郭恒 趙義濤 鄭海霞 張仙紅

關鍵詞玫煙色棒束孢;復壯;毒力;產孢量

蟲生真菌是一類重要的昆蟲病原微生物，但經多次繼代培養(yǎng)后，常常會發(fā)生菌落顏色、生長形式等的變化，特別是產孢能力下降甚至喪失，進而導致蟲生真菌的毒力大幅度降低，這種表型退化、表型不穩(wěn)定、表型惡化、雙重表型、突變和衰變均可稱為菌株退化。蟲生真菌退化的原因多種多樣，據樊美珍報道，菌株本身遺傳物質改變及培養(yǎng)基成分和環(huán)境條件的影響可導致菌株退化;李琳等通過比較轉錄組學研究發(fā)現，綠僵菌中一些參與脅迫響應和衰老的相關基因在退化菌株中顯著上調，推測退化菌株表現為老化現象，發(fā)現活性氧（ROS）引起的線粒體損傷是導致菌株退化的機制之一;此外，轉座子隨機插入，真菌雙鏈RNA病毒的入侵或者染色體的缺失等均可導致菌種退化。但這些原因都不能很好地解釋真菌退化的頻率遠遠超過這些事件發(fā)生的概率，且不同菌株退化頻率也不盡相同，因此人們嘗試通過多種方法恢復菌種原有性狀。

蟲生真菌頻繁發(fā)生的菌種退化，成為其大規(guī)模生產應用所面臨的重要問題，也為菌種保藏工作帶來很大的困難。研究表明，蟲生真菌可采用蟲尸接種、宿主感染、培養(yǎng)基分離、培養(yǎng)基添加外源營養(yǎng)物質等方法復壯。如鄒東霞等采用馬尾松毛蟲Dendrolimus punctatus Walker蟲尸對球孢白僵菌Beauveria bassiana（Bals.-Criv.）Vuill.BD-10-4菌株進行了復壯;馬元偉等通過培養(yǎng)基中添加外源氨基酸對羅伯茨綠僵菌Metarhizium robertsii J.F.Bisch.S.A.Rehner&Humber ARSEF2575菌株進行了復壯，并有效延緩了蛹蟲草Cordycepsmilitaris Link 01菌株的退化;Bult等研究發(fā)現經過大蠟螟Galleria mellonella Linnaeus和黃粉蟲Tenebrio molitor Linnaeus 2種易感菌寄主回接的金龜子綠僵菌M.anisopliae（Metschn.）Sorokin菌株毒力比人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)的顯著增強;李亞潔等[6]采取組織分離、孢子分離對蛹蟲草進行了復壯等。

玫煙色棒束孢Wize屬蟲草菌科棒束孢屬，可寄生8目40多種昆蟲，尤其對蚜蟲、粉虱等刺吸式口器害蟲有很強的致病力，所以在害蟲生物防治中有著非常重要的作用。目前，國內外對玫煙色棒束孢的研究報道主要集中在生物學、分類鑒定、致病力測定、致病機理、防治應用等方面，對菌株的復壯或預防菌株退化方面的研究鮮有報道。為此，本試驗采用培養(yǎng)基添加外源營養(yǎng)物質的方法對玫煙色棒束孢退化菌株進行復壯，旨在探尋簡便而有效的復壯方法，為玫煙色棒束孢的規(guī)?；a和開發(fā)利用提供生產用菌株。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

玫煙色棒束孢菌株PF904為山西農業(yè)大學農學院農業(yè)害蟲防治研究室經多次轉接后退化的菌株。

1.1.2供試培養(yǎng)基

本試驗所用培養(yǎng)基及配方見表1。

1.2方法

1.2.1菌株復壯

將供試菌株分別接種于上述5種培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7d后轉接至相同的新培養(yǎng)基上，共轉接10代。每代每種均重復3次，測定數據取平均值。

1.2.2菌株生長量測定

使用電子游標卡尺在培養(yǎng)皿上以十字交叉法，對不同培養(yǎng)基上的菌落直徑進行測量，每代培養(yǎng)至14 d時記錄數據。

1.2.3菌株產孢量測定

將培養(yǎng)好的菌株，利用直徑為7mm的打孔器在固體平板培養(yǎng)基上菌落的中央至邊緣1/2處打孔取樣，放人有10 mL 0.05%吐溫-80無菌水中，使用渦旋振蕩儀將孢子充分洗脫混勻，然后用滅菌紗布過濾。利用血球計數板計數測量，換算成單位面積的孢子產量。每種培養(yǎng)基各取3個平板作為重復。

1.2.4室內毒力測定

將培養(yǎng)好的菌落，用10mL 0.05%吐溫-80無菌水洗脫適量孢子，分別制成孢子含量為107個/mL的孢子懸浮液，采用浸蟲法進行室內毒力測定。選取生長一致的小菜蛾3齡幼蟲，浸入孢子懸浮液中10s后取出，用濾紙吸去蟲體上多余的菌液，然后放入有甘藍葉片的9cm無菌培養(yǎng)皿中，每皿20頭，保持皿內濕度。各試驗處理重復3次，并用0.05%的吐溫-80溶液作為對照處理。連續(xù)觀察7d，記錄死亡蟲數，并將死亡的蟲體挑出，保濕培養(yǎng)，死亡蟲體變僵硬并長出菌絲視為有效感染死亡，并計算校正死亡率。

校正死亡率=（處理死亡率一對照死亡率）/（1-對照死亡率）×100%。

1.2.5恢復比例測定

試驗過程中對菌株產孢量以及毒力兩項指標的恢復情況進行比較，并取測定數據的平均值分別計算得出相應恢復比例。試驗共復壯培養(yǎng)10代，每培養(yǎng)5代測定一次，分別在第5代和第10代測量2次。

復壯培養(yǎng)至第5代時產孢量及毒力恢復比例：

恢復比例第5代菌株測定值一初始菌株測定值/初始菌株測定值。

復壯培養(yǎng)至第10代時產孢量及毒力恢復比例：

恢復比例第10代菌株測定值一第5代菌株測定值第5代菌株測定值。

1.2.6數據處理

試驗數據均使用IBM SPSS Statistics 20.0軟件和Excel 2010軟件進行分析處理。

2結果與分析

2.1玫煙色棒束孢菌落形態(tài)的變異

隨著傳代次數的增多，PDA上培養(yǎng)的玫煙色棒束孢菌落濃密的同心圓紋逐漸消失，有的菌落產生扇形條紋，且伴有菌落質地變疏松、稀薄，孢子層變薄的現象，菌落顏色逐漸失去原有的淺粉色而變?yōu)榘咨?，菌落形態(tài)也由絨毛狀變?yōu)樾鯛?。但在復壯培養(yǎng)基上這些現象只在前5代偶有發(fā)生，且氣生菌絲生長較PDA培養(yǎng)基少，說明添加營養(yǎng)物質的復壯培養(yǎng)基對于延緩和預防菌株退化變異具有一定的作用。

2.2不同培養(yǎng)基對玫煙色棒束孢菌落生長的效果

通過對培養(yǎng)14d后的玫煙色棒束孢菌落直徑的對比發(fā)現，甲殼素培養(yǎng)基上的菌落生長速率較快且穩(wěn)定，從第4代開始與對照PDA培養(yǎng)基具有顯著性差異，從第6代開始與其前4代具有顯著性差異，培養(yǎng)至10代時菌落直徑最大，達69.33mm，各代平均為65.39mm。其次是蠶蛹培養(yǎng)基，從第4代開始與其第2代具有顯著性差異，但之后6代生長速率變慢，各代平均為63.18mm。綜合培養(yǎng)基上的生長速率也較為穩(wěn)定，但復壯過程中，每2代之問直徑變化幅度較小，14d時菌落直徑為59.22～64.45mm，平均為61.55mm，波動較小。蟬蛻培養(yǎng)基上菌落的生長速率代際間不穩(wěn)定，在復壯過程中生長時快時慢，直徑范圍在60.38～66.51mm之間（表2）。總體上每種培養(yǎng)基上的菌落直徑均隨傳代次數的增加而逐漸增加，菌絲生長量也增大，其中甲殼素培養(yǎng)基對菌落生長具有明顯的促進作用，具體原因還需進一步研究。

2.3玫煙色棒束孢在不同培養(yǎng)基上的產孢量

4種不同培養(yǎng)基復壯后玫煙色棒束孢的產孢量如圖1所示。從第2代開始經4種培養(yǎng)基復壯后的菌株，產孢量與初始菌株具有顯著性差異。經蠶蛹培養(yǎng)基復壯的菌株，產孢量恢復效果最好，在復壯培養(yǎng)過程中產孢量一直處于最高水平，從第8代開始與其他3種培養(yǎng)基產孢量均具有顯著性差異，連續(xù)復壯10代后，菌株產孢量可達1.73×10個/cm2，提升3倍之多。綜合培養(yǎng)基上的產孢量僅次于蠶蛹培養(yǎng)基，始終與甲殼素培養(yǎng)基和蟬蛻培養(yǎng)基的產孢量具有顯著性差異，連續(xù)復壯培養(yǎng)10代后，綜合培養(yǎng)基產孢量為1.58×10個/cm2。甲殼素培養(yǎng)基復壯的效果次之，單位面積產孢量為1.33×10個/cm2。效果較差的是蟬蛻培養(yǎng)基，復壯10代后與其他3種培養(yǎng)基均具有顯著性差異，產孢量僅為初始菌株的2.6倍。

2.4玫煙色棒束孢在不同培養(yǎng)基上的毒力

復壯后的玫煙色棒束孢菌株對小菜蛾幼蟲的致死中時（LT50）和校正死亡率如表3所示。小菜蛾幼蟲接種不同培養(yǎng)基復壯的菌株后，第3天幼蟲出現死亡，對照也有個別幼蟲死亡，第4天開始有僵蟲出現，死亡率隨著接種時問逐日遞增，各菌株侵染7d后，大部分幼蟲死亡，個別結繭化蛹。

如表3所示，4種復壯培養(yǎng)基均表現出明顯的復壯效果，致死中時（LT50）均顯著小于初始菌株，其中，甲殼素培養(yǎng)基復壯的菌株毒力恢復效果最好，連續(xù)復壯10代后，菌株對小菜蛾的致死中時由初始菌株的5.86 d下降為3.32d，與其他3種培養(yǎng)基均具有顯著性差異，校正死亡率也具有顯著性差異，在第7天的累積校正死亡率達82%以上;其次是綜合培養(yǎng)基復壯，LT50第10代下降為3.53 d，在處理后第7天累積校正死亡率也達76%以上;蟬蛻培養(yǎng)基毒力恢復效果次之;效果最差的是蠶蛹培養(yǎng)基，復壯菌株對小菜蛾幼蟲的LT50和校正死亡率與其他3種培養(yǎng)基復壯的菌株相比均具有顯著性差異，且復壯10代后，第7天的累積校正死亡率僅為68.26%。

2.5玫煙色棒束孢在不同培養(yǎng)基上產孢量及毒力恢復比例

比較菌株經4種培養(yǎng)基復壯10代后，菌株產孢量和毒力（致死中時LT50）的恢復比例如表4所示。玫煙色棒束孢菌株在經過不同培養(yǎng)基復壯后，菌株的產孢量和毒力均有大幅提高，總體趨勢呈現復壯1～5代恢復比例較高，5～10代恢復比例有所下降。經10代復壯，甲殼素培養(yǎng)基恢復比例較為穩(wěn)定，下降速率比其他3種培養(yǎng)基低，恢復效果較穩(wěn)定。而蠶蛹培養(yǎng)基兩項指標的恢復比例均在培養(yǎng)過程中下降幅度較大。

在產孢量方面，初始菌株經過蠶蛹培養(yǎng)基5代復壯后，恢復比例可達126.8%，之后5代的恢復比例下降為87.4%，但與其他復壯培養(yǎng)基恢復比例相比均為最高值。在毒力方面，初始菌株經過甲殼素培養(yǎng)基5代復壯后，恢復比例為25.77%，之后5代復壯恢復比例僅下降為23.68%，與其他復壯培養(yǎng)基恢復比例相比也均為最高值。

3結論與討論

3.1產孢量

蟲生真菌菌株的產孢量是衡量菌株活力的重要指標之一。菌株具有較高的產孢量和高質量的孢子是其可以應用于大規(guī)模生產的必備條件。據報道，培養(yǎng)基是影響微生物生長和繁殖的重要因素之一，即營養(yǎng)對菌株生長和產孢有很大影響，若不能滿足菌落生長的營養(yǎng)條件，許多菌株就不能生長或產孢。浦靜等研究發(fā)現，培養(yǎng)基中以麥芽糖為碳源可能更利于玫煙色棒束孢菌株產孢;此外培養(yǎng)基中添加適量的動物性氮源也有助于菌株產孢。本試驗結果表明，添加含氮量較高的動物性氮源蠶蛹粉的培養(yǎng)基使供試菌株的產孢量恢復最好，其次是綜合培養(yǎng)基和甲殼素培養(yǎng)基復壯，蟬蛻培養(yǎng)基復壯效果最差。這可能和培養(yǎng)基中動物性氮源含量有關，具體原因有待進一步探索。

3.2毒力

蟲生真菌菌株的毒力是衡量菌株應用潛力的重要指標。蔡國貴等研究發(fā)現，菌株在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長相對穩(wěn)定，在營養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基中生長則容易變異，不同培養(yǎng)基通過影響菌株酶的表達水平引起菌株毒力的變化;李會平等研究發(fā)現，白僵菌菌株產酶能力與其對桑天牛幼蟲的毒力呈正相關關系，培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件會影響菌株的產酶能力，進而影響菌株毒力。甲殼素粉中蘊含的磷脂與蛋黃素可促進分生孢子的萌發(fā)和有效侵染，且穩(wěn)定甚至增強菌株毒性。本結果發(fā)現，供試菌株經甲殼素培養(yǎng)基復壯后對小菜蛾幼蟲毒力恢復效果最好，這可能是因為玫煙色棒束孢菌株在吸收其營養(yǎng)后，能較好地誘導菌株產生幾丁質酶，并增強了該酶的活性有關。

3.3恢復比例

分析試驗結果發(fā)現，在多次復壯的過程中，4種培養(yǎng)基均表現出了隨著復壯代數的增加產孢量和毒力的恢復效果逐漸減弱的現象，但是甲殼素培養(yǎng)基具有相對較好的穩(wěn)定性，恢復效果的下降速率較慢，原因可能是幾丁質是真菌細胞壁的主要組成成分，對菌株的生長發(fā)育必不可少，同時也提高了菌株體內幾丁質酶的活力。其次是綜合培養(yǎng)基恢復效果較好，可能是綜合培養(yǎng)基具有更多種營養(yǎng)物質，形成了穩(wěn)定的組合，能讓菌株吸收不同性狀生長所需要的營養(yǎng)。而蟬蛻培養(yǎng)基在復壯過程中對菌株2個指標的提升比例均不突出。此外添加蠶蛹粉的培養(yǎng)基僅使菌株在產孢量方面有大幅度提高，在毒力方面復壯效果不突出，且恢復比例波動較大，可見其穩(wěn)定性不足，具體原因還有待進一步探索。

綜上所述，動物性氮源對玫煙色棒束孢的產孢有促進作用，所以經蠶蛹培養(yǎng)基復壯獲得的菌株產孢量有了明顯的提高，但對小菜蛾幼蟲的毒力并沒有顯著的恢復，說明產孢量大的菌株毒力不一定強。甲殼素培養(yǎng)基對玫煙色棒束孢菌株的生長和毒力均有明顯的促進作用，但在產孢量方面恢復效果一般，其恢復比例較穩(wěn)定。因此，在生產中應用玫煙色棒束孢菌株，應根據具體需要綜合考慮多種指標的影響選擇復壯添加的營養(yǎng)物質。