林放 周謀 單桂秋 李艷輝 李文丹

富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是全血經(jīng)離心后得到的一種血小板濃縮物，其中含豐富的生長(zhǎng)因子，在促進(jìn)創(chuàng)面愈合和抑菌抗炎中發(fā)揮著重要的作用。由于PRP的保存時(shí)間短，受環(huán)境因素影響容易被激活或污染，降低了其應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)PRP進(jìn)行凍干，能使PRP在常溫條件下保存，所占空間小，還便于運(yùn)輸。凍干PRP一般用貧血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）進(jìn)行復(fù)水化[1-3]，但使用前需要分離制備PPP，不僅操作繁瑣，對(duì)制備環(huán)境要求高，還有患血液傳染病的風(fēng)險(xiǎn)。為了讓凍干PRP復(fù)水化的步驟變得更簡(jiǎn)便、安全，本實(shí)驗(yàn)研究了不同成分的復(fù)水液，并對(duì)復(fù)水化后的凍干PRP活化和釋放生長(zhǎng)因子效果進(jìn)行比較?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

材料與方法

1 試劑和儀器

1.1 試劑：TGF-β1 ELISA試劑盒（RayBio，批號(hào)0615180188）、VEGF-A ELISA試劑盒（RayBio，批號(hào)0504180196）、PDGF-BB ELISA試劑盒（RayBio，批號(hào)0615180180）、bFGF ELISA試劑盒（RayBio，批號(hào)0608180107）、P-Selectin（RayBio，批號(hào)1026180217）、CD63（RayBio，批號(hào)1214182471）、生理鹽水（醫(yī)院自制，批號(hào)18041122）、PBS緩沖液（Thermo Fisher Scientific，批號(hào)8118177）、血細(xì)胞分析儀用溶血?jiǎng)ㄉ钲谶~瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，批號(hào)2017122401）、血細(xì)胞分析用稀釋液（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，批號(hào)2018033102）等。

1.2 儀器：酶標(biāo)儀（賽默飛世爾（上海）儀器有限公司，型號(hào)Multiskan Mk3）、血細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號(hào)BC-3000 plue）、超純水機(jī)（廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司，型號(hào)Unique-S）、真空冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司，型號(hào)Alpha1-4lsc Plus）等。

1.3 富血小板血漿來源：來自2018年8月在南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院血液中心獻(xiàn)血的健康無償獻(xiàn)血者，獻(xiàn)血前3日未服用阿司匹林或阿司匹林類藥物，并進(jìn)行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP等輸血相關(guān)性傳染病檢測(cè)。用ACD五聯(lián)血小板采集袋采集8人份O型全血（400 mL），匯集成1份血小板，6 h內(nèi)采用白膜法制備濃縮血小板，并調(diào)節(jié)匯集血小板計(jì)數(shù)至800×109/L，（22±2）℃振蕩搖床過夜，使其解聚。

2 方法

2.1 血小板凍干預(yù)處理液的配制：精確稱量NaCl 3.214 g，KCl 0.157 g，CaCl20.078 g，MgSO40.271 g，NaHCO32.604 g，檸檬酸 0.714 g，檸檬酸鈉1.970 g，乙酸鈉1.230 g，葡萄糖2.120 g，海藻糖17.117 g，用超純水溶解，定容至1 L。加入1 μl/mL可逆性血小板激活抑制劑PGE1，調(diào)節(jié)pH至6.6～6.8，0.22 μm濾器過濾。

2.2 凍干緩沖液配制：在上述血小板凍干預(yù)處理液中加入30%蛋白質(zhì)類保護(hù)劑，3 000 r/min離心20 min，移出上清，調(diào)pH為6.6～6.8，0.22 μm濾器過濾。

2.3 血小板凍干前預(yù)處理：將匯集血小板，3 000 r/min離心20 min，移上清留沉淀，用與移去上清同體積的預(yù)處理液重懸血小板，37℃振蕩水浴4 h，使血小板保持懸浮狀態(tài)。水浴后，將血小板懸液再以3 000 r/min離心20 min，棄上清留沉淀，用與棄去上清同體積的凍干緩沖液重懸血小板。

2.4 血小板懸液凍干：將預(yù)處理后血小板懸液轉(zhuǎn)移到凍干瓶（硅化玻璃瓶）中，每瓶4 mL（厚度不超過1.5 cm），置于-80℃超低溫冰箱中預(yù)凍過夜，次日先將凍干機(jī)打開，使冷阱溫度降至-46℃后，將凍干樣品從冰箱取出移入凍干機(jī)并開始進(jìn)行真空干燥，保持真空度為＜133 mbar，真空干燥24 h后取出，密封后置于室溫干燥處保存。

2.5 凍干PRP復(fù)水化及激活：按復(fù)水液的種類，將實(shí)驗(yàn)分成生理鹽水組、超純水組和PBS緩沖液組，將PPP復(fù)水液設(shè)為對(duì)照組。凍干PRP分別用4 mL的PPP、生理鹽水、蒸餾水和PBS緩沖液進(jìn)行一步法復(fù)水，使其體積與凍干保存前血小板懸液相同體積，輕輕振蕩搖勻至凍干粉完全溶解。

凍干PRP完全復(fù)水化，將200 U凝血酶凍干粉溶于2 mL的葡萄糖酸鈣注射液中，置37℃水浴30 min，充分激活后以3000 r/min離心20 min，分裝上清至EP管中待檢[4，5]。

2.6 復(fù)水后PRP凝血功能和生長(zhǎng)因子含量檢測(cè)：按照分組，對(duì)凍干PRP進(jìn)行復(fù)水化，并用ELISA法檢測(cè)復(fù)水后PRP中P-Selectin（P-選擇素）、CD63、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor VEGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子I（insulin-like growth factor-I，IGF-I）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）、血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的含量，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒提供的說明書進(jìn)行操作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組別的比較，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），當(dāng)方差齊時(shí)，進(jìn)一步采用LSD分析結(jié)果，當(dāng)方差不齊時(shí)，Dunnett T3分析結(jié)果，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 復(fù)水后PRP理化性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果 由圖1可見，PPP、生理鹽水和PBS緩沖液可以將凍干PRP復(fù)水化成液體，但用超純水復(fù)水化的凍干PRP有較多絮狀物，離心后立即凝集成凝膠。

2 復(fù)水后PRP凝血功能和生長(zhǎng)因子含量檢測(cè)結(jié)果 各組凍干PRP復(fù)水后，我們用ELISA法檢測(cè)了P-Selectin、CD63、PDGF-BB、TGF-β1、VEGF、EGF、IGF-I 及FGF-b的含量。由表1可知：P-Selectin、VEGF-A含量：生理鹽水組、超純水組和PBS緩沖液組均高于PPP組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CD63含量：生理鹽水組高于PPP組，超純水組和PBS緩沖液組均低于PPP組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。IGF-I含量：生理鹽水組、超純水組和PBS緩沖液組均低于PPP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。bFGF、PDGF-BB、TGF-1β含量：生理鹽水組、超純水組和PBS緩沖液組均低于PPP組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 凍干PRP復(fù)水化后外觀

表1 各組凍干PRP復(fù)水化后生長(zhǎng)因子含量

討 論

PRP對(duì)急、慢性創(chuàng)面都有良好的促進(jìn)愈合和抗感染功能，在臨床上廣泛使用。PRP制備后，需立即使用，且無法長(zhǎng)期保存，因此在臨床推廣受到了一定的限制，將血小板進(jìn)行凍干，可解決血小板只能短期保存的缺點(diǎn)[6]。凍干后的血小板，常溫下可長(zhǎng)期保存，質(zhì)量輕，方便攜帶，需要時(shí)使用復(fù)水液進(jìn)行復(fù)水化，即可使用。本實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步驗(yàn)證PRP凍干后的效果，使用的是一年前凍干并常溫保存的凍干PRP。

貧血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）是目前普遍使用的凍干PRP復(fù)水液[7-10]，使用前需要分離制備，血漿有污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此對(duì)制備環(huán)境要求較高，加上血液有窗口期，使用PPP進(jìn)行復(fù)水化，也增加了患血液傳染病的風(fēng)險(xiǎn)。生理鹽水是一種生理學(xué)實(shí)驗(yàn)或臨床上常用的滲透壓與動(dòng)物或人體血漿的滲透壓基本相等的氯化鈉溶液；超純水是蒸餾、去離子化、反滲透技術(shù)生產(chǎn)出來的水，無礦物質(zhì)微量元素和細(xì)菌、病毒、含氯二噁英等有機(jī)物；PBS緩沖液是一種磷酸鹽緩沖液，起溶解保護(hù)試劑的作用，主要成分為Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl[11]。雖然臨床上已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)PPP做為復(fù)水液，血小板的回收率最高[12]，但以上三種溶液和PPP相比，有來源安全、沒有血液傳染病和使用時(shí)不需制備等優(yōu)點(diǎn)。為此，本實(shí)驗(yàn)將生理鹽水、超純水和PBS緩沖液作為凍干PRP的復(fù)水液，并以PPP作為對(duì)照，探討用其他溶液代替PPP作為凍干PRP復(fù)水液的可靠性。

P-Selectin是血小板活化的特異性標(biāo)志物[13]，CD63是活化血小板表面的抗體，反映體內(nèi)血小板活化程度[14]，這兩個(gè)指標(biāo)都與相應(yīng)血小板體內(nèi)存活率和存活期呈負(fù)相關(guān)[15]。為此，我們選擇了其作為檢測(cè)復(fù)水化后血小板功能的檢測(cè)指標(biāo)，探討不同復(fù)水液對(duì)血小板凝血功能的影響。本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果顯示，生理鹽水、超純水和PBS緩沖液作為復(fù)水液，P-Selectin和CD63的數(shù)值稍高于PPP，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說明這三種復(fù)水液在復(fù)水化的過程中，血小板被激活的程度略高于PPP，但在血小板的聚集反應(yīng)和促凝血活性功能上與使用PPP復(fù)水后無差異。

VEGF-A、IGF-1、bFGF、PDGF-BB、TGF-1β這五種生長(zhǎng)因子是PRP中含量較高的生長(zhǎng)因子，為此我們將其作為檢測(cè)指標(biāo)，探討各種復(fù)水液對(duì)釋放生長(zhǎng)因子效果的影響。本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果顯示，三種復(fù)水液的生長(zhǎng)因子含量均低于PPP組，除IGF-I含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余四種生長(zhǎng)因子的含量與PPP組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明，這三種復(fù)水液的釋放生長(zhǎng)因子效果并不差于PPP，更不影響凍干PRP在后續(xù)使用時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管形成和細(xì)胞外基質(zhì)沉積的作用。但我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，超純水作為復(fù)水液，會(huì)迅速激活凍干PRP中的血小板，使復(fù)水化后的PRP形成了凝膠狀，無法進(jìn)行下一步的制備或注射，其原因還需進(jìn)一步研究。

從上述的結(jié)果我們初步可知，生理鹽水、超純水和PBS緩沖液作為凍干PRP的復(fù)水液，在凝血和促進(jìn)創(chuàng)面愈合的功能上，并不差于PPP，均可替代PPP。但超純水會(huì)將凍干PRP復(fù)水化成凝膠，因此本實(shí)驗(yàn)初步確定生理鹽水和PBS緩沖液都是凍干PRP的較理想的復(fù)水液，但對(duì)血小板功能活性的影響還需要進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突