楊 芳,簡(jiǎn)宏先,高 越,王翠蘋

基于細(xì)菌學(xué)研究改性生物炭對(duì)抗生素的降解機(jī)制

楊 芳,簡(jiǎn)宏先,高 越,王翠蘋*

(南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,環(huán)境污染過程及基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市環(huán)境修復(fù)和控制實(shí)驗(yàn)室,天津 300071)

分別選取3個(gè)裂解溫度下制備的改性生物炭——MBC350,MBC500和MBC700,2種抗生素——磺胺甲噁唑(SMX)和氯霉素(CAP),考察MBCs對(duì)SMX和CAP生物降解的影響及生物降解過程中和的細(xì)菌學(xué)特征.結(jié)果表明,在低濃度MBCs培養(yǎng)的細(xì)菌體系中,SMX和CAP的去除主要依靠細(xì)菌和的生物降解;而在高濃度MBCs培養(yǎng)的細(xì)菌體系中,SMX和CAP的去除主要依靠MBCs的吸附.其主要是由于隨著MBCs濃度的增加,對(duì)SMX和CAP的吸附量提高,同時(shí)促進(jìn)細(xì)菌的繁殖,導(dǎo)致溶液中較少的SMX和CAP被細(xì)菌生物降解.MBCs提高了細(xì)胞膜中飽和脂肪酸含量,抑制了中飽和脂肪酸的合成.特別是中脂肪酸C10:0和C15:1,cis-10消失;而中逆式脂肪酸C14:1,cis-9和C15:1,cis-10生成.此外,應(yīng)用基因絕對(duì)定量技術(shù)發(fā)現(xiàn)MBCs顯著提高了細(xì)菌的基因表達(dá)拷貝數(shù),抑制了的基因表達(dá)拷貝數(shù).但細(xì)菌和的基因表達(dá)拷貝數(shù)均隨著MBCs濃度的增加而增加.因此,本研究表明低濃度MBCs有利于SMX和CAP的生物降解,而高濃度MBCs促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)量,脂肪酸和基因表達(dá)拷貝數(shù).

抗生素；改性生物炭；生物降解；細(xì)菌生長(zhǎng)量；脂肪酸；基因表達(dá)拷貝數(shù)

磺胺甲惡唑(SMX)和氯霉素(CAP)是使用較廣的廣譜性抗菌藥物,被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中,主要通過干擾和抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)與繁殖,來治療或預(yù)防細(xì)菌感染性疾病[1].基于SMX和CAP具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和抗菌特性,其不能被生物有機(jī)體完全吸收,約有40%~90%以母體或代謝產(chǎn)物的形式隨尿液或糞便排出體外[2],由于具有較強(qiáng)的親水性,導(dǎo)致其最終進(jìn)入地表和地下水環(huán)境中[3].SMX和CAP持續(xù)暴露將導(dǎo)環(huán)境微生物產(chǎn)生抗性(耐藥性),這些耐藥菌所攜帶的抗性基因可以在不同細(xì)菌之間傳遞,引發(fā)超級(jí)耐藥致病菌的產(chǎn)生,危害人體健康[4-5],因此,去除水體中殘留的SMX和CAP引起了廣泛關(guān)注.

生物炭具有比表面積大、孔結(jié)構(gòu)復(fù)雜及特殊的官能團(tuán)等理化性質(zhì)[6-8],因此,常被用于對(duì)污染物吸附和固定[9-10].同時(shí),由于含有豐富的C、N、S、P和K等營(yíng)養(yǎng)元素,可為微生物生長(zhǎng)提供基質(zhì).因此,在生物炭作用下,能提高微生物對(duì)污染物的生物降解[11-13].此外,基于一些特殊環(huán)境污染物治理和機(jī)制的闡述需求,生物炭常被進(jìn)行化學(xué)改性,一旦經(jīng)過改性,其理化性質(zhì)隨之發(fā)生巨大的改變[8].然而目前針對(duì)改性生物炭對(duì)微生物降解的影響和機(jī)制未有詳細(xì)報(bào)道.因此基于細(xì)菌學(xué)研究改性生物炭對(duì)抗生素的生物降解機(jī)制具有深遠(yuǎn)的環(huán)境意義.

本研究以酸改性水稻秸稈生物炭為材料,研究改性生物炭對(duì)微生物降解SMX和CAP的影響,進(jìn)而從改性生物炭對(duì)微生物細(xì)菌學(xué)特征的影響,如生長(zhǎng)量、脂肪酸組成和含量、細(xì)菌基因表達(dá)拷貝數(shù)的影響角度,解釋改性生物炭對(duì)抗生素生物降解的影響和機(jī)制,為生物炭聯(lián)合微生物技術(shù)提供理論研究參考,并為去除環(huán)境中抗生素的應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SMX和CAP,純度398%,購(gòu)買于Aladdin試劑平臺(tái).此外,2X ChamQ SYBR COLOR qPCR Master Mix(Q411-02/03)和PCR引物(PAGE純化)分別購(gòu)買于南京諾唯贊生物科技有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司;八連管和DL2000分別購(gòu)買于愛思進(jìn)生物炭科技(杭州)有限公司和上海捷瑞生物炭工程有限公司;EX Taq 酶,dNTP,10×EX Taq Buffer,和pMD18-T Vector購(gòu)買于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司.FAST DNA spin kit for soil 試劑盒和感受態(tài)細(xì)胞(Top-10)分別購(gòu)買于MP Biomedicals和天根生化科技(北京)有限公司.PCR產(chǎn)物純化試劑和質(zhì)粒提取試劑均由北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司自制.

菌種:(; ATCC17588),(; ATCCBAA- 1097)均購(gòu)于廣東省微生物研究所菌種保藏中心,并與4℃冰箱保存?zhèn)溆?

蛋白胨牛肉膏營(yíng)養(yǎng)液(NM):稱取5.0g牛肉膏,10g蛋白胨,和5.0g的NaCl溶解于1.0L蒸餾水中,利用0.1mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值為7.0±0.1.使用0.22μm濾膜濾掉雜質(zhì)后,在121℃(1.05MPa)高溫高壓下滅菌30min后,置于超凈臺(tái)備用.稱取15g瓊脂添加于上述的NM中制成固體蛋白胨牛肉膏培養(yǎng)基(NA)待用.

無機(jī)鹽培養(yǎng)液(MM):稱取1.5g的KH2PO4,1.0g的NaCl,5.0g的K2HPO4·3H2O,0.4g的MgSO4·7H2O,及1mL的痕量元素于1.0L蒸餾水中,并用0.1mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值為7.0±0.1,用0.22μm濾膜濾掉雜質(zhì)后,在121℃(1.05MPa)高溫高壓下滅菌30min后,置于超凈臺(tái)備用.

痕量元素組成:準(zhǔn)確稱取0.2g ZnSO4·2H2O,2.0g NaHCO3,0.02g (NH4)6Mo7O2·4H2O,0.3g MnSO4·3H2O, 0.5g的FeSO4·5H2O和0.1g的CuSO4·12H2O,及0.5g的CoCl2·5H2O,0.05g CaCl2·2H2O,溶于1.0L蒸餾水待用.

生物炭(BCs)的制備:本研究中水稻秸稈取自中國(guó)山東日照的某農(nóng)田,其主要制備步驟如下:首先將收集的水稻秸稈用蒸餾水清洗、曬干、粉碎過60目篩備用;稱取適量的生物質(zhì)于石英舟中,并將其放入管式爐(型號(hào):SK-G08123K,天津中環(huán)電爐股份有限公司)中制備生物炭.設(shè)置管式爐溫度條件:以5℃/min的升溫速率從室溫升至100℃,停留1h;再以10℃/min的升溫速率分別升溫至350℃或500℃或700℃,停留4h,使之完全裂解,最后讓其自然降溫至室溫.生物質(zhì)裂解過程中保持純N2以1.5L/min速率通過管式爐以確保生物質(zhì)在缺氧或厭氧條件下進(jìn)行裂解.將制備的生物炭研磨過200目篩,并按照其裂解溫度命名為:BC350,BC500和BC700,置于密封袋中于避光黑暗中儲(chǔ)存待用.

改性生物炭(MBCs)的制備及表征:首先,稱取50g上述制備好的生物炭(BC350~700)于400mL蒸餾水中,在180r/min,30℃條件下震蕩3d去除生物炭中易于溶解的有機(jī)質(zhì).其次,移除樣品中液體部分,將得到的生物炭用蒸餾水清洗3遍后,加入200mL 1mol/L的HCl和200mL 1mol/L的HF,在相同條件下震蕩3d以去除生物炭中灰分和難溶解有機(jī)質(zhì),將樣品中液體部分移除.用蒸餾水清洗至生物炭沉淀呈中性后,將其置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥,并根據(jù)其裂解溫度命名為:MBC350,MBC500和MBC700,裝入密封塑料袋中于避光黑暗中儲(chǔ)存待用.對(duì)制備好的MBCs進(jìn)行元素分析(EA3000,意大利)和比表面積分析(BET)討論酸處理對(duì)生物炭的理化性質(zhì)的影響.

本實(shí)驗(yàn)中使用的色譜級(jí)有機(jī)溶劑:甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚購(gòu)買于天津康科德科技有限公司;另本實(shí)驗(yàn)所使用的耗材,如C18反相色譜柱(5μm,4.6×150mm)、40mL棕色玻璃瓶、Teflon瓶蓋、2mL進(jìn)樣小瓶購(gòu)買于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司.

1.2 菌種活化和菌懸液配置

菌種活化:將購(gòu)買的菌種干粉接種到含10mL的NA固體斜面培養(yǎng)基的試管中,并用滅菌橡膠塞封口,置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h以充分活化菌株,標(biāo)為一代菌株.從固體NA斜面培養(yǎng)基中取菌種和分別接種到固體NA平板上,并于相同條件下培養(yǎng)24h,計(jì)為二代菌株.從固體NA平板中取和接種到裝有50mL的NM的三角瓶中,用滅菌的橡膠塞封閉瓶口后,于180r/min,30℃條件的震蕩箱中培養(yǎng)24h,計(jì)為三代菌株(本實(shí)驗(yàn)中所用到的細(xì)菌均為第三代菌株).

菌懸液配置:取三代菌液40mL于無菌離心管中,在4000r/min,4℃下離心10min,棄掉上清液,用無菌生理鹽水清洗3遍菌沉淀,最后將菌種懸浮于無菌生理鹽水中.以無菌生理鹽水為空白,采用紫外分光光度計(jì)(型號(hào):TU-1810,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)測(cè)量菌懸液的OD660值,并用無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋,直至菌懸液的OD660為0.65(相當(dāng)于細(xì)菌濃度為5.2×108CFU/mL).

1.3 MBCs對(duì)微生物生長(zhǎng)量的實(shí)驗(yàn)

在MM培養(yǎng)液中添加不同濃度的MBC350~700,使MBCs濃度為:25,100,500,1000和2000mg/L.取40mL含有不同濃度MBCs的NM培養(yǎng)于無菌離心管中,添加菌懸液和(菌懸液添加量為2%:)后,于180r/min,30℃的震蕩箱中培養(yǎng)5d,以不添加菌懸液的樣品為空白,測(cè)其OD660值,并計(jì)算其細(xì)菌濃度(1.0OD600 = 8×108CFU/mL).

1.4 MBCs對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜脂肪酸的實(shí)驗(yàn)和分析方法

參考微生物鑒定(MIDI)和Law等[14]的方法,對(duì)MBC350~700在不同濃度條件下培養(yǎng)的和進(jìn)行脂肪酸提取和分析,其具體步驟如下.

脂肪酸提取:取步驟1.3培養(yǎng)5d的樣品10mL于15cm×100mm帶有Teflon蓋子的玻璃管中,在8000r/min,4℃下離心10min,棄掉上清液;然后向沉淀加入1mL的試劑1(45g的NaOH、150mL的甲醇和150mL的蒸餾水混合),置于100℃的水浴中30min后,用冰浴使樣品快速冷卻至室溫.再向樣品中加入2mL的試劑2(325mL 6mol/L的HCl、275mL甲醇和65mL蒸餾水混合),在80℃的水浴中保留10min后,用冰浴使樣品快速冷卻至室溫;快速向樣品中加入1.25mL的試劑3(200mL正己烷和200mL甲基叔丁基醚混合),在渦旋上輕搖10min后,靜置分層,使用巴斯德吸管去除下層水相后,向有機(jī)相中加入3mL的試劑4(10.8g的NaOH溶解于900mL蒸餾水中),輕搖5min后,使用巴斯德吸管吸取上層有機(jī)相的2/3(約0.6mL)到GC-MS進(jìn)樣小瓶中待測(cè).

脂肪酸分析:用GC-MS(安捷倫5977B MSD)對(duì)上述提取的細(xì)菌脂肪酸進(jìn)行分析,其參數(shù)設(shè)置如下:采用EI源(70eV),選擇Scan模式進(jìn)行測(cè)試,其/(質(zhì)荷比)范圍為:50~450.設(shè)置檢測(cè)器和注入口溫度為250和280℃.溫控程序?yàn)?柱溫開始設(shè)置為80℃,保留5min;以3℃/min升溫至250℃,保留5min.進(jìn)樣量1.0μL注入到DB-5MS(30m×0.25μm×0.25μm)毛細(xì)管柱中進(jìn)行分離和檢測(cè)脂肪酸.通過峰高和保留時(shí)間來計(jì)算每種脂肪酸的含量.所有數(shù)據(jù)均采用3個(gè)平行樣的均值.

1.5 MBCs對(duì)細(xì)菌基因絕對(duì)定量的實(shí)驗(yàn)

取步驟1.3培養(yǎng)5d的樣品5mL于無菌離心管中,按照快速提取試劑盒(FAST DNA spin kit for soil)的說明書,進(jìn)行DNA的提取.使用Primer Express軟件3.0 (Applied Biosystems,福斯特市,美國(guó))設(shè)計(jì)和菌株的PCR引物和TaqMan探針,如表1所示,對(duì)2種菌株使用實(shí)時(shí)qPCRs,測(cè)量特異引物下的細(xì)菌基因表達(dá)拷貝數(shù).

qPCR實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件:每個(gè)PCR包含10μL的ChamQ SYBR Color qPCR Master mix(2x),0.4μL的正向和反向引物(5μmol/L),8.2μL雙蒸水(ddH2O),和1μL上述提取的DNA,反應(yīng)最終體積為20μL,并且控制循環(huán)條件如表1所示.使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,將克隆片段進(jìn)行PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證.然后使用NanoDrop 5000分光光度計(jì)(北京百泰克生物科技有限公司)分析質(zhì)?？截悢?shù),再根據(jù)擴(kuò)增子序列和質(zhì)粒的摩爾質(zhì)量計(jì)算基因拷貝數(shù),用LineGene 9600Plus軟件導(dǎo)出數(shù)據(jù)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析.

表1 細(xì)菌絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)的特異引物和反應(yīng)條件

1.6 MBCs對(duì)微生物降解抗生素的實(shí)驗(yàn)和分析方法

MBCs對(duì)微生物降解抗生素的實(shí)驗(yàn):前期研究結(jié)果顯示,2種菌對(duì)抗生素SMX和CAP的最佳降解條件均為:接菌量為2%(:)、降解時(shí)間為5d、溶液pH為7.0、抗生素濃度10mg/L.因此,本研究在此條件下探討MBC350~700在不同濃度(25,100,500, 1000,2000mg/L)對(duì)和降解SMX和CAP的影響.本實(shí)驗(yàn)均在40mL帶有螺旋蓋子的棕色玻璃瓶中進(jìn)行,且置于180r/min,30℃條件的震蕩箱中進(jìn)行5d的降解.取出樣品,用細(xì)胞破碎機(jī)粉碎(型號(hào):JY92-ⅡDN,寧波新芝科技有限公司),過0.22μm濾膜后,取1.5mL液體于進(jìn)樣小瓶中測(cè)定殘留抗生素的濃度.取樣品10mL于40mL滅菌棕色瓶中,使用總有機(jī)碳分析儀(Multi N/C 3100,德國(guó))對(duì)樣品進(jìn)行總有機(jī)碳(TOC)測(cè)定,分析不同濃度MBC350~700釋放的TOC變化.

抗生素的分析方法:本研究采用高效液相色譜(HPLC,安捷倫,1260)檢測(cè)改性生物炭和微生物降解抗生素后的殘留濃度.其具體參數(shù)設(shè)置如下:采用紫外檢測(cè)器,波長(zhǎng)設(shè)置為265nm(SMX),278nm(CAP).流動(dòng)相為超純水(含0.1%甲酸)和甲醇以70:30(:)的等分洗脫,其柱溫為40℃,進(jìn)樣量為10μL,以1mL/ min的速率進(jìn)入C18反相色譜柱.根據(jù)培養(yǎng)基中的抗生素的殘留量,計(jì)算各處理組的去除率,計(jì)算公式為:去除率(%)=(初始濃度-殘留濃度)/初始濃度′100.

2 結(jié)果與討論

2.1 MBCs的理化性質(zhì)

表2是水稻生物炭經(jīng)酸改性后的理化性質(zhì)測(cè)試結(jié)果,表明其在水中的pH值呈中性,即酸洗可去除生物炭中的堿性基團(tuán)[15].隨著裂解溫度的升高,改性生物炭中C元素含量呈上升趨勢(shì),而H、N、O元素顯著下降,表明高溫裂解使得生物炭炭化徹底,顯示出高度芳香結(jié)構(gòu),且經(jīng)酸洗可有效減少含O基團(tuán)的數(shù)量[16].此外,改性生物炭比表面積和總孔體積顯著高于普通生物炭,且其在水溶液中釋放的溶解性有機(jī)碳(TOC)低于檢測(cè)線,表明酸改性可有效的去除生物炭中無機(jī)組分、溶解性有機(jī)質(zhì)和灰分等,提高生物炭中C元素含量、比表面積和總孔體積等[16].

表2 改性生物炭的理化性質(zhì)

注:ND.為未檢驗(yàn).SA為比表面積.

2.2 MBCs對(duì)抗生素生物降解的影響

不同濃度MBC350~700對(duì)SMX和CAP在MM營(yíng)養(yǎng)液中的吸附量如圖1所示.隨著吸附劑MBCs濃度的增加,對(duì)SMX和CAP的吸附量呈線性增加,其相關(guān)系數(shù)2>0.8361.此外,發(fā)現(xiàn)不同溫度MBCs對(duì)SMX和CAP的吸附量均為:MBC700>MBC500> MBC350.表明MBCs對(duì)SMX和CAP的吸附以物理吸附為主,主要通過表面吸附、孔隙吸附等作用[11].

圖1 不同濃度改性生物炭對(duì)SMX(a)和CAP(b)的吸附量

細(xì)菌和在不同濃度的MBC350~700下對(duì)抗生素的去除率如圖2所示.結(jié)果表明在濃度為25和100mg/L的MBCs培養(yǎng)的和對(duì)SMX和CAP的去除率比單一MBCs對(duì)其的吸附率顯著提高;而在MBCs濃度為500,1000和2000mg/L培養(yǎng)微生物的條件下,對(duì)SMX和CAP去除率與MBCs單一作用下的吸附率差異不顯著(>0.05).然而,隨著MBCs濃度的增加,單一生物炭對(duì)SMX和CAP的吸附量和聯(lián)合微生物培養(yǎng)對(duì)SMX和CAP的去除率成顯著升高趨勢(shì).

此外,隨著裂解溫度的升高,單一MBCs對(duì)目標(biāo)物的吸附率和聯(lián)合培養(yǎng)微生物對(duì)污染物的去除率均呈顯著增加,按照吸附率和去除率大小,表現(xiàn)出的順序?yàn)?MBC700>MBC500>MBC350.表明此過程中微生物對(duì)污染物的去除率與MBCs對(duì)抗生素的吸附率有關(guān).

圖2 不同濃度的改性生物炭培養(yǎng)的細(xì)菌對(duì)SMX和CAP的去除率

不同字母代表數(shù)據(jù)在<0.05水平(LSD’s檢驗(yàn))上有顯著性差異

為了清楚說明MBCs對(duì)細(xì)菌降解SMX和CAP的影響,對(duì)MBCs培養(yǎng)下的細(xì)菌對(duì)抗生素的去除率做扣除單一MBCs對(duì)抗生素的吸附率,其結(jié)果如圖3所示.在MBCs的濃度為25和100mg/L下培養(yǎng)的細(xì)菌和對(duì)SMX和CAP的去除率提高了10%~45%.隨著MBCs濃度的增加,和對(duì)SMX和CAP去除率的提高幅度顯著減小.因?yàn)榈蜐舛萂BCs不僅為細(xì)菌生存繁殖提供場(chǎng)地[17],且通過物理吸附將溶液中溶解的抗生素吸附到其比表面和孔隙中,方便細(xì)菌利用[17],從而提高抗生素的去除率.隨著MBCs濃度的增加,一方面提高了對(duì)抗生素的吸附量,導(dǎo)致能為細(xì)菌繁殖提供場(chǎng)地的比表面和孔隙減少;另一方面,由于生物炭吸附導(dǎo)致溶液中的抗生素含量下降和生物炭表面細(xì)菌的繁殖,由此造成溶液中游離的菌多而目標(biāo)物少,且不利于細(xì)菌接觸吸附態(tài)的SMX和CAP.因此,高濃度MBCs不利于提高微生物對(duì)抗生素的降解.

圖3 不同濃度的改性生物炭培養(yǎng)的細(xì)菌對(duì)抗生素的去除率的提高量

不同字母代表數(shù)據(jù)在<0.05水平(LSD’s檢驗(yàn))上有顯著性差異

2.3 MBCs對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)量的影響

不同濃度的MBCs對(duì)細(xì)菌和生長(zhǎng)量的影響如圖4所示.結(jié)果表明隨著MBCs的添加量的增加,細(xì)菌濃度呈線性增加(2>0.7745),表明MBCs特殊的理化性質(zhì)、巨大的比表面積和孔結(jié)構(gòu)可以為細(xì)菌和的生長(zhǎng)提供場(chǎng)所[11],便于細(xì)菌進(jìn)一步繁殖[11].盡管高濃度MBCs對(duì)細(xì)菌增加量要高于低濃度的,但同時(shí)也增加了MBCs對(duì)細(xì)菌的吸附,減少細(xì)菌與目標(biāo)抗生素的接觸機(jī)會(huì),結(jié)果體現(xiàn)在低濃度的MBCs反而提高了微生物對(duì)SMX和CAP降解率.

圖4 不同濃度的改性生物炭對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)量的影響

2.4 MBCs對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜脂肪酸組成和含量的影響

脂肪酸是細(xì)菌細(xì)胞膜的重要組成成分,細(xì)胞膜通常通過改變脂肪酸的組成和含量來適應(yīng)并生存于外界環(huán)境或污染物的不利影響[18].因此,本研究分析不同裂解溫度制備的MBCs對(duì)細(xì)菌和脂肪酸組成和含量的影響(表3).結(jié)果表明在沒有MBCs作用條件下,的正構(gòu)直鏈脂肪酸分布在C10:0~C18:0,缺少C15:0正構(gòu)脂肪酸;而的正構(gòu)直鏈脂肪酸分布在C12:0~C18:0.在MBCs作用下,中脂肪酸C10:0和C15:1,cis-10消失,而在MBC500和MBC700作用下C15:0正構(gòu)脂肪酸生成;而在MBC700作用下,逆式脂肪酸C14:1,cis-9和C15:1,cis-10生成.因此,不同裂解溫度的MBCs對(duì)和脂肪的組成影響規(guī)律不一樣.體現(xiàn)在對(duì)通過改變其細(xì)胞膜的正構(gòu)脂肪酸組成[18-19],而通過生成逆式脂肪酸來適應(yīng)MBCs刺激[18-20],從而提高M(jìn)BCs聯(lián)合微生物對(duì)SMX和CAP的去除.

表3 不同改性生物炭培養(yǎng)下細(xì)菌脂肪酸的組成成分

注:ND.,為未檢出.

圖5 不同濃度的改性生物炭對(duì)細(xì)菌飽和脂肪酸的影響

不同字母代表數(shù)據(jù)在<0.05水平(LSD’s檢驗(yàn))上有顯著性差異

此外,對(duì)于革蘭氏陰性菌,膜中飽和脂肪酸(SFA)與不飽和脂肪酸(UFA)的變化是許多微生物對(duì)污染物最常見的適應(yīng)反應(yīng)[21-23].因此,MBC350~700對(duì)細(xì)菌脂肪酸中SFA的影響如圖5所示.在MBC350~700下培養(yǎng)的(圖5a),其飽和脂肪酸顯著提高,表明MBCs提高了細(xì)胞膜流動(dòng)性[24-25].不同濃度的MBC350對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜SFA的影響做顯著性分析(<0.05),當(dāng)MBC350濃度為25mg/L時(shí),細(xì)菌的SFA含量低于空白組;當(dāng)MBC350濃度為1000mg/L時(shí),細(xì)菌SFA達(dá)到最大.而對(duì)MBC500和MBC700培養(yǎng)的,其SFA含量隨著MBCs濃度增加而增加,遠(yuǎn)高于空白組,均在濃度為2000mg/L,達(dá)到最大.而不同濃度MBC350~700對(duì)的SFA的影響特征(圖5b)與對(duì)的影響不盡相同.結(jié)果顯示相對(duì)空白組,MBCs顯著降低了中SFA的含量,這是因?yàn)镸BCs破壞細(xì)胞膜中脂質(zhì)和蛋白質(zhì),從而導(dǎo)致SFA含量下降[26-27].此外,由圖5b所示,隨著MBCs濃度的增加,細(xì)胞膜中SFA含量顯著增加,均在MBC350~700濃度為2000mg/L時(shí),達(dá)到最大.因此,表明和在不同濃度的MBCs的刺激下,細(xì)胞膜中SFA的含量變化有著明顯不同的規(guī)律[28],影響細(xì)菌細(xì)胞膜的流動(dòng)性,從而造成MBCs聯(lián)合這2種菌對(duì)SMX和CAP降解特征的不同.

2.5 MBCs對(duì)細(xì)菌基因表達(dá)拷貝數(shù)的影響

基因絕對(duì)定量被用來表達(dá)特殊環(huán)境對(duì)細(xì)菌的真實(shí)影響[29-30],圖6揭示了不同溫度MBCs在不同濃度下對(duì)細(xì)菌和基因表達(dá)拷貝數(shù)的影響.由圖6a可知,相比空白組,MBC350~700培養(yǎng)的的基因表達(dá)拷貝數(shù)顯著增加(<0.05),且隨著MBCs濃度增加而增加,這和細(xì)菌生長(zhǎng)量研究結(jié)果一致(圖4).且發(fā)現(xiàn)在各相同濃度下,MBC500培養(yǎng)的的基因表達(dá)拷貝數(shù)最高.然而,相對(duì)空白組,在MBC350~700培養(yǎng)的細(xì)菌的基因表達(dá)拷貝數(shù)顯著降低(圖6b),其趨勢(shì)與細(xì)菌飽和脂肪酸含量結(jié)果一致(圖5b).因此,結(jié)果表明MBCs有利于細(xì)菌的基因表達(dá),而抑制的基因表達(dá)量.

綜上所述,MBCs對(duì)細(xì)菌降解抗生素的機(jī)制主要為:細(xì)菌在MBCs表面主要優(yōu)先利用吸附到表面和空隙的抗生素作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行繁殖,因此,低濃度MBCs作用下,繁殖的細(xì)菌能夠提高對(duì)SMX和CAP的降解,而不影響細(xì)菌和目標(biāo)物在MBCs吸附點(diǎn)位上的競(jìng)爭(zhēng);當(dāng)MBCs濃度提高,抗生素吸附量、細(xì)菌的濃度、細(xì)菌細(xì)胞膜SFA、基因表達(dá)拷貝數(shù)均顯著提高,此時(shí),MBCs表面繁殖的細(xì)菌打破MBCs與溶液中抗生素的動(dòng)態(tài)吸附[17],同時(shí),溶液中抗生素減少,不利于抗生素的生物降解.

圖6 不同濃度的改性生物炭對(duì)細(xì)菌基因表達(dá)量的影響

不同字母代表數(shù)據(jù)在<0.05水平(LSD’s檢驗(yàn))上有顯著性差異

3 結(jié)論

3.1 低濃度MBC350~700培養(yǎng)的和對(duì)SMX和CAP的去除率顯著高于單一MBCs對(duì)目標(biāo)物的吸附率;而高濃度MBC350~700條件下,對(duì)SMX和CAP去除率與單一MBCs的吸附率差異不顯著;且高濃度的MBCs單一或其與細(xì)菌聯(lián)合對(duì)SMX和CAP去除率高于低濃度MBCs單一和聯(lián)合作用.

3.2 低濃度MBC350~700聯(lián)合細(xì)菌和對(duì)SMX和CAP的去除率相比單一MBCs的吸附量提高了10%~45%;高濃度MBCs聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)菌和對(duì)SMX和CAP的去除率與單一MBCs對(duì)SMX和CAP的吸附率呈不顯著差異.

3.3 MBCs提高了細(xì)胞膜中飽和脂肪酸含量,而抑制了細(xì)菌的脂肪酸合成.特別是在MBCs作用下,細(xì)菌中脂肪酸C10:0和C15:1,cis-10消失;而在MBC700作用下,細(xì)菌的逆式脂肪酸C14:1,cis-9和C15:1, cis-10生成.

3.4 MBCs提高了細(xì)菌的基因表達(dá)拷貝數(shù),而抑制了的基因表達(dá)拷貝數(shù);但細(xì)菌和的基因表達(dá)拷貝數(shù)均隨著MBCs濃度的增加而增加.

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Effects and mechanisms of modified-biochar on biodegradation of antibiotics as revealed by bacteriological characteristics.

YANG Fang, JIAN Hong-xian, GAO Yue, WANG Cui-ping*

(Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control, College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China)., 2021,41(4)：1723~1731

Three kinds of modified-biochar including MBC350, MBC500 and MBC700, and two types of antibiotics sulfamethoxazole (SMX) and chloramphenicol (CAP), were selected to investigate effects of different MBCs on biodegradation of SMX and CAP and the bacteriological characteristics ofand. The results showed that in the bacterial system cultured with low-concentration MBCs, the removal of SMX and CAP mainly depended on biodegradation byand. While in the bacterial system cultured with high-concentration MBCs, the removal of SMX and CAP was mainly by the adsorption onto MBCs. The adsorption capacities of SMX and CAP onto MBCs and the bacterial growth all increased as the concentrations of MBCs increased, leading to the decrease in the concentrations of antibiotics in the solution and the biodegradation efficiency. The content of fatty acids ofwas significantly improved, while the fatty acids synthesis ofwas inhabited in the presence of MBCs. In particular, the components C10:0, C15:1, cis-10 ofwere disappeared, and the components of trans-unsaturated fatty acids ofwere generated, such as C14:1, cis-9 and C15:1, cis-10. Additionally, by using absolute quantitative technique, the gene copies number ofwasclearly improved, while it was inhabited forin the presence of MBCs. But the gene copies numbers ofandwere increased with the increasing concentrations of MBCs. Therefore, this study showed that low-concentration MBCs were conducive to the biodegradation of SMX and CAP. While the bacteriological characteristics, such as bacterial growth, fatty acid and copy number of bacterial gene expression, were all promoted in the presence of high-concentration MBCs.

antibiotics；modified-biochar；biodegradation；bacterial growth；fatty acids；the copy number of gene

X52

A

1000-6923(2020)04-1723-09

楊 芳(1990-),女,陜西咸陽(yáng)人,南開大學(xué)博士研究生,主要從事環(huán)境污染物控制與修復(fù)研究.發(fā)表論文3篇.

2020-09-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(42077320);寧夏科技廳重點(diǎn)研發(fā)資助項(xiàng)目(2019BFG02020);高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃111資助項(xiàng)目(T2017002)

* 責(zé)任作者, 教授, wangcp@nankai.edu.cn