謝立娜 鎖 然 趙 燕

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定 071000； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081）

我國(guó)是一個(gè)人口大國(guó)，奶及奶制品 （奶粉等）的消費(fèi)占世界乳品供應(yīng)的很大比例。奶類(lèi)具有極大的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]，不同品種的奶質(zhì)量也有所不同。近年來(lái)，隨著我國(guó)乳品行業(yè)的迅速發(fā)展，乳品的種類(lèi)多種多樣，有些不良商家為了獲取更高經(jīng)濟(jì)利益，以?xún)r(jià)格較低的牛奶代替昂貴的羊奶、駱駝奶等[2]，這不僅對(duì)人們是一種欺騙行為，還不利于消費(fèi)市場(chǎng)穩(wěn)定。因此，探尋一種安全、準(zhǔn)確鑒別乳品種類(lèi)的方法具有重要意義。

乳品中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)。蛋白質(zhì)是組成人體一切細(xì)胞、組織的重要成分，對(duì)維持機(jī)體正常的生命活動(dòng)具有極其重要的作用[3]。而氨基酸是蛋白質(zhì)的主要組成部分，它是衡量食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的一項(xiàng)重要指標(biāo)，且可作為特征指標(biāo)進(jìn)行食品品種鑒別及摻假鑒別。陳媛媛等[4]利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定了不同品種蠔汁中游離氨基酸含量，最后篩選出絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、蘇氨酸和組氨酸作為蠔汁特征氨基酸。賴(lài)玉婷等[5]通過(guò)柱前衍生高效液相色譜法對(duì)牛奶及奶粉中的色氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、賴(lài)氨酸進(jìn)行測(cè)定，建立牛奶及奶粉的氨基酸模式，可有效判別出牛奶及奶粉的蛋白摻假。

氨基酸的測(cè)定分析方法較多，傳統(tǒng)的方法主要是采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定，該方法由MOORE等[6]在1959 年提出。國(guó)內(nèi)外已將氨基酸自動(dòng)分析儀專(zhuān)用為氨基酸的檢測(cè)手段[7]。但該方法對(duì)氨基酸檢測(cè)分析的專(zhuān)用性強(qiáng)，且儀器的價(jià)格昂貴，不能廣泛應(yīng)用于其他化學(xué)成分的分析，局限性較大。近20 年來(lái)，隨著鍵合反相色譜的應(yīng)用及柱前衍生化技術(shù)的發(fā)展，氨基酸的檢測(cè)分析更多采用高效液相色譜法，與氨基酸自動(dòng)分析儀相比，該方法具有分離效果好，靈敏度高，通用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，且快速、操作簡(jiǎn)單，可用于多種物質(zhì)的分析，越來(lái)越受到人們的青睞[8～10]。柱前衍生高效液相色譜分析指樣品組分經(jīng)過(guò)化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)光或發(fā)色衍生物，再經(jīng)色譜柱分離后被檢測(cè)[11]。柱前衍生的關(guān)鍵在于衍生劑的選擇。衍生化所用試劑通常有鄰苯二甲醛（OPA）、2，4-二硝基氟苯（FDNB）、丹酰氯 （Dansy-Cl）、磺酰氯二甲胺偶氮苯 （Dabsyl-Cl）、氯甲酸芴甲酯 （9-芴基甲氧基羰酰氯，F(xiàn)MC）、異硫氰酸苯酯 （PITC）等[12～15]，各種衍生劑各有優(yōu)勢(shì)與不足[13]。近年來(lái)，2，4-二硝基氯苯（CDNB）作為一種新型的柱前衍生化試劑應(yīng)用于氨基酸的測(cè)定分析中，其柱前衍生方法和儀器分析條件與FDNB 法類(lèi)似，但與FDNB 法相比，具有衍生試劑價(jià)廉易得，理化性質(zhì)穩(wěn)定，制備試樣簡(jiǎn)單方便的優(yōu)點(diǎn)[16]。同時(shí)，與其他衍生劑相比具有干擾小，重現(xiàn)性好，毒性小，衍生條件簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[17～19]。本研究以2，4-二硝基氯苯為衍生劑，通過(guò)柱前衍生高效液相色譜法對(duì)牛奶、馬奶、驢奶、駱駝奶4 種乳品中的17 種氨基酸含量進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)合單因素方差分析和主成分分析（PCA）區(qū)分奶類(lèi)樣品的來(lái)源，進(jìn)而保證乳品的質(zhì)量安全。

一、材料與方法

（一）材料與試劑牛奶、馬奶、驢奶、駱駝奶樣品采購(gòu)于牧場(chǎng)。牛奶共3 份樣品，全部取自?xún)?nèi)蒙古呼和浩特市； 馬奶共4 份樣品，其中2 份樣品取自新疆烏魯木齊市，2 份樣品取自?xún)?nèi)蒙古錫林郭勒盟； 驢奶共3 份樣品，其中1 份樣品取自山東聊城市，2 份樣品取自新疆烏魯木齊市； 駱駝奶共3份樣品，全部取自新疆烏魯木齊市。

17 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品： 天冬氨酸（Asp）、組氨酸（His）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸 （Ala）、脯氨酸 （Pro）、纈氨酸 （Val）、甲硫氨酸 （Met）、胱氨酸（Cys）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸 （Leu）、苯丙氨酸 （Phe）、賴(lài)氨酸 （Lys）、酪氨酸 （Tyr）（純度≥99%，北京拜爾迪生物技術(shù)公司和美國(guó)Sanland 公司）； 2，4-二硝基氯苯 （分析純，純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司）； 乙腈 （色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）； 乙酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、冰乙酸、三乙胺 （分析純，純度≥99%，上海麥克林生化科技有限公司）； 鹽酸 （優(yōu)級(jí)純，上海麥克林生化科技有限公司）； 實(shí)驗(yàn)所需用水為娃哈哈純凈水。

（二）儀器與設(shè)備Waters 2695 高效液相色譜儀 （美國(guó) Waters 公司），低壓梯度泵，PDA 檢測(cè)器； 電熱鼓風(fēng)干燥箱 （天津市泰斯特儀器有限公司）； SHD-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 （保定高新區(qū)陽(yáng)光科教儀器廠）； 電熱恒溫水浴鍋 （北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）； 電子天平 （北京賽多利斯儀器有限公司）。

（三）試驗(yàn)方法

1.樣品處理。將液態(tài)樣品冷凍干燥后，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g （精確至0.000 1 g）凍干粉于安培瓶中，加入 6 mol/L 的鹽酸10 mL，在 110℃條件下水解24 h。靜置，冷卻到室溫，容量瓶定容至 10 mL，然后取1 mL 水解液于真空條件下抽干，再加入0.1 mol/L 鹽酸溶液 2 mL 回溶，混勻備用。

2.氨基酸的衍生。取標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品水解液100 μL 于 1.5 mL 進(jìn)樣瓶中，加入緩沖溶液 200 μL和 300 mg/mL 衍生劑 100 μL，漩渦混勻，在 90℃恒溫水浴鍋中避光反應(yīng)90 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，加入 10%乙酸 50 μL 調(diào)節(jié) pH 為中性，然后用水定容到1 mL，渦旋混勻，最后取上清液過(guò)0.45 μm 有機(jī)膜后待測(cè)。

3.溶液配制。（1）300 mg/mL 衍生劑： 稱(chēng)取0.3 g 2，4-二硝基氯苯溶于 1 mL 乙腈中獲得300 mg/mL 2，4-二硝基氯苯衍生劑。（2）緩沖溶液： 稱(chēng)取0.53 g Na2CO3和0.42 g NaHCO3分別溶于 10 mL水中，取 700 μL Na2CO3溶液加入到 10 mL NaHCO3溶液中，調(diào)節(jié) pH 值為 9.0。（3）氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別稱(chēng)取一定量的17 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用 0.1 mol/L 鹽酸溶液定容，混勻，配制成濃度為1 000 mg/L 的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃保存?zhèn)溆?。然后將?chǔ)備液稀釋成50、100、125、200、250、300、400、500 mg/L 的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.色譜條件。色譜柱為Kromat Universil C18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）； 柱溫為 40℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)為 360 nm； 流量為 1 mL/min； 進(jìn)樣量為 10 μL； 流動(dòng)相： A 為乙腈，B 為 2.5 g/L 乙酸鈉 （含1.5 mL 三乙胺，用冰乙酸調(diào)至 pH 5.25）。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

（四）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法以各種氨基酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （x），氨基酸的峰面積為縱坐標(biāo) （y），進(jìn)行線性擬合，得到氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程，并以 3 倍信噪比 （S/N＝3）計(jì)算檢出限，10倍信噪比計(jì)算定量限。

表1 梯度洗脫程序

采用SPSS 22.0 對(duì)樣品氨基酸數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析 （ANOVA）和 Duncan 多重比較分析以確定不同來(lái)源乳樣中氨基酸含量的差異。通過(guò)SIMCA 14.1 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析 （PCA），將不同來(lái)源的乳樣進(jìn)行分類(lèi)，并計(jì)算氨基酸的變量投影重要度 （VIP）值，篩選出鑒別乳樣來(lái)源的關(guān)鍵氨基酸。

二、結(jié)果與討論

（一）線性范圍、檢出限與定量限將不同濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生后，供 HPLC 分析檢測(cè)。線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限見(jiàn)表2，可以看出，17 種氨基酸在50～500 mg/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.991 4～0.999 8； 檢出限為 0.40～2.35 mg/L，定量限為1.33～7.83 mg/L。

表2 氨基酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

（二）方法精密度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性為考察方法的精密度，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g 奶類(lèi)樣品，經(jīng)水解、衍生后，連續(xù)進(jìn)樣6 次以色譜峰峰面積為指標(biāo)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD），17 種氨基酸的 RSD 為1.02%～4.27%（n＝6）。為考察衍生物的穩(wěn)定性，將衍生的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于室溫放置0、1、2、3、4、5 d 后 進(jìn) 行 測(cè) 定 ，計(jì) 算 其 RSD 為 1.76%～5.09% （n＝6）。為考察方法的重現(xiàn)性，各取牛奶、馬奶、驢奶、駱駝奶同一樣品 6 份，經(jīng)水解、衍生后測(cè)定色譜峰峰面積，計(jì)算其RSD，得出牛奶、馬奶、驢奶、駱駝奶中17 種氨基酸的RSD 分別為1.37%～5.15%、1.69%～5.20%、1.73%～5.40%、1.81%～5.67%（n＝6）。方法的精密度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性分析得到的RSD 結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，該方法精密度高、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好，符合實(shí)驗(yàn)室測(cè)定要求，可應(yīng)用于奶類(lèi)樣品中17 種氨基酸的測(cè)定分析。

（三）加標(biāo)回收率準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g 奶類(lèi)樣品，添加50、300、500 mg/L 3 個(gè)濃度水平的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平做6 份平行樣品，經(jīng)水解、衍生后，進(jìn)HPLC 分析和回收率測(cè)定。牛奶樣品中氨基酸的回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，其平均回收率為89.1%～110.0%。其中賴(lài)氨酸、甲硫氨酸與酪氨酸回收率較低，可能是由于高溫使其部分氧化。

（四）乳品中氨基酸含量的測(cè)定分析

1.不同來(lái)源乳品中氨基酸含量的差異。牛奶、馬奶、驢奶、駱駝奶4 種奶類(lèi)樣品中氨基酸含量測(cè)定結(jié)果的平均值見(jiàn)表5。由結(jié)果可見(jiàn)，駱駝奶氨基酸總量最高，其次是馬奶、牛奶、驢奶。其中天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、脯氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸

含量均較高，而組氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、酪氨酸含量較低。4 種奶均含有豐富的必需氨基酸，這7 種必需氨基酸之和所占比率均在30%以上，依次為牛奶、駱駝奶、驢奶、馬奶。經(jīng)方差分析可知，17 種氨基酸含量在4 種奶類(lèi)樣品間都具有顯著性差異 （p＜0.05），其中精氨酸區(qū)分效果最好。

表3 方法的精密度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性分析測(cè)得的RSD （%）

表4 牛奶樣品中氨基酸的回收率 （%）

表5 奶類(lèi)樣品中氨基酸的含量 （mg/g）

2.不同來(lái)源乳品的主成分分析。通過(guò)氨基酸數(shù)據(jù)對(duì)不同來(lái)源的奶類(lèi)樣品進(jìn)行主成分分析，其主成分的特征向量值和方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表6。由表可知，前3 個(gè)主成分因子得分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為94.003%，其中第 1 主成分的方差貢獻(xiàn)率為60.628%，第2 主成分的方差貢獻(xiàn)率為23.594%，第3 主成分的方差貢獻(xiàn)率為9.780%，前3 個(gè)主成分包括了大多數(shù)變量的信息。不同來(lái)源奶類(lèi)樣品的主成分得分見(jiàn)圖1，可以看出，根據(jù)氨基酸數(shù)據(jù)，牛奶、馬奶、驢奶和駱駝奶得到較好的分類(lèi)效果。通過(guò)對(duì)氨基酸數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，本研究得到了在區(qū)分4 種奶中起關(guān)鍵作用的氨基酸，如圖2所示。一般認(rèn)為變量投影重要度 （VIP）值＞1 的指標(biāo)對(duì)模型貢獻(xiàn)率高，即表示為在乳源鑒別中起重要作用的關(guān)鍵指標(biāo)，最后發(fā)現(xiàn)精氨酸、甘氨酸、賴(lài)氨酸、胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸和天冬氨酸具有較高的 VIP 值。其中精氨酸的 VIP 值為 1.35，甘氨酸的 VIP 值為 1.24，賴(lài)氨酸的 VIP 值為 1.22，胱氨酸的 VIP 值為 1.18，丙氨酸的 VIP 值為 1.17，酪氨酸的 VIP 值為 1.13，天冬氨酸的 VIP 值為1.09。以上結(jié)果表明，氨基酸可作為鑒別牛奶、馬奶、驢奶和駱駝奶不同品種奶類(lèi)樣品的特征指標(biāo)。

表6 不同來(lái)源乳品主成分的特征向量值及方差貢獻(xiàn)率

圖1 4 種奶類(lèi)樣品的主成分分析得分圖

圖2 17 種氨基酸的重要性分布

三、結(jié)論

本文通過(guò)帶有二極管陣列檢測(cè)器的高效液相色譜法測(cè)定了牛奶、馬奶、驢奶、駱駝奶4 種奶的氨基酸含量，采用加熱水解法，以2，4-二硝基氯苯為衍生劑，梯度洗脫進(jìn)行測(cè)定，17 種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線呈良好的線性關(guān)系，方法的精密度分析中 RSD 為 1.02%～4.27% （n＝6），穩(wěn)定性分析中RSD 為 1.76%～5.09% （n＝6），重現(xiàn)性分析中RSD 為 1.37%～5.67% （n＝6）。同時(shí)，經(jīng)方差分析、主成分分析，很好地鑒別了4 種不同來(lái)源的奶類(lèi)樣品，確定了起關(guān)鍵作用的氨基酸依次為精氨酸、甘氨酸、賴(lài)氨酸、胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸和天冬氨酸。該方法操作簡(jiǎn)單，精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較好，可應(yīng)用于奶類(lèi)樣品中氨基酸的測(cè)定，進(jìn)而鑒別不同來(lái)源的奶類(lèi)樣品，為鑒別奶制品摻假研究提供技術(shù)支持及數(shù)據(jù)支撐。