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        遼寧省北鎮(zhèn)市葡萄葉斑病的病原鑒定

        2021-04-30 19:49:26劉梅王彩霞燕繼曄賈靜怡李興紅
        植物保護 2021年2期

        劉梅 王彩霞 燕繼曄 賈靜怡 李興紅

        關鍵詞葡萄;葉斑病;多基因系統(tǒng)發(fā)育;平頭炭疽菌

        葡萄為葡萄科葡萄屬落葉藤本植物,原產于歐洲和亞洲西部,是世界上種植面積最大的水果之一。我國葡萄產量和種植面積長期位居世界前列。在葡萄栽培過程中,有時會在葉片上出現(xiàn)由真菌侵染形成的大小形狀不一的斑點,具有傳染性,造成葉片局部壞死甚至整片枯黃脫落,對葡萄生產造成不利影響。

        目前國內外已經報道的葡萄真菌性葉斑病主要有褐紋病、大褐斑病、小褐斑病、輪斑病、殼針孢葉斑病、環(huán)紋葉枯病、假尾孢葉斑病和尾孢葉斑病、角斑葉焦病、葉枯病、黑痣病、枝孢葉斑病,Neopestalotiopsis vitis、Cladosporium hebeiense引起的葡萄葉斑病,以及由鏈格孢Alternaria alternata、葡萄鏈格孢A viniferae和喬木鏈格孢A.arborescens引起的葡萄葉斑病等。近年來遼寧北鎮(zhèn)葡萄上出現(xiàn)葉斑病癥狀,表現(xiàn)為葉上出現(xiàn)圓形或橢圓形小黑斑,病斑周圍褪綠變黃,影響葉片功能,進而影響果實產量和品質。

        為明確引起該病害的病原菌,對病樣進行分離培養(yǎng),采用多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結合形態(tài)學特征對分離得到的病原菌進行鑒定,以期為該葡萄葉斑病的發(fā)生和防治提供參考。

        1材料與方法

        1.1材料

        供試病樣及寄主:從遼寧北鎮(zhèn)采集出現(xiàn)圓形或橢圓形小型黑色病斑、周圍出現(xiàn)褪綠變黃的葡萄葉斑病病葉15片,帶回實驗室進行組織分離。致病性測定所用‘夏黑葡萄葉片采自北京葡萄與葡萄酒工程技術研發(fā)中心。

        馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20g、瓊脂15~18g,加水定容至1000mL,121℃高壓蒸汽滅菌20min。

        試劑及儀器:十六烷基三甲基溴化銨(cetyltri-methylammoniumbromide,CTAB),美國Amresco公司;2×Taq Master Mix和DNA Marker,北京博邁德基因技術有限公司;其他試劑均為國產分析純。Axio Imager Z2顯微鏡,德國Carl Zeiss公司;Bio-Rad Gel DocTM XR+凝膠成像儀、C1000 TouchTMThermal Cycler PCR儀,美國Bio-Rad公司;Ep-pendorf AG 5424離心機,德國Eppendorf公司。

        1.2方法

        1.2.1病原菌的分離與純化

        采用常規(guī)組織分離法對具有典型癥狀的葉片進行分離。首先在病健交界處剪取邊長為5mm的方形組織,用75%乙醇消毒30 s,無菌水清洗3次,晾干后置于PDA平板上,將培養(yǎng)皿置于25℃、L//D=12 h//12h條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),采用單孢分離法進行菌種純化,將純化菌株編號為JzB330152,并在4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2病原菌的分子生物學鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

        采用CTAB法提取菌株的基因組DNA。分別利用rDNA轉錄問隔區(qū)ITS通用引物ITS-4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)/ITS-5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3)、3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH基因的引物GDF(5'-GC-CGTCAACGAATIGA-3)幾丁質合酶CHS-1基因的引物CHS-79F(5,-TGGGGCAAG-GATGCTTGGAAGAAG-3)CHS-345R(5-TG-GAAGAACCATCTGTGAGAGTTG-3)、肌動蛋白ACT基因的引物ACT-512F(5,-ATGTG-CAAGGCCGGTTTCGC-3)/ACT-783R(5-TAC-GAGTCCTTCTGGCCCAT-3)微管蛋白TUB2基因的引物BT-2F(5,-GTBCACCTYCAR-ACCGGYCARTG-3')/BT-4R(5-CCRGAYTGRC-CRAARACRAAGTTGTC-3)進行PCR擴增,引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成,PCR產物送至北京博邁德基因技術有限公司進行測序。在NCBI上對測序結果進行BLAST比對分析,在GenBank中下載相關參考序列,利用MAFF)對所有序列進行比對,利用BioEdit 7.0.9.0軟件進行多基因序列整合,而后利用ALTER軟件將文件格式轉換成nexus格式。最后將序列載人PAUP 4.0b10軟件中,用最大簡約法(maximumparsimony,MP)構建系統(tǒng)發(fā)育樹并進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

        1.2.3形態(tài)學觀察

        將純化后的菌株在PDA平板上于28℃、L//D=12 h//12h的條件下培養(yǎng)7~10 d,觀察記錄菌落形態(tài)如形狀、顏色、質地等。在顯微鏡下觀察分生孢子、分生孢子盤的形態(tài)特征并測量分生孢子大小,共測量30個分生孢子。

        1.2.4致病性測定

        選取健康成熟的‘夏黑葡萄葉片,用1%NaCl0表面消毒30 s,無菌水清洗3次,吹干備用。將純化后的菌株在PDA平板上培養(yǎng)7d,用血球計數(shù)法配制濃度為1×10個/mL的孢子懸浮液備用。采用滴接法對離體葉片分別進行刺傷和無傷接種。每片葉4個接種點,于主葉脈兩側各2個且對稱,一側刺傷接種,另一側無傷接種,每點接種孢子懸浮液20μL,共處理9片葉,重復3次,以無菌水為空白對照。接種后將葉片置于25℃、相對濕度90%下進行黑暗培養(yǎng)24h,之后在相對濕度65%、光周期L//D=12h//12h條件下培養(yǎng)。觀察并記錄葉片的發(fā)病情況,接種部位出現(xiàn)褐色病斑即為開始發(fā)病,直至出現(xiàn)與田間相似的癥狀時對病斑再次進行組織分離,觀察分離物與接種菌株的形態(tài)特征,完成柯赫氏法則驗證。

        2結果與分析

        2.1病原菌的分子生物學鑒定

        利用ITS、GAPDH、CHS-1、ACT與TUB2共5個基因序列對所得菌株進行PCR特異性擴增,分別得到長度為528、290、249、272 bp和497 bp的片段,以Colletotrichum lindemuthianum CBS144.31作為外群經MP法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果顯示:JZB330152與平頭炭疽菌Colletotrichum truncatum(CBS 151.35)聚在同一支上,自展支持率為100%(圖1)。

        2.2病原菌的形態(tài)學特征

        PDA培養(yǎng)基上病原菌菌落圓形,邊緣整齊,菌絲較稀疏,緊貼培養(yǎng)基生長,初期菌落邊緣為白色,中心為淺灰色,后期菌落顏色變?yōu)樯詈稚?分生孢子盤黑色堆狀突起;分生孢子呈無色,無分隔,新月或鐮刀形,兩頭鈍尖,大小為(15.32~28.51)μm×(3.33~6.62)μm。依據(jù)形態(tài)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析,將葡萄葉斑病的病原菌鑒定為平頭炭疽菌Colleto-trichum truncatum(圖2)。

        2.3致病性測定

        無傷和刺傷接種‘夏黑葡萄葉片,接種后3d均開始發(fā)病,7d病斑逐漸向周邊擴展,病斑顏色變深,成暗褐色。對照葉片未發(fā)病。對發(fā)病葉片再次進行組織分離,分離物與原始分離菌株一致,完成柯赫氏法則驗證(圖3)。

        3討論

        本研究對采自遼寧省北鎮(zhèn)市的感病葡萄葉片進行了病原菌的分離純化、形態(tài)鑒定、致病性測定及柯赫氏法則驗證。并對病原菌的ITS、GAPDH、CHS-1、ACT與TUB2基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析,結果顯示,病原菌與平頭炭疽菌Colletotrichum trun-catum模式菌株CBS 151.35聚在同一支上,且自展支持率為100%,結合形態(tài)學特征將引起葡萄葉斑病的病原菌鑒定為C truncatum。

        在葡萄的栽培中,炭疽病是一種重要的常見病害,主要為害葡萄果實,一般造成葡萄減產10%~20%,日本、澳大利亞等國家報道引起葡萄果實炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌C gloeosporioides和(或)尖孢炭疽菌C acutatum,國內報道引起葡萄炭疽病的病原菌有膠孢炭疽菌、C viniferum、C fructicola以及C aenigma和C hebeiense,2016年筆者在湖北發(fā)現(xiàn)引起‘紅地球葡萄嫩梢枯死。目前在我國,平頭炭疽菌可危害番茄、火龍果、南瓜等,但平頭炭疽菌侵染葡萄僅在瑞士有過報道,我國尚未見相關的研究報道。

        據(jù)調查,在北鎮(zhèn)由炭疽病菌引起的葡萄葉斑病在夏季雨季過后發(fā)病嚴重,說明炭疽病的發(fā)生與雨水關系密切,高溫高濕的環(huán)境有利用于病原菌的生長,因此在病害易發(fā)生的季節(jié)應加強果園管理,及時清除病葉,避免通風不良、澆水過多的情況發(fā)生,病害發(fā)生嚴重時,需選擇合適的殺菌劑進行防治。Greer等的研究顯示,膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌在侵染特性和對殺菌劑的敏感性方面表現(xiàn)不同。尖孢炭疽菌侵染速度快于膠孢炭疽菌,并且對克菌丹、三環(huán)唑的敏感性要顯著高于尖孢炭疽菌。而膠孢炭疽菌對苯菌靈的敏感性要高于尖孢炭疽菌。鄧維萍等的報道也證實了這點。因此需對平頭炭疽菌對殺菌劑的敏感性進行測定,以篩選出高效、安全的藥劑投入到葡萄葉斑病的防治中,結合農業(yè)栽培、生物防控等多種措施,構建完善的綜合防控技術體系,防控病害的進一步發(fā)生和蔓延。

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