遲紅旭 江穎 姚歡 田靜 李玲玲 朱曉君 劉曉敏 張雷英 孫桂香 于洋

淋巴瘤為原發(fā)于免疫系統(tǒng)的實(shí)體腫瘤，其中霍奇金淋巴瘤與非霍奇金淋巴瘤的占比約為1:9。從病理學(xué)水平上劃分，非霍奇金淋巴瘤主要包括B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤以及NK細(xì)胞淋巴瘤，其中來(lái)源于B細(xì)胞的淋巴瘤占所有淋巴瘤的85%～90%[1]。目前，非霍奇金淋巴瘤的一線治療方案為化療，絕大部分的患者經(jīng)一線治療后可獲得治愈，但仍有20%～30%的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者經(jīng)化療后復(fù)發(fā)[2]。部分復(fù)發(fā)難治非霍奇淋巴瘤患者可通過(guò)自體移植獲得緩解，但大約有40%～50%的患者經(jīng)自體移植后仍然復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)難治非霍奇淋巴瘤患者預(yù)后不佳，總體反應(yīng)率（overall response rate，ORR）僅26%，中位生存期僅為6.3月[3]。

CAR-T療法（chimeric antigen receptor T-Cell immunotherapy），嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法，即通過(guò)血細(xì)胞分離機(jī)體外采集患者自身的外周血，通過(guò)基因編輯工程使患者T細(xì)胞表面攜帶有針對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原的特異性分子，靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的新型免疫療法，于2017年已獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療經(jīng)一線以及二線治療失敗后的復(fù)發(fā)難治非霍奇金淋巴瘤[4]。新型免疫療法的出現(xiàn)成為了復(fù)發(fā)難治非霍奇金淋巴瘤患者的福音?；颊咴谛蠧AR-T治療之前，由輸血科協(xié)助進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞采集，現(xiàn)將擬行單個(gè)核細(xì)胞采集的非霍奇金淋巴瘤患者以及健康供者采集前后的血細(xì)胞變化進(jìn)行分析，同時(shí)探討影響終產(chǎn)品單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量的因素以更好的提高采集效率。

資料與方法

1 一般資料 選取2019年3月1日～2019年10月31日，在輸血科進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞（MNC）采集的非霍奇金淋巴瘤患者23例及健康供者22例為研究對(duì)象。其中非霍奇金淋巴瘤Ⅰ/Ⅱ期患者6例；Ⅲ/Ⅳ期患者17例。研究對(duì)象的一般資料如表1所示。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①體重：女≥45 kg，男≥50 kg；②血壓：90/60 mmHg～160/100 mmHg；心率：60～100次/分；③一般狀況良好；④血常規(guī)：血紅蛋白：女≥110 g/L，男≥120 g/L，血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L；⑤心電圖各項(xiàng)參數(shù)檢測(cè)值在正常范圍；⑥凝血功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重心腦血管疾??；②活動(dòng)性癲癇；③臟器功能衰竭；④凝血功能障礙伴活動(dòng)性出血；⑤有嚴(yán)重的獻(xiàn)血反應(yīng)史或遲發(fā)型昏厥史；⑥暈厥；⑦采集前8 h行增強(qiáng)CT或增強(qiáng)核磁檢查；⑧采集前有腹瀉。

2 儀器與試劑 COM. TEC血細(xì)胞分離機(jī)（德國(guó)Fresenius公司）；抗凝劑（四川南格爾生物科技有限公司）血液保存液（Ⅰ）500 mL，其主要組分為枸櫞酸鈉、枸櫞酸、葡萄糖；0.9%氯化鈉注射液（華仁藥業(yè)股份有限公司）；血常規(guī)以及產(chǎn)品血常規(guī)均由SysmexXS-800i系列全自動(dòng)血液分析儀（Sysmex公司）進(jìn)行檢測(cè)。

3 采集參數(shù) 首先依據(jù)患者的血常規(guī)結(jié)果以及機(jī)器的采血效率計(jì)算所需循環(huán)血量，采血流速一般設(shè)置為60 mL/min，全血與抗凝劑的比例為1∶10；采集過(guò)程中根據(jù)患者的癥狀調(diào)整補(bǔ)鈣的量以及速度，以減輕或避免枸櫞酸鹽反應(yīng)（口唇麻木、四肢麻木、肌肉震顫或抽搐）；持續(xù)床旁心電監(jiān)護(hù)，密切關(guān)注患者一般生命體征，治療過(guò)程中每隔20 min記錄患者血壓、心率、呼吸頻率，如發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)及時(shí)上報(bào)臨床醫(yī)生。

4 檢測(cè)指標(biāo) 采用血細(xì)胞分析儀，檢測(cè)采集前后患者/供者外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)和終產(chǎn)品血細(xì)胞計(jì)數(shù)；記錄采集相關(guān)參數(shù)，包括采集時(shí)間、循環(huán)次數(shù)、單次循環(huán)量、總循環(huán)量、ACD用量、除去ACD的總循環(huán)量 、白膜泵出量、單次收集量、ACD：全血比值、流度；采集前/后單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)=采集前/后淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)+采集前/后單核細(xì)胞計(jì)數(shù)；終產(chǎn)品單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)=終產(chǎn)品淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)+終產(chǎn)品單核細(xì)胞計(jì)數(shù)。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Graphpad 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±SD）表示，多因素回歸分析法進(jìn)行多因素分析，篩出主要相關(guān)因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 非霍奇金淋巴瘤患者和健康供者的基本情況比較非霍奇金淋巴瘤供者和健康供者基本情況比較見(jiàn)表1。

2 采集過(guò)程中的采集參數(shù)情況 采集過(guò)程中非霍奇金淋巴瘤患者和健康供者采集參數(shù)見(jiàn)表2。

3 采集單個(gè)核細(xì)胞前后血細(xì)胞的變化

3.1 健康供者采集前后血細(xì)胞變化情況：行單個(gè)核細(xì)胞采集后，健康供者RBC、WBC、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、PLT均較采集前明顯下降（圖1）。其中，WBC和單核細(xì)胞較采集前平均下降約18%；RBC和PLT較采集前平均下降約20%；血紅蛋白較采集前平均下降約21%；淋巴細(xì)胞較采集前平均下降約24%。

3.2 非霍奇金淋巴瘤患者采集單個(gè)核細(xì)胞前后血細(xì)胞的變化：非霍奇金淋巴瘤患者行單個(gè)核細(xì)胞采集后，白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅細(xì)胞及血紅蛋白計(jì)數(shù)較采集前明顯下降（圖2A、2B、2C），但血小板計(jì)數(shù)較采集前無(wú)明顯變化（圖2D）。其中，白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白采集后較采集前下降約15%，淋巴細(xì)胞較采集前下降約16%，單核細(xì)胞較采集前下降約13%。

表1 兩組人群基本情況比較

表2 非霍奇金淋巴瘤患者和健康供者的采集參數(shù)比較 （ ±SD）

圖1 健康供者采集前后血細(xì)胞的變化情況

3.3 非霍奇金淋巴瘤患者與健康供者對(duì)比采集前后血細(xì)胞的變化：非霍奇金淋巴瘤患者采集單個(gè)核細(xì)胞前，白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)均較健康供者低（圖3A、3C），采集后非霍奇金淋巴瘤患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于健康供者（圖3B、3D）。

圖2 非霍奇金淋巴瘤患者采集前后血細(xì)胞的變化情況

圖3 非霍奇金淋巴瘤患者與健康獻(xiàn)血者采集前后血細(xì)胞的變化

3.4 影響終產(chǎn)品單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量的因素相關(guān)性分析：通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，采集前單個(gè)核細(xì)胞的數(shù)量、采集前白細(xì)胞計(jì)數(shù)、采集時(shí)間、白膜泵出量、單次收集量、循環(huán)次數(shù)、單次循環(huán)量、總循環(huán)量與終產(chǎn)品單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)明顯的線性相關(guān)。其中，隨著單次循環(huán)量的增加，終產(chǎn)品單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量（終產(chǎn)品單個(gè)核細(xì)胞濃度×終產(chǎn)品體積）呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；采集前MNC（包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）的數(shù)量、采集前白細(xì)胞計(jì)數(shù)、采集時(shí)間、白膜泵出量、循環(huán)次數(shù)、總循環(huán)量與終產(chǎn)品MNC數(shù)量呈現(xiàn)明顯的正向相關(guān)。而年齡、身高、體重、BMI、全身循環(huán)血量、流速與終產(chǎn)品MNC數(shù)量無(wú)明顯相關(guān)性。

3.5 影響終產(chǎn)品MNC數(shù)量的多元線性回歸分析：通過(guò)對(duì)影響終產(chǎn)品MNC數(shù)量的因素進(jìn)行多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)單次收集量、循環(huán)次數(shù)以及采集前MNC計(jì)數(shù)是影響終產(chǎn)品MNC計(jì)數(shù)的因素。回歸系數(shù)如表3所示，回歸方程為?=0.617a1+0.410a2+0.274a3，a1為單次收集量，a2為循環(huán)次數(shù)，a3為采集前MNC計(jì)數(shù)，回歸方程檢驗(yàn)的P＜0.05，顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 影響最終產(chǎn)品MNC計(jì)數(shù)的相關(guān)因素分析

表3 MNC采集的多元線性回歸分析

討 論

近年來(lái)，CAR-T療法在非霍奇金淋巴瘤中得到了廣泛應(yīng)用[5]。在進(jìn)行CAR-T治療之前，首先需要進(jìn)行MNC采集，從外周血中分離獲得富含MNC的細(xì)胞產(chǎn)品，經(jīng)體外活化，基因編輯修飾，體外擴(kuò)增，使T細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)與靶抗原特異性結(jié)合的抗體，從而以非

MHC（major histocompatibility complex）限制性的方式特異殺傷靶抗原[6]。經(jīng)血細(xì)胞分離機(jī)獲得的富含MNC產(chǎn)品中MNC的數(shù)量是保證CAR-T治療有效性的關(guān)鍵因素。我們選取了23名擬行CAR-T治療的非霍奇金淋巴瘤患者以及22名健康供者進(jìn)行MNC采集，分析采集前后的血細(xì)胞計(jì)數(shù)變化，為MNC采集機(jī)采條件提供依據(jù)，同時(shí)，總結(jié)影響終產(chǎn)品MNC數(shù)量的因素以更好的提高采集效率。

本研究的結(jié)果顯示，無(wú)論是健康供者還是非霍奇金淋巴瘤的患者，進(jìn)行MNC采集后，血細(xì)胞計(jì)數(shù)較采集前均會(huì)下降，健康供者血細(xì)胞下降幅度波動(dòng)于18%～24%，平均下降約21%（圖1）；非霍奇金淋巴瘤患者血細(xì)胞下降幅度波動(dòng)于13%～16%，平均下降約14.5%（圖2）。健康供者與非霍奇金淋巴瘤患者相比，采集MNC后血細(xì)胞水平下降幅度較大。采集完成后血細(xì)胞的下降幅度與采集前血細(xì)胞計(jì)數(shù)水平密切相關(guān)，采集前非霍奇金淋巴瘤患者血細(xì)胞計(jì)數(shù)水平明顯低于健康供者（圖3），因而健康供者完成MNC采集后血細(xì)胞的下降水平較非霍奇金淋巴瘤患者下降幅度大。該結(jié)果提示我們?cè)讷@得高質(zhì)量的MNC產(chǎn)品同時(shí)，為保障供者及患者的健康水平，采集前選擇外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)較高的供者進(jìn)行采集。

造成非霍奇金淋巴瘤患者血細(xì)胞計(jì)數(shù)水平明顯低于健康供者（圖3）的原因可能與入組的非霍奇金淋巴瘤患者皆為經(jīng)傳統(tǒng)一線治療失敗后的復(fù)發(fā)難治患者，行MNC采集前經(jīng)歷了多療程化療有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道[7]亦證實(shí)多療程的放化療會(huì)影響血細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此，非霍奇金淋巴瘤患者，采集MNC之前可進(jìn)行細(xì)胞動(dòng)員，促進(jìn)骨髓中的MNC釋放入血，以獲得更好的細(xì)胞產(chǎn)品。

為提高采集效率，保證產(chǎn)品質(zhì)量，將采集前的血細(xì)胞計(jì)數(shù)，采集過(guò)程中的參數(shù)設(shè)置與終產(chǎn)品MNC數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，采集前MNC計(jì)數(shù)＞2×109/L，白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞4×109/L（圖4A、4B），終產(chǎn)品中MNC計(jì)數(shù)較理想，該結(jié)果與國(guó)內(nèi)陸華等[8]報(bào)道較為一致。

張根玲等[9]研究發(fā)現(xiàn)在兒童造血干細(xì)胞自體采集的患者中，終產(chǎn)品MNC計(jì)數(shù)與采集前集落刺激因子動(dòng)員后的MNC數(shù)量有相關(guān)性。也有研究得出[10]終產(chǎn)品MNC計(jì)數(shù)與采集前WBC總數(shù)有關(guān)。本研究顯示采集前MNC與終產(chǎn)品MNC計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，而前期研究[11，12]發(fā)現(xiàn)終產(chǎn)品MNC與采集前淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)有相關(guān)性，分析原因可能是COM.TEC血細(xì)胞分離機(jī)是通過(guò)梯度密度離心方式將全血分離成不同的血液成分，通過(guò)界面探測(cè)器識(shí)別MNC進(jìn)行提取，而單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞等單一因素可能不會(huì)影響終產(chǎn)品MNC數(shù)量，但此結(jié)果需擴(kuò)大樣本量后進(jìn)一步證實(shí)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)采集者的身高、體重、BMI、全身循環(huán)血量不影響終產(chǎn)品MNC計(jì)數(shù)。除采集前血細(xì)胞計(jì)數(shù)外，機(jī)器參數(shù)設(shè)置也是影響外周血MNC細(xì)胞采集的主要因素。其中，隨著采集時(shí)間、白膜泵出量、單次收集量、循環(huán)次數(shù)、總循環(huán)量的增加，終產(chǎn)品中MNC細(xì)胞數(shù)也隨之增加（圖4C-G）。然而，單次循環(huán)量增加，終產(chǎn)品單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)并未增加，反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。單次循環(huán)血量控制在400～600 mL，即可獲得高濃度的細(xì)胞產(chǎn)品（圖4H）。單次收集量、循環(huán)次數(shù)以及采集前MNC細(xì)胞計(jì)數(shù)，三者之間互相制衡，共同影響最終產(chǎn)品中MNC細(xì)胞計(jì)數(shù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突