權(quán)軍輝 張明剛 姜俠 韓梅寧

RHD-CE（2-9）-D屬融合基因[1，2]，為RHD基因的一種弱表現(xiàn)形式，常規(guī)血清學(xué)試驗(yàn)常將其鑒定為RhD-。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Rh血型系統(tǒng)D抗原抗原性強(qiáng)于E抗原[3-6]，理論上機(jī)體接受D抗原和E抗原免疫性刺激后產(chǎn)生的抗體常規(guī)應(yīng)該是抗-D強(qiáng)于抗-E。然而，我們臨床工作中遇到了抗-E（1∶512）強(qiáng)于抗-D（1∶64），與常規(guī)不符，探究詳情報(bào)道如下。

材料與方法

1 一般資料 63歲漢族女性，貧血入院，無輸血史，G6P3，長子出生1周夭折，此前三次妊娠均在60天左右不明原因流產(chǎn)，現(xiàn)一子（38歲）一女（34歲），均體健，血型均是O型RhD+，無黃疸等新生兒溶血病史。急診交叉配血發(fā)現(xiàn)其為O型RhD-，且主側(cè)不合。為明確原因做進(jìn)一步血清學(xué)實(shí)驗(yàn)、家系調(diào)查和PCR-SSP法RHD基因檢測(cè)。

2 試劑與儀器 凝聚胺介質(zhì)試劑（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：119032）；單克隆抗-A抗-B（長春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20180504），Rh（D）（IgM）（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：V194350），Rh（D）（IgG）抗血清（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：20181023）；抗體篩選細(xì)胞（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：20187010）；抗體鑒定譜細(xì)胞（sanquin，批號(hào)：8000247939）；Rh血型分型卡（江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：201806010）；抗人球蛋白卡（達(dá)亞美，批號(hào)：20180528）；血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)：180097）；人類紅細(xì)胞RHD基因分型試劑盒（PCR-SSP法）（天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號(hào)：SUPER008-002-011）；PCR擴(kuò)增儀（PE9700，美國Applied Biosystems公司）。

3 方法 生理鹽水法、聚凝胺法、抗人球蛋白法及微柱凝膠法等均參考第四版《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》，PCR-SSP法遵照人類紅細(xì)胞RHD基因分型試劑盒說明書。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

結(jié) 果

1 ABO及Rh血型鑒定 試管法顯示患者ABO血型為O型，正反定型相符。微柱凝膠卡法給出Rh系統(tǒng)血型為Ccdee。

2 交叉配血 緊急搶救時(shí)與庫存僅有的2 U O型RhD-懸浮紅細(xì)胞交叉配血結(jié)果為：鹽水法相合；抗人球蛋白法主側(cè)不合，次側(cè)和自身對(duì)照均陰性。重復(fù)交叉配血實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。對(duì)該獻(xiàn)血者紅細(xì)胞進(jìn)行Rh分型檢測(cè)，結(jié)果為ccdEe。用已知Rh分型為ccdee和ccDee的O型懸浮紅細(xì)胞分別與患者標(biāo)本做交叉配血試驗(yàn)，結(jié)果前者相合，后者不合，初步推斷患者血清中有Rh系統(tǒng)IgG類抗-D、抗-E產(chǎn)生。

3 抗體鑒定 患者血清與3個(gè)抗體篩選細(xì)胞在鹽水介質(zhì)中反應(yīng)均為陰性，在抗人球介質(zhì)中均顯示2+至4+凝集。為進(jìn)一步確認(rèn)抗體類型，將患者血清與16種譜細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果鹽水介質(zhì)下16種譜細(xì)胞均顯示陰性，抗人球蛋白微柱凝膠卡（表1）則提示存在抗-D、抗-E抗體。用聚凝胺法和抗人球蛋白法分別對(duì)抗體強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，均為抗-D效價(jià)為1∶64，而抗-E效價(jià)可達(dá)1∶512，明顯強(qiáng)于前者。

4RHD基因檢測(cè) 本研究采用PCR-SSP法對(duì)患者RHD基因進(jìn)行檢測(cè)，按試劑盒說明書對(duì)患者DNA進(jìn)行擴(kuò)增后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖1所示。根據(jù)試劑盒提供的格局表可知，只有Exon1和845G有條帶者可判斷其基因型為RHD-CE（2-9）-D型。

5 家系調(diào)查 患者的一子一女的ABO血型一致，均為O型；Rh血型也一致，為CcDee。

表1 抗體鑒定結(jié)果

討 論

圖1 患者RHD基因檢測(cè)電泳圖譜

Rh血型系統(tǒng)D抗原和E抗原分別由RHD基因和RHCE基因表達(dá)產(chǎn)生，二者高度同源，位于1號(hào)染色體p34，均由10個(gè)外顯子組成，編碼區(qū)總長為1 251 bp，編碼417個(gè)氨基酸組成的糖蛋白[7，9]。RHD基因型有完整型（22.96%）、部分缺失型（21.48%）和全缺失型（55.56%）三種[10]，完整型表達(dá)D抗原的全部位點(diǎn)，其抗原性也是最強(qiáng)的；全缺失型不表達(dá)D抗原，即Rh（D）陰性；部分缺失型是其中復(fù)雜多變的一種，其表達(dá)的D抗原抗原性有強(qiáng)弱無之分，也是易造成Rh（D）假陰性的基因類型，也稱為“D變異體”。RHD-CE（2-9）-D是中國人部分D主要等位基因，位于cDe或（和）CDe單倍體中，因其2-9外顯子被同源RHCE基因替換而不能編碼正常RHD蛋白，形成個(gè)體D抗原陰性表型[11]。

文獻(xiàn)報(bào)道RHD-CE（2-9）-D基因型屬于無效基因[12，14]，因?yàn)槠鋷缀醪槐磉_(dá)D抗原，即可能是Rh系統(tǒng)D基因被CE基因過多融合而僅能夠微弱表達(dá)常規(guī)血清學(xué)無法檢出的D抗原，所以攜帶RHD-CE（2-9）-D基因型患者在接受抗原性強(qiáng)于它所表達(dá)D抗原的外源性D抗原免疫性刺激后可能會(huì)產(chǎn)生弱抗-D抗體，即表達(dá)弱D抗原機(jī)體在被強(qiáng)D抗原免疫性刺激后亦會(huì)產(chǎn)生抗-D抗體，但抗體的強(qiáng)弱由融合基因表達(dá)抗原的免疫原性及機(jī)體接受免疫性刺激抗原的免疫原性共同決定。本病例中患者之所以會(huì)出現(xiàn)弱抗-D強(qiáng)抗-E的現(xiàn)象可能是：①其攜帶RHD-CE（2-9）-D基因D抗原的弱表達(dá)所致，亦可理解為病例中非常規(guī)抗-D、抗-E的產(chǎn)生與其攜帶的RHD-CE（2-9）-D基因密切相關(guān)。相關(guān)程度的研究本應(yīng)繼續(xù)基因測(cè)序試驗(yàn)，但遺憾的是因?qū)嶒?yàn)室條件所限，加之筆者初次做類似研究而經(jīng)驗(yàn)不足，標(biāo)本儲(chǔ)存量和時(shí)間均不合格，因此患者去世后測(cè)序試驗(yàn)無法進(jìn)行；②結(jié)合病史資料和家系調(diào)查結(jié)果分析，患者六次妊娠史中接受E抗原免疫性刺激的機(jī)會(huì)可能多于D抗原，即前四次懷的可能是D抗原陰性而E抗原陽性的胎兒；③患者RhCc表型所致，有報(bào)道稱Cc的存在有時(shí)能夠使抗-D形成減弱[15]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突