地區(qū)分品種資源之間的差異。分子身份證因其自身所具有特性，可利用機器進行掃描，達到方便快捷地識別大量品種資源，提高品種資源鑒定和評價的效率。另外，分子身份證的唯一性，也可有效甄別市場上同名異物、同物異名現象，有利于品種識別與保護。許多植物已利用分子標記技術構建分子身份證，如水稻[37]、百合[38]、桃[39]、枸杞[40]等。本研究首次利用SNP標記技術將DNA指紋圖譜與品種資源基本信息相結合，可為每份茶樹品種資源構建獨有的分子身份證。該身份證信息包括了茶樹品種資源的分子指紋碼和屬性碼，可快速了解其分子信息、來源等基本信息。本研究結果對于茶樹品種資源區(qū)分和精準鑒定、分子數據數字化建立具有重要的意義和實際應用價值，為茶樹品種資源DNA分子身份證的構建提供了思路。

4 結論

篩選出24個最佳SNP位點組合，可精準區(qū)分全部103份供試茶樹野生種、地方品種和地方種質、優(yōu)良品種、新選品系和株系以及國外品種。將24個SNP位點組成茶樹品種資源DNA指紋圖譜編碼，與茶樹品種資源的基本屬性信息編碼組成28位數字的茶樹品種資源DNA分子身份證，并生成相應的條形碼和二維碼，可快速被掃碼設備識別。

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Construction of Molecular ID for Tea Cultivars by using of Single- nucleotide polymorphism (SNP) Markers

FAN Xiaojing1, YU Wentao2, CAI Chunping2, LIN Yi1, WANG Zehan1, FANG Wanping3, ZHANG Jianming4, YE Naixing1

1College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science in Universities of Fujian Province, Fuzhou 350002;2Technology Centre of Fuzhou Customs District/Fujian Key Laboratory for Technology Research of Inspection and Quarantine, Fuzhou 350001;3College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;4Wuyi University, Wuyishan 354300, Fujian

【】In order to facilitate the protection and precise management of tea cultivars and avoid the phenomenon of homonyms and synonyms, single-nucleotide polymorphism (SNP) molecular marker database of tea cultivars was established, and the 28 digit molecular identities of tea cultivars were constructed by DNA fingerprinting of SNP loci and the basic information of tea cultivars.【】By mining the expressed sequence tags (EST) of tea plants, a large number of high-quality ESTs were obtained. Then, the ESTs were assembled to develop candidate SNP loci. And, high-quality SNPs for tea plants were screened. Furthermore, the candidate SNP loci were compared with the whole genome of tea plant to confirm their positions on the chromosomes and specific genes. The genomic DNA was extracted from fresh leaves of 103 tea cultivars. Subsequently, the genotyping of accessions was carried out on microfluidic chips. Information index, observed heterozygosity and expected heterozygosity of the candidate SNPs were obtained. The SNP loci were further screened by their polymorphism, obtaining the optimal combination of SNP loci. The molecular identities of tea cultivars were finally constructed by combining the basic information of tea cultivars.【】A total of 1 786 candidate SNP loci were selected from the EST database of. According to the sequence conservation, 96 SNP loci were selected. Compared with the latest tea plant genome, the candidate loci were evenly distributed on 15 chromosomes of the whole tea plant genome. The polymorphism information of candidate SNP loci of tea cultivars were analyzed, and 10 non-polymorphic loci were eliminated. The average values of information index, observed heterozygosity, expected heterozygosity, fixed index and minor allele frequency of the remaining 86 loci were 0.517, 0.370, 0.346, -0.036, 0.269, respectively. 24 SNPs, with high polymorphism, were screened out from 86 SNPs to distinguish all tea cultivars. Based on the fingerprint of 24 SNP markers and the basic information of tea cultivars, the tea molecular ID, which composed of 28 digits, was formed finally. 【】According to the polymorphism information of SNP markers, the candidate SNP loci were screened. And all tea cultivars were accurately distinguished. Furthermore, The DNA fingerprints of 103 tea cultivars were constructed by the 24 SNP markers and the converted serial codes from information of the tea cultivars, each germplasm thus has a unique molecular identity code, and the bar codes and quick response (QR) codes are generated as the molecular ID card, which can be quickly identified by the code scanning equipment.

; cultivar; SNP; molecular ID; DNA fingerprint

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.08.014

2020-08-28；

2020-09-27

福建省“2011協同創(chuàng)新中心”中國烏龍茶產業(yè)協同創(chuàng)新中心專項（閩教科〔2015〕75號）、海關總署科技項目（2020HK187）、福建農林大學茶產業(yè)鏈科技創(chuàng)新與服務體系建設項目（2020-01）、福建張?zhí)旄２枞~發(fā)展基金會科技創(chuàng)新基金（FJZTF01）

樊曉靜，E-mail：1187248076@qq.com。通信作者葉乃興，E-mail：ynxtea@126.com。通信作者于文濤，E-mail：wtyu@foxmail.com

（責任編輯 李莉）