駱群 王雨婧 卓海龍

免疫血液學是輸血醫(yī)學的核心部分，通過對其體系內(nèi)容的擴展，我們可看到輸血醫(yī)學的全貌，進而能揭示輸血醫(yī)學的學科脈絡(luò)。輸血的實施使供者血液成分及其衍生物進入到受者體內(nèi)，產(chǎn)生各種各樣的免疫學反應(yīng)，以血型差異產(chǎn)生的免疫反應(yīng)最為關(guān)注。因此以供受者血液標本為實驗對象，判斷輸血相容性的相關(guān)實驗室醫(yī)學，我們稱之為血型血清學。然而現(xiàn)代輸血已經(jīng)不再是初始條件下血液從供血者血管直接輸注到受血者血管的過程，現(xiàn)代醫(yī)學救治的需求也促使血液的采集供應(yīng)向流程化、標準化和規(guī)?；l(fā)展。我們除了關(guān)注供者同種血細胞抗原及血漿中的抗原及受血者的血型血清學狀態(tài)，還有很多異源性物質(zhì)與輸血實踐，同樣給免疫血液學帶來影響，擴展了免疫血液學范疇，主要包括以下幾個方面：①采集裝置含有的血液保存液，加工工藝中產(chǎn)生的溶出物或殘留物，高分子材料血袋高溫高壓滅菌工藝所含的增塑劑，一次性去白細胞濾器病原體滅活的環(huán)氧乙烷。②靜脈穿刺對血管造成損傷，分離制備等造成血細胞破壞，血小板和凝血因子激活，從而釋放的炎性物質(zhì)。③供者攜帶的病原微生物。④血液成分在血袋中蓄積的代謝產(chǎn)物，崩解的衰老細胞碎片,這些物質(zhì)會隨著采集的血液進入血袋，最后影響受血者，促發(fā)免疫反應(yīng)。⑤多次輸血會使免疫原多次暴露，導致受血者免疫學狀態(tài)不同。⑥紅細胞成分低溫保存是為了減少細菌污染以及減慢紅細胞代謝，但在4℃保存的紅細胞成分輸注時會使一些低溫反應(yīng)的血型抗體活性增加。⑦輸血的速度與時間，會導致受者機體免疫反應(yīng)的強弱不同。

免疫血液學討論的最常見也是最基本的問題是抗原抗體反應(yīng)，即我們所說的廣義血型概念帶來的免疫血液學問題。常規(guī)上我們應(yīng)用血型血清學技術(shù)手段來發(fā)現(xiàn)相容性問題。近年來利用分子診斷技術(shù)將更為精準地判斷供受者血型差異，選擇最適合供者，實現(xiàn)精準輸血，避免因輸血帶來的免疫反應(yīng)。本文對2020年以后文獻中涉及的新血型系統(tǒng)的確定，免疫血液學分子診斷技術(shù)進展以及其他較為重要的影響免疫血液學檢測的問題做一回顧。

1 確定的新紅細胞血型系統(tǒng)

1.1 PEL血型系統(tǒng)（ISBT 040）：既往發(fā)現(xiàn)的血型中大多數(shù)血型抗原的遺傳位點已被確定，但一些高頻血型抗原的遺傳基礎(chǔ)仍不清楚。1980年，DANIELS描述了一種新的高頻紅細胞抗原，暫時以先證者的名字命名為PEL[1]，該血型抗原一直歸類于紅細胞抗原901高頻抗原系列中。

2020年2月發(fā)表在Blood上的一項研究，以四個PEL高頻抗原陰性家系為研究對象，發(fā)現(xiàn)了編碼MRP4（Multidrug Resistance Protein 4）蛋白的ABCC4基因為PEL抗原編碼基因，該基因的大片段純合缺失導致了PEL抗原陰性的稀有表型。該團隊通過對PEL陰性先證者和PEL陽性個體進行比較蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)其ABCC4蛋白缺乏，隨后對其編碼的ABCC4基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)了一個長度為67Kb的純合缺失片斷，提示ABCC4基因的大片段缺失可能為PEL陰性表型的分子基礎(chǔ)。為進一步證實ABCC4基因編碼的ABCC4蛋白表達PEL抗原，該研究在HEK293細胞中過表達ABCC4基因，結(jié)果顯示在ABCC4蛋白表達增強的同時，PEL抗原表達也增強；同時在K562細胞中，使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除ABCC4基因后，ABCC4蛋白表達缺乏的同時，PEL抗原表達也轉(zhuǎn)為陰性[2]。雖然ABCC4是一個重要的環(huán)狀核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白，但來源于ABCC4蛋白缺乏的PEL陰性個體的紅細胞卻表現(xiàn)出正常的cGMP水平，提示紅細胞內(nèi)存在其他ABC轉(zhuǎn)運蛋白的代償機制。有趣的是，PEL陰性個體表現(xiàn)出血小板聚集功能受損，證實了ABCC4在血小板功能中的作用。

這項研究通過全外顯子組測序和比較蛋白質(zhì)組學分析等方法發(fā)現(xiàn)ABCC4基因為PEL血型抗原的編碼基因，該基因的大片段缺失是導致PEL陰性血型的分子基礎(chǔ)，該血型系統(tǒng)也被國際輸血協(xié)會紅細胞免疫遺傳和血型命名委員會（ISBT working party on Red Cell Immunogenetics and Blood Group Terminology）命名為新的第40號血型系統(tǒng)。

1.2 MAM血型系統(tǒng)（ISBT 041）：MAM抗原是一種紅細胞高頻抗原，MAM抗原陰性表型最早發(fā)現(xiàn)于1993年，當時在一名孕婦（M.a.M.）的血清中檢測到一種針對高頻抗原的同種抗體，但該胎兒并未出現(xiàn)胎兒新生兒溶血病表現(xiàn)。隨后，有多例抗-MAM引起的嚴重胎兒新生兒溶血病的報道，甚至還包括致死病例[3]。

2020年11月，經(jīng)多國機構(gòu)合作并在Nature Communication聯(lián)合發(fā)表了關(guān)于MAM血型抗原編碼基因的最新研究成果。該研究通過全外顯子組測序，鑒定編碼上皮膜蛋白3（EMP3）基因為可能的候選基因。隨后在10個已知的MAM陰性個體中測序也發(fā)現(xiàn)該基因存在失活突變。該研究還發(fā)現(xiàn)紅系細胞也表達該EMP3。通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，在人永生化的紅系細胞株（BEL-A2）中沉默EMP3基因表達后，MAM抗原表達也轉(zhuǎn)為陰性。此外，研究還發(fā)現(xiàn)EMP3蛋白與細胞表面信號分子CD44穩(wěn)定表達相關(guān)。體外培養(yǎng)MAM陰性個體的前體紅細胞，其網(wǎng)織紅細胞增殖量上升，表明EMP3在紅系增殖中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。這項研究證實MAM抗原由EMP3基因編碼的EMP3蛋白表達，EMP3基因突變是MAM陰性表型形成的分子基礎(chǔ)，該血型系統(tǒng)也被ISBT紅細胞免疫遺傳和血型命名委員會命名為新的第41號血型系統(tǒng)[4]。

1.3 EMM血型系統(tǒng)（ISBT 042）：1973年，在馬達加斯加出生的法國男子的血清中發(fā)現(xiàn)了針對某種紅細胞高頻抗原的天然抗體。隨后又于1985年，發(fā)現(xiàn)了其兩個兄弟也是該高頻抗原陰性的表型，表明該抗原具有家系遺傳特征。1987年DANIELS等建議命名該抗原為Emm，國際輸血協(xié)會紅細胞免疫遺傳和血型命名委員會將其歸類于901高頻抗原系列中（即900028抗原）[5]。2013年報道了一例孕婦產(chǎn)生抗-Emm的病例，一名來自非洲北部的23歲初產(chǎn)婦在妊娠15周時抗體篩查呈陽性，且為針對某種未知高頻抗原的抗體，該抗體與父親的紅細胞呈陽性反應(yīng)，產(chǎn)后2個月被鑒定為抗-Emm[6]。2018年報道抗-Emm可造成急性溶血性輸血反應(yīng)，具有臨床意義[7]。

2021年2月，多國機構(gòu)合作的一個研究，對包括兩例有抗-Emm的Emm陰性表型先證者在內(nèi)的一個南亞印度家系成員，進行了全外顯子測序分析，對發(fā)現(xiàn)的基因突變進行過濾分析后，發(fā)現(xiàn)了編碼GPI-乙醇胺轉(zhuǎn)移酶Ⅱ的PIGG基因存在一個高度關(guān)聯(lián)的2bp缺失突變，隨后在另外兩名Emm抗原陰性個體中也發(fā)現(xiàn)了該基因的兩個大片段的缺失突變。GPI-乙醇胺轉(zhuǎn)移酶Ⅱ催化乙醇胺磷酸基連接于GPI錨蛋白表達Emm。該研究結(jié)果表明該酶的缺乏與Emm陰性表型相關(guān)?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，ISBT紅細胞免疫遺傳和血型命名委員會將PIGG基因編碼高頻抗原Emm的血型系統(tǒng)命名為新的第42號血型系統(tǒng)。

1.4 ABCC1血型系統(tǒng)（ISBT 043）：2017年在一名巴西患者體內(nèi)檢出一種針對未知高頻抗原的抗體，該患者血漿僅與兩個兄弟的紅細胞配血相合，通過對其家系成員的全外顯子測序以及變異過濾分析，發(fā)現(xiàn)了一個候選基因ABCC1存在大片段缺失突變，蛋白免疫印跡分析（Western）檢測顯示先證者和兩位配血相合兄弟的ABCC1蛋白缺失，體外表達的ABCC1蛋白與先證者放散液反應(yīng)呈陽性。

2020年，美國國立衛(wèi)生研究院藥物基因組學平臺篩選影響藥物吸收、分布、代謝、消除、免疫不良反應(yīng)和靶標的基因變異。該平臺上測試的1191個基因中，有12個基因在紅細胞膜中表達：ABCC1、ABCC4、ABCC5、ABCG2、CFTR、SLC16A1、SLC19A1、SLC29A1、ATP7A、CYP4F3、EPHX1和FLOT1。這些基因代表5個ATP結(jié)合盒蛋白，3個溶質(zhì)載體蛋白，1個ATP轉(zhuǎn)運蛋白和3個與藥物代謝和藥物不良反應(yīng)相關(guān)的基因。僅ABCG2和SLC29A1就分別編碼了血型系統(tǒng)JR和AUG[8]。作為紅細胞上抗原表達明確，遺傳學特征明顯，ABCC1的許多變異又與治療反應(yīng)、癌癥預后、藥物毒性和疾病易感性有關(guān)。2021年2月，ISBT紅細胞免疫遺傳和血型命名委員會將ABCC1基因編碼高頻抗原ABCC1的血型系統(tǒng)命名為新的第43號血型系統(tǒng)。

2 分子診斷在免疫血液學中的應(yīng)用

2.1 血型分型中的下一代測序技術(shù)（NGS）：下一代測序技術(shù)（又稱二代測序）是指繼第一代Sanger雙脫氧測序技術(shù)之后的二代基因組測序技術(shù)，是基于特定引物的PCR、DNA雜交或DNA測序[9]。所有的NGS方法都具有相對較短的讀取時間和同時完成上萬個乃至數(shù)百萬個模板或片段測序。也稱為大規(guī)模并行測序。德國紅十字會輸血服務(wù)中心以及德國烏爾姆大學輸血醫(yī)學研究所系統(tǒng)介紹了血型分型中的NGS[9]。

人類基因組的測序可以明確大多數(shù)相關(guān)血型系統(tǒng)的基因定義，并且能表征大多數(shù)臨床相關(guān)血型抗原的多態(tài)性。在無法獲得紅細胞或由于缺乏抗血清而無法進行血清學檢測的情況下，分子血型分型具有明顯優(yōu)勢，且在某些特定情況下可能更具成本效益。該文簡要描述了目前可用的NGS平臺及其規(guī)范，描述了血型多態(tài)性的遺傳背景和在免疫血液學中的應(yīng)用；相關(guān)技術(shù)挑戰(zhàn)、局限性以及包括長讀測序技術(shù)的未來發(fā)展前景。提示了隨著NGS在免疫血液學領(lǐng)域應(yīng)用的逐步完善，不久會廣泛應(yīng)用于血型分型的醫(yī)學實踐。

2.2 獻血者血型基因分型的應(yīng)用：由劍橋大學血液學系聯(lián)合荷蘭阿姆斯特丹大學醫(yī)學中心免疫血液學系、挪威卑爾根大學信息學系、美國國家人類基因組研究所、紐約血液中心以及哈佛醫(yī)學院等29個機構(gòu)共同開發(fā)和驗證了通用獻血者血型基因分型平臺[10]，致力建立一個通用的可擴展的血液匹配策略以減少乃至避免輸血引起的非自身抗原致敏的副作用。這種基于DNA的檢測能同時對大多數(shù)臨床相關(guān)的紅細胞抗原（RBC）、人血小板抗原（HPA）和人白細胞抗（HLA）進行分型。來自2個國家生物庫的7 927名歐洲、27名南亞、21名東亞和9名非洲獻血者的樣本，與已知紅細胞同種抗體致敏患者的抗體數(shù)據(jù)比較來證明該平臺的有效性。基因分型結(jié)果顯示，在89 371例RBC、3 016例HPA和9 289例HLA的比較中，臨床驗證分型結(jié)果的一致性分別為99.91%、99.97%和99.03%。基因分型使抗原分型結(jié)果的總數(shù)從110 980增加到120 000。通過密集的供者分型可以識別出2到6倍的血液相容性獻血者，能為3 146名產(chǎn)生了多種紅細胞同種抗體的患者提供服務(wù)，為其中176名以前在同一供者中一直找不到血液的患者找到了至少1個匹配的獻血者。該平臺技術(shù)可以應(yīng)用于世界各地的血液服務(wù)機構(gòu)，也必將推動免疫血液學進入實質(zhì)性分子配血的新階段。

德國杜塞爾多夫大學醫(yī)院聯(lián)合德國紅十字會西部血液服務(wù)中心也利用NGS對12個人類血小板抗原系統(tǒng)的獻血者進行高通量篩選[11]。12個不同HPA系統(tǒng)包括HPA-1到HPA-5、HPA-9w、HPA-10w、HPA-16w、HPA-19w、HPA-27w和HPA-34w。該研究對757名有移民背景的個體和547名西歐血統(tǒng)的獻血者樣本進行了大規(guī)模篩查。他們開發(fā)了一個用于快速自動分析的內(nèi)部軟件，通過TaqMan分析和Sanger測序結(jié)果對NGS工作流程進行驗證。將來自不同國家的獻血者分為若干組，比較等位基因頻率。結(jié)果顯示1 304例中的1 299例（99.6%）成功完成NGS檢查。與TaqMan法和Sanger測序結(jié)果的一致性為99.8%。利用TaqMan分析在兩個樣本中觀察到了由罕見的單核苷酸多態(tài)性引起的等位基因缺失，也能夠通過NGS解決。在ITGB3、GPB1A、ITGBA2和CD109基因的編碼區(qū)檢測到20種罕見的和2種新的變體。確定的等位基因頻率與gnomAD數(shù)據(jù)庫中公布的頻率相似。這種基于高通量擴增的NGS是一種在大樣本隊列中同時篩選HPA各基因型的可靠方法，并且很容易升級，可用于其他目標基因分型。

2.3 血型基因分型用于臨床無創(chuàng)檢查：無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷是人類遺傳學長期追求的目標之一。1997年香港中文大學在母體血漿中發(fā)現(xiàn)的無細胞胎兒DNA，為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷研究開辟了新的可能性[12]。2020年澳大利亞血液中心完成了無創(chuàng)性產(chǎn)前檢查（NIPT）應(yīng)用于母體異基因免疫引起的胎兒和新生兒溶血病監(jiān)測研究[13]。無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測技術(shù)僅需采取孕婦靜脈血，利用DNA測序技術(shù)對母體外周血漿中的游離DNA片段（包含胎兒游離DNA）進行測序，并將測序結(jié)果進行生物信息分析，得到胎兒的遺傳信息，從而檢測胎兒是否患有染色體疾病。此技術(shù)同樣也可以對胎兒的血型進行鑒定。目前在許多國家，NIPT對胎兒RHD基因分型作為一種實時PCR診斷檢測方法已經(jīng)被納入常規(guī)臨床治療中，用于應(yīng)對具有同種anti-D的婦女，以評估HDFN的風險。除發(fā)生抗D引起的胎兒和新生兒溶血病外，還包含抗K、抗c和抗E等。隨著基因檢測技術(shù)在此領(lǐng)域的應(yīng)用，仍在不斷發(fā)現(xiàn)與母體同種異體免疫有關(guān)的新的或罕見的抗原。該研究建立的篩查技術(shù)，對未致敏RHD陰性孕婦的胎兒RHD基因型進行產(chǎn)前評估，以便精準地針對孕有RHD陽性嬰兒的孕婦使用抗D免疫球蛋白預防。結(jié)果顯示診斷和篩選試驗均顯示出較高的準確性（99%以上）。由于大多數(shù)變異來自單核苷酸突變，NIPT應(yīng)用于非典型（RhD除外）血型抗原基因分型的挑戰(zhàn)性還是很大，但是基因組和生物信息技術(shù)還是有潛力提供一種個性化的干預手段，通過NIPT評估具有RhD外的紅細胞抗體的婦女的胎兒血型狀況，以控制HDFN的風險。

另外，MARION等[14]于2020年7月發(fā)表的項目研究中建立并驗證了用于檢測血漿中無細胞DNA（cfDNA）中RHD外顯子3、5和7、KEL1、HPA-1a和HPA-5b的數(shù)字PCR（dPCR）方法，用于檢測相關(guān)紅細胞血型和血小板抗原。對Y染色體標記釉原蛋白以及對常染色體單核苷酸多態(tài)性進行dPCR分析，以此作為胎兒DNA證明的對照。在對目標基因座進行預擴增后，應(yīng)用雙色（FAM和VIC）TaqMan探針化學法和基于芯片的dPCR，對已知基因型的無償獻血者混合血漿倍比稀釋進行驗證。對于雙標記的KEL1/2、HPA-1a/b、HPA-5a/b、AMEL-X/Y和3個常染色體SNPs，探針可在兩個熒光通道中進行等位基因識別。NIPT檢測的dPCR方案適用于孕婦血漿樣品。結(jié)果顯示，RHD外顯子5檢測可在RHD陰性背景下檢測到0.05%RHD陽性目標樣本，而外顯子7檢測至少需要0.25%的目標樣本。外顯子3的檢測背景最高，并且需要至少2.5%的RHD目標樣本才能可靠地檢測。雙標記的dPCR分析顯示出相似的敏感性，能夠檢測至少0.5%的目標基因。HPA-1a檢測法是最靈敏的，可在僅含0.05% HPA-1a的混合血漿中進行目標檢測。研究還對13例不同胎齡孕婦的血漿樣品目標基因檢測顯示出明確的陽性和陰性結(jié)果。該研究表明，dPCR分析孕婦血漿中的cfDNA可用于胎兒等位基因的檢測。由于檢測的高靈敏度，RhD、KEL1和HPA的NIPT方案也可應(yīng)用于妊娠早期。

2018年5月，39家英國醫(yī)療體系（NHS）的醫(yī)保醫(yī)院開展了一項高通量無創(chuàng)產(chǎn)前檢測，分析了胎兒RHD基因型檢測的情況于2020年發(fā)表[15]。截面調(diào)查以及專家訪談的結(jié)果顯示NIPT結(jié)果不確定的發(fā)生率僅為4.3%，認為胎兒RHD基因型的NIPT可以在不消耗大量額外資源的情況下，通過添加到現(xiàn)有的患者檢測路徑中來開展。該調(diào)研從NIPT檢測的成本效益角度做了綜合分析，有效推動了此技術(shù)在全英醫(yī)療體系的應(yīng)用。

2.4 免疫血液學實驗室實踐中紅細胞表型與基因分型的差異研究：血清學和分子抗原分型方法存在假陽性和假陰性反應(yīng)。如果預測的表型與患者已知的抗體或血清學表型不一致，則必須對差異進行調(diào)查。獻血者和患者中出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果都會給血液匹配帶來問題。SHEILA等人[16]在近兩年的日常分子實驗室實踐中調(diào)查分析了血清學和分子檢測在患者和獻血者中的差異。差異性病例以鐮刀狀紅細胞貧血患者比例最大，也觀察到一種獻血者表型和基因型差異的高發(fā)生率情況。導致差異的主要原因是最近的輸血和表型鑒定技術(shù)的限制。分為假陽性表型/真陰性基因型和假陰性表型/真陽性基因型，它們的差異主要發(fā)生在近期輸血的患者和RH變異個體中，而分為真陰性表型/假陽性基因型的差異則涉及沉默基因?qū)е碌目毡硇?。盡管目前采用的分子方法有局限性，但我們發(fā)現(xiàn)假陰性和假陽性表型多于基因型，這表明基因型分型更能有效地確定血型，尤其是在長期依賴輸血的患者中。

2.5 HLA表位匹配（HEM）血小板的臨床應(yīng)用：血小板輸注無效會導致不良后果并增加醫(yī)療費用。由于HLA同種異體免疫導致血小板輸注無效，需要使用HLA抗原匹配的血小板，但若需要大量的血小板供者，則不能保證完全匹配。JUDITH C等人[17]報告了一項隨機、雙盲、非劣效性交叉試驗，比較了HLA表位匹配（HEM）血小板與HLA標準抗原匹配（HSM）血小板輸注。

HEM中表位水平的匹配是通過描述HLA分子線性連續(xù)（圖1左：triplet）或不連續(xù)且空間緊密（圖1右：eplet）氨基酸殘基的氨基酸短序列來實現(xiàn)的。HEM血小板預計不會被致病性供者特異性抗HLA同種抗體靶向，因此不會經(jīng)歷抗體介導的吞噬作用，輸血小板后計數(shù)會增加。該研究的受者選擇是罹患異基因免疫、血小板輸注無效、血小板減少的再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征或急性髓系白血病等。HEM血小板的選擇采用HLA媒介表位（特別是eplet）匹配?；颊呓邮芰硕噙_8次預防性的HEM和HSM輸血，按隨機順序提供。主要結(jié)果是輸血后1小時血小板計數(shù)增加（PCI）。49名患者被隨機分配到14家英國醫(yī)院。以治療為目的計算，HEM和HSM可評價的輸血次數(shù)分別為107和112，對于HEM和HSM方法，未經(jīng)調(diào)整的平均PCIs分別為23.9（標準偏差[SD]，15）和23.5（SD，14.1）（經(jīng)調(diào)整的平均差異，20.1；95%置信區(qū)間[CI]，22.9～2.8）。由于95%CI的下限不大于預定義的非劣效性極限，因此宣布HEM方法不劣于HSM方法。血小板計數(shù)、輸血需求和出血事件的次要結(jié)果沒有差異。每增加一個表位錯配，達標PCI的可能性降低15%。認為抗原表位匹配的血小板可考慮應(yīng)用于HLA同種異體免疫患者。

圖1 HEM中表位水平的匹配

另外相似的一項回顧性研究[18]，探討人類白細胞抗原（HLA）A和B表位匹配的血小板對已有同種抗體的再生障礙性貧血（AA）患者血小板輸注效果的影響。同時也對HLA-C表位錯配的相關(guān)性進行了研究。通過使用抗原匹配算法提供HLA相容的血小板，對隨機血小板輸注產(chǎn)生輸注無效的患者可以提升血小板計數(shù)。這種方法在算法在反應(yīng)頻率較低的患者中被證明是有效的，但在高度敏感的患者中并不總是成功。研究者使用HLA表位選擇的血小板作為抗原匹配方法的替代方法。在37例高免疫AA患者中，分析了HLA抗原表位匹配（Eplets和Triplets）對血小板輸注結(jié)果的影響。使用HLAMatchmaker程序確定表位匹配。輸血結(jié)果通過輸血后1小時和24小時獲得的血小板計數(shù)增量（PCI）進行評估。HLA-A和B表位匹配在提高血小板計數(shù)方面與HLA抗原匹配相當。當考慮HLA-C表位錯配時，PCI無顯著差異。

3 免疫血液學的自動化檢測與質(zhì)量控制。

3.1 抗體效價的自動化測定：抗體（anti-A和anti-B）可介導溶血性輸血反應(yīng)、抗體介導的實體器官移植排斥反應(yīng)和干細胞移植后的延遲移植。然而，抗體的定量通常是勞動密集型的并依賴于操作者，限制了其廣泛臨床應(yīng)用。LALLY K等[19]人評估了自動化、固相和基于凝集的抗體效價平臺與手動凝膠檢測的差異性。該研究隨機抽取54例患者血漿標本。滴度通過實驗室的標準分析（手動稀釋，然后手動凝膠測試）測定，并與全自動血庫分析儀（Galileo NEO，Immucor）的結(jié)果進行比較。分析儀使用固相法測定IgG抗體，并通過直接血凝法測定IgM抗體。結(jié)果顯示人工凝膠法與自動法測得的抗體效價在一倍稀釋范圍內(nèi)（＞80%）以及兩倍稀釋范圍內(nèi)（100%）基本一致。在O型樣本中，凝膠滴度和通過自動分析獲得的最高滴度（IgG或IgM）在配對非參數(shù)分析中相似（抗-A為P=0.06；抗-B為P=0.13）。A組和B組患者的凝膠滴度略高于通過自動分析獲得的最高滴度（A組P=0.04；B組P=0.009）。盡管存在差異，但仍在可接受的測量誤差范圍內(nèi)。該研究說明在自動固相和凝集分析儀上進行的抗體效價測定與手動凝膠試驗獲得的結(jié)果相當。通過自動滴定法對IgM和IgG抗體進行單獨定量，可以進一步了解溶血、ABO血型不合移植后移植物存活情況以及ABO血型不合干細胞移植后紅細胞植入情況。

3.2 全自動凝膠滴定的優(yōu)勢：還有一項自動凝膠滴定研究由兩個學術(shù)中心參與。O型血漿標本用鹽水緩沖凝膠卡測定抗ABO IgM滴度和針對4種次要紅細胞抗原的同種IgG抗體應(yīng)用抗IgG凝膠卡的測定滴度。多臺奧森多公司自動分析儀用于評估儀器間的變化。實驗室間比較ABO IgM樣本經(jīng)統(tǒng)一分裝后檢測，以評估實驗室間的變異性。用試管和自動凝膠技術(shù)對多個樣品進行滴定，以確定結(jié)果的一致性。檢測結(jié)果顯示，自動滴定時，分析儀之間或不同檢測地點之間無顯著差異。對非ABO IgG滴度評估結(jié)果顯示儀器間的變異性很小。通過自動凝膠試驗獲得的IgM抗A和抗B滴度既不高于也不低于試管滴度。本研究數(shù)據(jù)表明，自動凝膠滴定法具有高度的重復性（IgM和IgG），與手工試管直接凝集法（IgM）的結(jié)果沒有顯著差異。與試管法相比，ABO抗體和非ABO抗體的儀器間變異性小，準確度相當[20]。

3.3 自動血庫系統(tǒng)IH-500與手工試管法測定抗血型抗體定量方法的比較：YANG等[21]人對自動血庫系統(tǒng)和手工試管法血型抗體滴度（ABT）進行比較，使用一個經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)來評估替代的統(tǒng)計方法。該研究選取實體器官移植標本進行ABT。比較方法為常規(guī)手工試管法和IH-500柱凝集血庫系統(tǒng)。符合標準為完全匹配和或1-滴度匹配（不超過1個滴度匹配）率。將測得的滴度值對數(shù)轉(zhuǎn)換為定距量表進行Deming回歸分析。結(jié)果顯示用滴度值應(yīng)用兩種定量值方法對試管法和柱凝集法進行比較，準確率為15.9～41.5%，1-滴度匹配率為65.9～97.6%。用Deming回歸證明了兩種方法之間存在比例差異和常數(shù)差異。該研究表明由于試驗的半定量值，采用常規(guī)統(tǒng)計方法進行方法比較有局限性。用對數(shù)轉(zhuǎn)換定距型數(shù)據(jù)值有助于分析此類方法比較的數(shù)據(jù)。這種替代的統(tǒng)計方法有助于更準確地比較ABT檢測的分析和標準化。

3.4 室間質(zhì)評分析：免疫血液學外部質(zhì)量評價（EQA）即室間質(zhì)評，結(jié)果的錯誤率分析是糾正實驗偏差的重要質(zhì)量活動。在實際工作中，輸血前檢測中的一些錯誤一直未被重視，錯誤率和由此產(chǎn)生的糾正措施的必要性可能被低估。EQR方案可為識別易出錯的實驗室測試提供有價值的輸入。然而，到目前為止很少有關(guān)于EQR方案中錯誤率的公開數(shù)據(jù)。BUCHTA等人[22]對187個參與實驗室的紅細胞免疫血液學EQA方案中錯誤結(jié)果的類型和發(fā)生率進行調(diào)查。考慮到所采用的測定方法，對1999年～2017年58個分布的結(jié)果進行評估。結(jié)果顯示58 726例中，錯誤563例（0.96%）?？贵w鑒定錯誤率為5.45%，Rh分型錯誤率為1.39%，血清學交叉配型錯誤率為0.83%，直接抗球蛋白試驗錯誤率為0.60%，Kell分型錯誤率為0.20%，抗體篩查錯誤率為0.16%，ABO分型錯誤率為0.14%。在觀察期間，53名參與者報告了無錯誤的結(jié)果，37名參與者報告了一個錯誤的結(jié)果，97名參與者重復報告了一個或多個樣本的錯誤結(jié)果。人工方法的錯誤率明顯高于自動方法（1.04比0.42%）。如采用兩種不同的體系進行雙重檢測，可將Rh表型的錯誤率從1.55%降低到0.50%。該研究表明單個實驗室檢測存在一定的錯誤風險，風險評估應(yīng)以輸血前試驗結(jié)果的錯誤率不同為導向，方能有助于制定適當?shù)母倪M措施。

4 單克隆抗體治療藥物對輸血相容性檢測的影響與解決辦法。

4.1 抗CD38單克隆抗體：Daratumumab（DARA）即抗CD38單克隆抗體，是一種治療多發(fā)性骨髓瘤（MM）的人源性單克隆抗體。DARA與紅細胞上的CD38結(jié)合并干擾紅細胞同種抗體的檢測。ZHAN[23]等人對2015年7月～2018年12月接受DARA治療的45名患者的完整血清學特征和輸血史進行回顧性研究。目的是評估接受DARA治療的MM患者紅細胞同種異體免疫的風險。所有Ab陽性者均行二硫蘇糖醇（DTT）檢測紅細胞同種抗體。在第一次DARA給藥至最后一次給藥之間或在最后一次DARA給藥后延伸至第一次陰性Ab篩查（如果Ab篩查呈陽性）期間監(jiān)測紅細胞輸注史。對照組為46例接受輸血但未接受DARA治療的MM患者。結(jié)果顯示，共對45例輸注ABO-Rh血型相容紅細胞、表型匹配紅細胞或兩者同時輸注的患者進行了184次Ab篩查。經(jīng)DTT處理后，無一例出現(xiàn)可檢測的同種抗體。Ab篩查陽性的持續(xù)時間有顯著差異，從最后一次給藥后25天到5個月不等。對照組46名患者中有2名患者先前存在同種抗體，但在研究期間未檢測到新的同種抗體。該研究結(jié)果表明，在接受目前方案治療的MM患者中，輸血后形成新的紅細胞同種抗體的風險非常低，并且在同種異體免疫風險方面沒有DARA相關(guān)的差異。ABO-Rh相容輸血與表型匹配輸血在同種異體免疫方面無顯著差異。

目前的DTT 0.2 mol/L法耗時長，對多種紅細胞血型抗原有損傷作用。IZAGUIRRE等人[24]研究了克服抗CD38單克隆抗體在配伍試驗中干擾的新方法。該研究評估了低濃度DTT處理紅細胞的凝膠檢測方法。在6例DARA患者的標本上評價了4種DTT濃度（0.01、0.02、0.03和0.04 mol/L）和3種凝膠卡品牌。該方法包括在AHG微柱凝膠上吸取50 μL 0.8%的紅細胞，然后25 μL DTT，混合并在37 ℃下孵育15 min。然后，添加25 μL血清/血漿進行IAT。為評價DTT 0.04 mol/L對不同血型抗原的作用，對含有抗K、抗k、抗Kpb、抗Lub、抗Yta和抗JMH抗體的血清進行了倍比稀釋試驗。對一例已知同種抗體的DARA患者以及兩例已知有抗K和抗Fya的患者進行評估。結(jié)果顯示用0.04 mol/L DTT處理紅細胞15 min，可完全消除所研究樣品的抗CD38廣泛凝集現(xiàn)象，且在IAT和凝膠卡品牌中具有不同的反應(yīng)強度。新方法可以檢測潛在的抗D，抗E，抗K和抗Fya同種抗體。倍比稀釋試驗分析表明，Kell、Lutheran、Cartwright以及JMH抗原沒有變性。凝膠檢測的新DTT方法有效、簡單，且僅比常規(guī)IAT增加15 min。

FUTUMAKI等人[25]使用流式細胞儀抗體結(jié)合試驗（FABA）定量DTT處理前后紅細胞上CD38的數(shù)量，以確定DTT對CD38失活的最佳濃度和處理時間。在100倍以上過量的未標記抗CD38抗體存在或不存在的情況下，將未經(jīng)處理或DTT處理的紅細胞與異硫氰酸熒光素標記的抗CD38抗體孵育，然后通過流式細胞術(shù)（FCM）分析。使用Kolmogorov-Smirnov檢驗以D值確定CD38陽性情況，并與常規(guī)FCM、間接抗球蛋白試驗（IAT）和westernblot結(jié)果進行比較。結(jié)果顯示FABA結(jié)果與常規(guī)FCM結(jié)果一致。D值在分析DTT處理前后CD38的差異中是可靠的。研究表明，0.007 5 mol/L DTT作用30 min即可使紅細胞CD38失活。這種方法能夠檢測微量細胞表面抗原，并將有助于評估各種化學處理變性紅細胞抗原。

TREMBLAY T等人[26]發(fā)現(xiàn)Daudi B細胞系表達高水平的CD38，可以中和抗CD38以消除其對輸血相容性檢測的干擾。將Daudi B細胞在超聲緩沖液中進行超聲處理以實現(xiàn)細胞完全裂解，所得基質(zhì)制劑在20 000 g下離心20分鐘條件下制備，然后與DARA血漿混合并在37 ℃下培養(yǎng)10 min。再次離心基質(zhì)DARA血漿混合物，收集上清液并用新鮮基質(zhì)再進行四輪吸附。用凝膠間接抗球蛋白試驗（IAT）檢測去DARA血漿。凝膠IAT分析顯示，用Daudi細胞基質(zhì)孵育DARA的患者的血漿導致DARA的顯著消耗，可以有效地克服DARA對血清學檢測的干擾，而不影響DTT或胰蛋白酶敏感抗原。Daudi細胞基質(zhì)廉價，易于大批量制備，可作為一種現(xiàn)成的試劑。

4.2 抗-CD47單克隆抗體：抗-CD47單克隆抗體（商品名ALX148）是ALX Oncology公司開發(fā)的一種CD47阻斷劑，目前正在臨床上用于治療晚期實體瘤和淋巴瘤。由于CD47在紅細胞（RBC）上高度表達，其治療阻斷可能會干擾輸血前的相容性試驗。KIM等人[27]研究ALX148對輸血前相容性試驗的干擾，評估了減輕干擾的方法。該研究對4例接受ALX148治療的患者的6個樣本進行常規(guī)血清學檢測。對ALX148摻入血漿進行抗體篩選試驗，對ALX148包被的紅細胞進行紅細胞試驗，包括抗原分型。用可溶性CD47或高親和力信號調(diào)節(jié)蛋白（SIRP）單體去除加入或不加入抗E抗體的摻入ALX148血漿的假陽性反應(yīng)。結(jié)果顯示ALX148在間接抗球蛋白試驗（IAT）和兩階段木瓜蛋白酶試驗的抗體篩選中產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。然而，在即時離心（IS）、室溫（RT）和37℃時未觀察到假陽性反應(yīng)。直接抗球蛋白試驗、自身對照和洗脫液顯示陽性結(jié)果。ALX148不影響在IS或RT階段進行的血型抗原分型。使用50-100倍摩爾濃度過量的可溶性CD47或300倍摩爾濃度過量的高親和力SIRPα單體去除IAT中的假陽性反應(yīng)，而不影響抗E檢測。研究表明ALX148在IAT中產(chǎn)生假陽性反應(yīng)，干擾輸血前配伍試驗。使用可溶性CD47或高親和力SIRP力單體可以解決干擾而不可能丟失具有臨床意義的同種抗體。

5 新型冠狀病毒感染與血型 2020年輸血領(lǐng)域還發(fā)表了許多血型與新型冠狀病毒感染之間關(guān)系的文章，我們在這里沒有深入綜述。血型與疾病是否存在明確的關(guān)系一直爭議較大。但是近一個世紀以來血型頻率發(fā)生確實顯示出不同人群之間的差異,有些可能與疾病發(fā)生或者感染性疾病概率相關(guān)，如幽門螺桿菌、諾如病毒和霍亂不易感可能與人類分泌物中ABH和Lewis抗原表達的基因多態(tài)性有關(guān)。現(xiàn)有證據(jù)表明，瘧疾感染是影響血型表達最為重要的選擇壓力。缺乏血型活性分子或血型活性分子發(fā)生改變的紅細胞通常出現(xiàn)在世界瘧疾流行地區(qū)，特別是非洲的Fy（a-b-）表型和S-S-表型以及東南亞的Ge-和SAO表型。創(chuàng)始人效應(yīng)為歐洲和中亞的D表型分布和胎兒和新生兒溶血病的發(fā)生提供了更令人信服的解釋[28]。我國學者首先報道了ABO血型與發(fā)展為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的易感性之間存在關(guān)系[29]。也有學者從SARS-CoV-2感染中恢復的CP供者同質(zhì)人群中ABO血型與COVID-19之間的關(guān)聯(lián)中，發(fā)現(xiàn)O型人群有不易感傾向[30]。

分子診斷在免疫血液學的應(yīng)用，不僅在發(fā)現(xiàn)新血型，明確新的血型系統(tǒng)，抑或會發(fā)現(xiàn)與血型關(guān)聯(lián)的疾病、傳染病等，從而挖掘自然選擇下人類進化與遺傳的機制，并能擴充免疫血液學的血型相關(guān)內(nèi)容，從而形成新的分支領(lǐng)域，豐富與完善免疫血液學內(nèi)涵。同種輸血接觸異體抗原遠比不上胎母致敏的概率，因為胎母出血導致胎兒紅細胞不斷進入母體，誘導母體產(chǎn)生抗體機會較多，來自父親的稀有血型抗原便容易被發(fā)現(xiàn)。但是抗原免疫原性弱，總體概率還是很低，隨著胎兒分娩離開母體，相容性問題便告一段落，遠沒有受到關(guān)注。但胎兒新生兒溶血對于免疫血液學學者來說意義重大。基于我國人群基數(shù)與多民族交融特點，我國免疫血液學學者應(yīng)重視胎兒新生兒溶血的發(fā)現(xiàn)，深究其遺傳學背景，促進我國新血型的發(fā)現(xiàn)，加之更多基因技術(shù)、生物信息領(lǐng)域?qū)＜液蜋C構(gòu)參與，希望能使我國免疫血液學在國際上發(fā)聲。

血液安全是輸血行業(yè)永恒的主題，利用基因技術(shù)預判或改進傳統(tǒng)技術(shù)方法與質(zhì)控都是保證實驗質(zhì)量的重要路徑。為避免人為的差錯，常規(guī)免疫血液學自動化技術(shù)領(lǐng)域也還在發(fā)展。臨床新的抗體藥物應(yīng)用，只要有與之相應(yīng)的抗原在血細胞表達都會干擾輸血相容性檢測，增加輸血風險。先進技術(shù)帶來更精確更安全的手段，現(xiàn)行的常規(guī)工作也還要自動化或和新方法等手段來保證常規(guī)輸血相容性檢測的準確性。輸血技術(shù)未來與現(xiàn)實的碰撞，理論與實踐的矛盾交互運動，必將催化免疫血液學的變革與發(fā)展。

（此文是橫斷面分析，避免不了掛一漏萬。感謝中國輸血協(xié)會免疫血液學委員會朱自嚴、姬艷麗、徐群等專家給予了很好的意見建議）

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突