朱銳靈 黃佳瀅 劉瑩

摘要：建立稀堿法提取僵蠶蛋白質(zhì)的最佳工藝，并對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）指紋圖譜分析。單因素考察緩沖液pH值、液料比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)僵蠶堿溶性蛋白質(zhì)提取率的影響，隨后以Box-Behnken組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，獲得上述因素對(duì)堿溶性蛋白質(zhì)提取率的量化關(guān)系，確定最佳提取條件，并對(duì)提取的堿溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE指紋圖譜分析。結(jié)果表明最佳提取工藝條件為：Tris-HCl（三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽）緩沖液pH值8.0、液料比58 mL ∶ 1 g，提取溫度為40 ℃，提取時(shí)間為 205 min，此時(shí)堿溶性蛋白質(zhì)提取率可達(dá)2.29%。SDS-PAGE指紋圖譜結(jié)果表明僵蠶堿溶性蛋白質(zhì)含有29.85、27.28 ku 2條遷移率相近的高豐度特征性條帶，分別占總蛋白量的36.37%、32.65%，同時(shí)還有78.8、69 ku較高豐度特征性條帶，該指紋圖譜具有種屬特異性。本研究建立了僵蠶堿溶性蛋白質(zhì)的最佳提取工藝條件，所得SDS-PAGE指紋圖譜可為僵蠶藥材的分子鑒定提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：僵蠶;堿溶性蛋白質(zhì);響應(yīng)面;提取工藝;指紋圖譜

僵蠶（Bombyx Batryticatus）為蠶蛾科昆蟲家蠶（Bombyx mori L.）4～5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌[Beauveria bassiana （Bals.） Vuillant]而致死的干燥體，為我國(guó)常用的大宗動(dòng)物類中藥材[1]。因其息風(fēng)止痙、祛風(fēng)止痛、化痰散結(jié)的功效，僵蠶常用于抽動(dòng)障礙、支氣管哮喘、頑固性蛋白尿及多種兒科疾病的臨床治療，且療效甚佳[2-3]。由于僵蠶售價(jià)較高，市場(chǎng)常見增質(zhì)量僵蠶、綠僵蠶、黃僵蠶、鼓炒僵蠶等偽品出售，嚴(yán)重影響臨床用藥的安全性與有效性[4]。

當(dāng)前僵蠶主要由藥工依其身直、肥壯、質(zhì)堅(jiān)、色白、斷面光亮程度鑒別真?zhèn)渭皠澐值燃?jí)。此外，趙建國(guó)等用紅外光譜法鑒別僵蠶[5]，張麗增等用薄層法鑒別僵蠶及含有僵蠶的中成藥[6]，賈靜等建立了僵蠶藥材的DNA條形碼，為建立相應(yīng)分子鑒定技術(shù)提供了參考[7]。僵蠶含有豐富的蛋白質(zhì)，但未有系統(tǒng)提取工藝及特征種屬蛋白質(zhì)研究的報(bào)道。本研究旨在建立僵蠶蛋白質(zhì)的稀堿法提取工藝，并以Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，進(jìn)而建立僵蠶堿溶性蛋白質(zhì)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）指紋圖譜，為后續(xù)研究基于蛋白質(zhì)組成的僵蠶分子鑒定技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

僵蠶于2019年購(gòu)自安徽亳州中藥材市場(chǎng)（批號(hào)9-23539），經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院歐陽(yáng)臻教授鑒定為蠶蛾科昆蟲家蠶4～5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌而致死的干燥體。

牛血清白蛋白（BSA）、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司];蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;丙烯酰胺、N，N′-亞甲雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、考馬斯亮藍(lán)R-250（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

CS-700高速智能粉碎機(jī)（武義海納電器有限公司）、SpectraMax 190酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular devices公司）、H1650-W臺(tái)式微量高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（Mettler Toledo 公司）、垂直電泳槽VE-180（上海天能科技有限公司）、DYY-6C穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀（南京馳順科技發(fā)展有限公司）、GenoSens 2100凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白質(zhì)提取 僵蠶藥材水洗后40 ℃烘干，打粉后過(guò)70目篩，稱取適量僵蠶粉末，按預(yù)設(shè)液料比加入0.1 mol/L Tris-HCl（三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽）緩沖液，50 ℃水浴振蕩，到預(yù)設(shè)提取時(shí)間后以9 700 g離心10 min，上清即為堿溶性蛋白質(zhì)樣品。

1.3.2 蛋白質(zhì)提取率測(cè)定 以考馬斯亮藍(lán)（Bradford）法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，牛血清白蛋白溶液作為蛋白質(zhì)工作液，測(cè)定溶液的D595 nm[8-9]。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=2.925 7x+0.191 3（r2=0999 3）。對(duì)“1.3.1”節(jié)所述蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行相應(yīng)的處理，測(cè)定D595 nm值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得蛋白質(zhì)含量，按式（1）計(jì)算蛋白質(zhì)提取率。

蛋白質(zhì)提取率=提取液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量僵蠶粉末質(zhì)量×100%。（1）

1.3.3 單因素試驗(yàn) （1）pH值對(duì)僵蠶蛋白質(zhì)提取率的影響試驗(yàn)。固定提取溫度50 ℃，提取時(shí)間 200 min，液料比40 mL ∶ 1 g，Tris-HCl緩沖液pH值分別設(shè)置為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。（2）液料比對(duì)僵蠶蛋白質(zhì)提取率的影響試驗(yàn)。固定Tris-HCl緩沖液pH值8.0，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間 200 min，液料比分別設(shè)置為10 mL ∶ 1 g、25 mL ∶ 1 g、40 mL ∶ 1 g、55 mL ∶ 1 g、70 mL ∶ 1 g。溫度對(duì)僵蠶蛋白質(zhì)提取率的影響試驗(yàn)：固定提取時(shí)間200 min，Tris-HCl緩沖液pH 值為8.0，液料比為55 mL ∶ 1 g，提取溫度分別設(shè)置為30、40、50、60、70 ℃。（3）時(shí)間對(duì)僵蠶蛋白質(zhì)提取率的影響試驗(yàn)。固定提取溫度40 ℃，Tris-HCl緩沖液pH值為 80，液料比為 55 mL ∶ 1 g，提取時(shí)間分別為100、150、200、250、300 min。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 采用Design-Expert（8.0.6.1）軟件，根據(jù)Box-Behnexn設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以Tris-HCl緩沖液pH、液料比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素為自變量，僵蠶堿溶性蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其因素與編碼水平見表1。

1.3.5 SDS-PAGE分析 利用最佳條件下提取得到的僵蠶提取液，向其中加入體積分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸（TCA），渦旋，14 000 r/min離心10 min，棄溶液。加入適量丙酮后，再次渦旋，離心，得到僵蠶堿溶蛋白質(zhì)。加裂解液，置于4 ℃冰箱中待其充分溶解，加上樣緩沖液，沸水浴煮沸10 min，即得到蛋白質(zhì)電泳樣品。制備5%濃縮膠和14%分離膠，80 V 恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑距離凝膠底部05 cm處，停止電泳，剝凝膠，進(jìn)行固定、染色、脫色[10]。

1.3.6 凝膠分析 使用凝膠成像儀對(duì)凝膠拍照，用Quantity One軟件計(jì)算僵蠶堿溶性蛋白質(zhì)的分子量和灰度值，按式（2）計(jì)算各蛋白質(zhì)的含量。

蛋白質(zhì)含量=待測(cè)蛋白質(zhì)灰度值蛋白質(zhì)總灰度值×100%。（2）

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

蛋白質(zhì)為兼性分子，緩沖液pH值可以顯著影響其溶解度。考察pH值為 7.0～9.0時(shí)僵蠶堿溶性蛋白質(zhì)的提取率變化，結(jié)果見圖2-A。在pH值為7.0～8.0之間，堿溶性蛋白質(zhì)的提取率隨著pH值的升高而增加，當(dāng)pH值達(dá)到8.0時(shí)提取率為最高，隨后提取率隨pH值升高而逐步降低。因此，緩沖液pH值為 8.0為最適條件。

緩沖液體積越大，越有利于蛋白質(zhì)的溶出，但過(guò)高的液料比會(huì)導(dǎo)致后處理較為困難?？疾煲毫媳葹椋?0～70） mL ∶ 1 g時(shí)僵蠶堿溶性蛋白質(zhì)提取率變化，結(jié)果見圖2-B。在一定范圍內(nèi)，隨著提取液體積的增大，僵蠶堿溶性蛋白質(zhì)的提取率呈上升趨勢(shì)，液料比為55 mL ∶ 1 g時(shí)提取率達(dá)到最大值。進(jìn)一步提高液料比，蛋白質(zhì)提取率反而呈下降趨勢(shì)，因此，液料比55 mL ∶ 1 g為最適條件。

提取溫度升高可以加速蛋白質(zhì)溶出，且增加其溶出量。考察提取溫度為30～70 ℃時(shí)僵蠶堿溶性蛋白質(zhì)提取率變化，結(jié)果如圖2-C所示。在30～40 ℃的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)提取率逐漸增加，40 ℃時(shí)達(dá)到最大值。進(jìn)一步升高提取溫度則導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率逐步降低，可能由溫度升高導(dǎo)致僵蠶蛋白質(zhì)變性所致，因而最適提取溫度為40 ℃。

提取時(shí)間延長(zhǎng)可以增加蛋白質(zhì)溶出量?？疾焯崛r(shí)間為100～300 min時(shí)僵蠶堿溶性蛋白質(zhì)提取率變化，結(jié)果見圖2-D。提取時(shí)間在100～200 min 內(nèi)時(shí)，提取率呈直線式上升趨勢(shì);提取時(shí)間超過(guò)200 min后，提取率卻隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢下降。因此最佳提取時(shí)間為200 min。

2.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)（表1），綜合考察緩沖液pH值、液料比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見表2，僵蠶蛋白質(zhì)提取率在1.495%～2.275%。

對(duì)二次回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。從表3可知，回歸模型具有極顯著性（P<0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），可知該回歸模型可以較好地?cái)M合實(shí)測(cè)值。在此次試驗(yàn)中，一次項(xiàng)B影響顯著，二次項(xiàng)A2、B2和C2對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響極顯著，交互作用項(xiàng)除CD外P值均大于0.05，表明交互作用不顯著。4個(gè)單因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響順序?yàn)橐毫媳?提取液pH值>提取時(shí)間>提取溫度。

2.3 響應(yīng)曲面的分析

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行分析，得到等高線和響應(yīng)曲面，見圖3，考察4個(gè)因素及兩兩因素的交互作用對(duì)僵蠶蛋白質(zhì)提取率的影響。

由圖3-A可知，液料比的曲面較陡，說(shuō)明對(duì)僵蠶蛋白質(zhì)的提取率影響顯著;pH值的曲面比較平緩，且隨著pH值的增加，蛋白質(zhì)提取率先增加后降低。等高線形狀呈橢圓形，表明pH值和液料比的交互作用顯著。由圖3-B可知，隨著pH值的增加與溫度的升高，蛋白質(zhì)提取率先上升后下降，從2個(gè)因素的曲面來(lái)看，說(shuō)明pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響比溫度更大。等高線呈圓形，證明pH值和溫度的交互作用不顯著。由圖3-C可知，隨著提取的時(shí)間延長(zhǎng)，提取率先增加后略微降低;等高線圖表明2個(gè)因素的交互作用顯著。由圖3-D可知，響應(yīng)面反映出蛋白質(zhì)提取率隨著液料比的增加先上升后下降;從等高線可知，沿液料比軸向等高線比沿溫度軸向等高線密集，表明液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響更明顯。由圖3-E可知，時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響沒有液料比顯著，等高線圖的形狀為圓形，說(shuō)明兩因素的交互作用不顯著。由圖3-F可知，隨著時(shí)間延長(zhǎng)和溫度提高，蛋白質(zhì)提取率均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。等高線圖可表明時(shí)間和溫度的交互作用顯著。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面回歸模型，確定提取僵蠶蛋白質(zhì)的最佳條件：pH 值為8.12，液料比為58.03 mL ∶ 1.00 g，溫度40.06 ℃，時(shí)間204.49 min。在此條件下，預(yù)測(cè)其提取率值2.33%?？紤]實(shí)際操作，設(shè)置條件為：pH 值8.0，液料比58 mL ∶ 1 g，溫度40 ℃，時(shí)間 205 min，此時(shí)平均提取率為2.29%，與理論值基本吻合。

2.5 SDS-PAGE指紋圖譜分析

SDS-PAGE在蛋白質(zhì)的量化、比較及特性鑒定中是一種經(jīng)濟(jì)、方便和重復(fù)性好的方法[11-13]。僵蠶堿溶性蛋白質(zhì)的SDS-PAGE指紋圖譜結(jié)果（圖4）表明，僵蠶蛋白質(zhì)含有29.85 ku（c）與27.28 ku（d）的 2 條遷移率相近的高豐度特征性條帶，分別占總

蛋白量的36.37%與32.65%，同時(shí)還有78.8 ku（a）和69 ku（b）的較高豐度特征性條帶。范瑋等進(jìn)行的僵蠶、蜈蚣、土鱉蟲的蛋白質(zhì)指紋圖譜對(duì)比研究，也表明了上述條帶的種屬特異性[14]。由圖4可知，26～120 ku區(qū)間至少可觀察到11條蛋白質(zhì)條帶，25 ku 以下區(qū)間還至少可觀察到12條蛋白質(zhì)條帶，分辨率優(yōu)于已有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，已有很多響應(yīng)面法優(yōu)化蛋白質(zhì)提取工藝的報(bào)道。田景民等利用響應(yīng)面法優(yōu)化沙棘籽渣水溶性蛋白質(zhì)的提取工藝[15];王岸娜等采用響應(yīng)面

法優(yōu)化超聲輔助提取獼猴桃糖蛋白，與傳統(tǒng)提取法相比較，明顯縮短時(shí)間且蛋白得率提高[16];劉合生等采取響應(yīng)面法優(yōu)化水飛薊子中的可溶性蛋白質(zhì)提取工藝[17];張紅霞等采用響應(yīng)面法優(yōu)化苦蕎蛋白質(zhì)的提取工藝，使其提取率達(dá)到1.27%[18]。本研究首次嘗試稀堿法提取僵蠶蛋白質(zhì)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，確定了僵蠶堿溶性蛋白質(zhì)的最佳提取條件：緩沖液pH 值為8.0，液料比為58 mL ∶ 1 g，提取溫度為40 ℃，提取時(shí)間為205 min。此時(shí)僵蠶蛋白質(zhì)提取率為229%。驗(yàn)證試驗(yàn)表明實(shí)際值與理論值相吻合，證明響應(yīng)面法可以有效優(yōu)化僵蠶蛋白質(zhì)提取條件，為充分利用僵蠶蛋白質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)。本研究同時(shí)建立的僵蠶堿溶性蛋白質(zhì)SDS-PAGE指紋圖譜，為開發(fā)基于蛋白質(zhì)的僵蠶分子鑒定方法提供了參考依據(jù)，也為其他動(dòng)物類中藥材的鑒定提供思路。

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