馬雪明

（長安大學，陜西西安710021）

在體育運動中，韌帶受傷是常見的運動損傷現(xiàn)象。對于輕微的體育運動損傷，韌帶一般可進行自我修復，但對于嚴重的體育運動韌帶損傷，通常則需要進行手術修復。因此，研究新型的用于運動康復的人工韌帶材料，是當前新材料領域思考和研究的熱點。而關于人工韌帶的研究中，馮思嘉等研究了蠶絲生物材料在肌骨方面的應用［1］；荊曉偉等則從硅網(wǎng)支具對前交叉韌帶損傷的修復效果進行探討［2］；趙立連等對Endobutton 袢鋼板與Rigidfix 橫穿釘股骨端固定自體腘繩肌腱重建前交叉韌帶的轉歸做出了研究［3］；吳佳蔚等提出編織型絲素纖維人工韌帶可作為天然韌帶替換材料［4］，但編織型絲素纖維人工韌帶在生物力學性能上與天然韌帶還是有所差異。因此，尋找可替換的人工韌帶材料是當前運動康復材料領域中的重點。本研究則在以上研究的基礎上，嘗試對絲素纖維人工韌帶進行涂層改性及體外礦化，以求尋找一種穩(wěn)定效果更好的韌帶替代材料。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

實驗主要試劑見表1。

表1 實驗主要試劑信息Table 1 Main reagent information

1.2 試驗儀器

本實驗主要儀器見表2。

表2 實驗主要儀器信息Table 2 Main instrument information

1.3 試驗方法與過程

1.3.1 “12×12”結構人工韌帶編織

為避免蠶絲的免疫原性對人工韌帶造成影響［5］，在編織人工韌帶過程中先進行脫膠，將絲膠除去。具體步驟為：首先將NaNO3溶液和編織紗置于超聲波清洗機中振蕩，振蕩時間為12min; 然后用去離子水結合超聲波清洗機再次進行振蕩清洗；最后進行搓洗。重復以上步驟三次，直到編織紗表面無滑膩感即可。隨后，將脫膠后的編織紗纏繞在12 個編織機錠子上進行編織，得到脫膠后“12×12”結構人工韌帶。具體過程如圖2 所示。

圖1 “12×12”結構人工韌帶編織流程圖Fig. 1 Braiding flow chart of "12 × 12" artificial ligament

在上述實驗組的基礎上，設置1 組對照組，即將未脫膠的編織紗直接放在12 錠的編織機上進行編織，從而得到未脫膠的“12×12”結構的蠶絲人工韌帶。

1.3.2 涂層制備及人工韌帶改性

（1） 絲素蛋白（SF）制備及涂層改性

挑選清潔的蠶繭，去除內表面的污濁和外表面松散的繭衣，然后將其剪為1/4 指甲蓋大小，并放置在恒溫恒濕下24h。配置質量分數(shù)為5% 的Na2NO3溶液，在95℃和1∶50 的浴比下，用AS-12 染色機中進行脫膠處理，脫膠時間和脫膠頻率分別為35min 和60 r/min；取出脫膠后的混合物溶液，在60 ℃的超聲波清洗機中進行清洗，清洗時間為12min；然后用去離子水進行超聲清洗；最后進行搓洗。同樣根據(jù)1.3.1 的制備原理，重復以上步驟三次。將得到的松散纖維放在錫紙上，并用40 ℃電熱鼓風干燥箱進行干燥，干燥時間設定在 2～3 h；將干燥后的成品用9.3 mol/L 的 Li Br 溶液在染色機中進行溶解，溶解時間1h，水浴比為1:10，溶解溫度為95 ℃。將上述溶液進行過濾，裝入8000～14000 分子量的透析袋中進行透析，透析時間為72h，每隔4.5h 更換一次去離子水。透析完的溶液以 6000 r/min 的轉速離心 5 min，取上清液，冷凍干燥 72 h，得到再生絲素蛋白膜。

在上述步驟的基礎上，用絲素蛋白（SF）涂層對人工韌帶進行改性。具體步驟為：將人工韌帶在75 % 乙醇溶液中進行清洗，然后用去離子水進行清洗，并用GZX-GF101 電熱鼓風干燥箱進行風干；取上述制備得到的絲素蛋白，分別配制成質量分數(shù)為0.5%、1%、2%、4%的溶液。

將以上人工韌帶樣品分別放入4℃下的不同濃度的絲素蛋白溶液浸泡，浸泡時間為14h；取出樣品后，用PBS 磷酸鹽緩沖液片劑溶液浸潤，并進行真空干燥。為鞏固涂層，再次將處理好的樣品放入75 % 的乙醇溶液中浸泡2h，然后進行真空干燥24h，得到不同濃度的SFAL-SF 組。

（2） 海藻酸鈉（SA）涂層對人工韌帶的改性

將海藻酸鈉分別配制成質量分數(shù)為0.5%、1%、2%、4% 溶液，然后根據(jù)絲素蛋白的改性步驟對人工韌帶進行改性，得到不同濃度SFAL -SA 組。

（3） 絲素蛋白/海藻酸鈉（SF/SA) 復合涂層改性

選擇質量分數(shù)都為1%的SF、SA 溶液，并按照2:8、4:6、5:5、6:4、8:2 的比例混合，將混合后溶液進行磁力攪拌，攪拌時間為35min。得到不同比例的SF/SA 混合溶液。將混合溶液放置于4℃的環(huán)境中靜置12h，讓混合溶液穩(wěn)定。然后根據(jù)絲素蛋白的改性步驟對人工韌帶進行改性，得到不同比例SFAL -SF/SA 組。

1.3.3 礦化處理

利用交替浸漬法對經(jīng)改性和未經(jīng)改性的樣品進行體外礦化處理［6-7］。將礦化樣品放入200md/L 的CaCl2溶液中。樣品隨CaCl2溶液在37℃恒溫搖床上進行振蕩，振蕩速率為150r/min，振蕩時間為1h。振蕩結束后將樣品取出，吸干表面水分后放入120mol/L 的(NH4)HPO4溶液中，在37℃恒溫搖床上進行振蕩，振蕩速率為150r/min。重復以上步驟三次后將樣品取出，用去離子水沖洗，并吸干表面水分。將樣品隨油紙放入真空干燥箱進行干燥，干燥溫度為25℃，干燥時間為24h。得到礦化后SFAL-CaP、SFAL-SF-CaP、SFAL-SA-CaP、SFAL-SF/SA-CaP 組。

1.4 性能測試試驗

1.4.1 力學性能指標

用多功能強力儀對脫膠前后人工韌帶、復合溶液涂層改性后的人工韌帶及復合溶液涂層改性礦化后的人工韌帶進行拉伸試驗，測出斷裂強力、斷裂強度及斷裂伸長值，然后利用公式（1）計算出斷裂伸長率［8-9］，從而得到檢測樣品的力學性能數(shù)據(jù)。

式（1）中，e 表示斷裂伸長率，L0為式樣原來的長度， La為斷裂伸長。

1.4.2 涂層及礦化結果表征

（1）SEM（掃描電鏡）

將樣品處理成SEM 需要的大小，并用導電膠將樣品固定在電鏡臺上。在樣品上噴涂一層鉑金，以增強樣品的導電性。用JSM-IT200 電子顯微鏡對處理好的樣品涂層和礦化物形態(tài)進行表征，設置加速電壓為10kV。用Image-Pro Plus 軟件對SEM 圖像進行處理，可測量沉積物顆粒直徑。

（2）FTIR（紅外光譜）

使用iCAN 9 型傅里葉變換紅外光譜儀結合衰弱全反射法，對樣品進行測試。為保證實驗的準確性，掃描次數(shù)應不小于5 次。

1.4.3 SF/SA 固體表面Zeta 電位測試

在pH 值=6、7、8 環(huán)境下，利用固體表面Zeta 電位測試儀對SFAL、SFAL-1%SF、SFAL-1%SA、SFALSF∶SA=4∶6、SFAL-SF∶SA=5∶5、SFAL-1%SF-CaP、SFAL-1%SA-CaP、SFAL-SF ∶SA=4∶6-CaP 和SFALSF∶SA=5∶5-CaP 進行表面Zeta 電位測試。

2 結果與討論

2.1 人工韌帶力學性能

本文對脫膠前后人工韌帶力學性能進行了統(tǒng)計，結果見表3。

表3 人工韌帶脫膠前后力學性能對比Table 3 Comparison of mechanical properties of artificial ligament before and after degumming

通過表3 可知，脫膠后，韌帶的力學性能會發(fā)生一些改變，但對解剖兔韌帶力學性能分析，脫膠后的人工韌帶仍與之相近，能達到移植所需的力學要求。

2.2 涂層及礦化結果表征

2.2.1 涂層SEM 形貌分析

圖2 為SFAL(a)、SFAL-SF(b)、SFAL-SA(c) 及SFAL-SF/SA(d)涂層的SEM 圖像。通過圖2 進行涂層的形貌分析可發(fā)現(xiàn), 脫膠后的絲素纖維(a) 表面并無絲膠殘留且內部纖維相互獨立，（a）～(c) 樣品表面皆有漿料包覆感，且內部纖維相互粘連，涂層效果一樣。

圖2 SEM 圖像Fig. 2 SEM images

2.2.2 沉積物形貌分析

圖3 為單種涂層樣品礦化物SEM 結果，其中（a）為未經(jīng)涂層改性的樣品礦化物SEM 結果，（b）～(e) 為經(jīng)SF 改性后礦化物SEM 結果，（f）～（i）為經(jīng)SA 改性后礦化物SEM 結果。分析發(fā)現(xiàn)：未經(jīng)涂層改性的樣品礦化物不能完全包裹纖維。經(jīng)SF 涂層改性后的樣品，出現(xiàn)礦化物分布不均勻的情況，這是由于SF 涂層在纖維表面分布不均勻導致CaP 分布不均勻導致的；對比圖3 中（b）～(e)圖像可以發(fā)現(xiàn)，0.5%、1.0%沉積顆粒較均勻，2%、4% 的沉積物顆粒大小不一，有脫落風險。對比圖3 中（f）～（i）圖像可知，SA 涂層完全包裹纖維表面，CaP 之間呈相互連接的狀態(tài)，纖維內部也有沉積物。隨著SA 濃度的增加，礦化物加厚，有掉落風險，且隨SA濃度增加，纖維內部沉積物含量增加，可能會填充到骨骼內部的空隙中，對骨骼的恢復造成影響。綜上所述，1%的SF 和SA 涂層效果最佳，故復合涂層分別采用1% 的SA、SF 配制而成。

圖3 礦化物的SEM 結果Fig. 3 SEM results of mineralization

圖4 為不同比例SF/SA 復合涂層礦化物SEM 結果，（a）～（e）分別代表SF 與SA 比例為2:8、4:6、5:5、6:4、8:2 時的SEM 圖像，觀察圖4 可以發(fā)現(xiàn)，復合涂層能改善單組涂層的缺點，沉積物能很好地附著在樣品表面。當SF 與SA 比例為4:6、5:5 時，沉積物能夠覆蓋纖維表面，且顆粒均勻，能促進骨骼的愈合。

圖4 不同比例的復合涂層礦化SEM 結果Fig. 4 SEM results of mineralization of composite coatings with different proportions

2.2.3 FTIR 分析

圖5 為SFAL、SFAL-SF、SFAL-SA 及SFAL-SF/SA 的紅外譜圖。通過觀察圖5 可知，SF 與SA 涂層的引入讓靜電感應和振動頻率增加，導致1620cm-1酰胺I特征峰出現(xiàn)偏差到1633cm-1，同時因為SA 的存在，導致復合涂層在1227cm-1處的峰不明顯。

圖5 紅外譜圖Fig. 5 Infrared spectra

圖6 為SFAL-SF/SA-CaP、SFAL-CaP、SFAL-SFCaP、SFAL-SA-CaP 的紅外譜圖對比，分別在1024cm-1、607cm-1及563cm-1處出現(xiàn)波動。具體原因是PO43-在不同化學環(huán)境下分子振動導致，證實了礦化物中CaP 的存在。

圖6 人工韌帶礦化后的紅外譜圖Fig. 6 Infrared spectra of mineralized artificial ligament

2.3 固體表面Zeta 電位測試

測試結果如表4 所示。根據(jù)表4 結果看出，全部樣品都帶負電，只是其中的SFAL-1%SF 樣品在pH=7 和8下，以及SFAL 樣品在pH=8 下的負電荷帶電量較大，其余樣品所帶的負電荷都相差不大，沒有明顯的差異。根據(jù)以上數(shù)據(jù)說明，絲素蛋白在堿性的環(huán)境下很容易產(chǎn)生負電荷，比天然的絲素纖維更為敏感，且更具有穩(wěn)定性。

表4 固體表面Zeta 測試結果(V)Table 4 Zeta test results on solid surface

2.4 力學性能

圖7 是未脫膠(SAL)、脫膠后(SFAL)、復合涂層改性(SFAL-SF/SA)及復合涂層礦化后(SFAL-SF/SA-CaP )的力學性能對比。分析圖7 可知，脫膠對最大斷裂強力有所影響，經(jīng)涂層處理后有所回升。而經(jīng)過涂層改性結合礦化處理后，斷裂強力達到最大。故礦化對力學性能的提升有一定作用。

圖7 力學性能對比Fig. 7 Comparison of mechanical properties

3 結論

本研究利用編織手段，制備了“12×12”結構的人工韌帶，并進行脫膠處理得到基于絲素纖維的人工韌帶，同時利用不同濃度的絲素蛋白、海藻酸鈉及不同比例的絲素蛋白/海藻酸鈉混合材料對人工韌帶進行涂層處理。將處理后的樣品采取體外礦化，通過對固體沉積物的表征，探究了SA、SF 的最佳濃度參數(shù)及復合溶液的最優(yōu)比例。得到結論如下：

（1）脫膠后雖力學性能有所下降，但整體力學性能仍滿足天然力學性能特性。同時經(jīng)涂層改性可恢復力學性能的損失，礦化可優(yōu)化其力學性能，故該人工韌帶為可替換材料。

（2）試驗表明，SF、SA、SF/SA 涂層對纖維均有包覆感，且3 種不同濃度涂層改性后的人工韌帶形貌無明顯差異，但SF、SA 濃度為1%時，沉積物較為均勻，因此復合涂層質量分數(shù)選擇1%的SA 和SF 比較合適。

（3）當SFAL-SF：SA=5：5 時，沉積物粒徑更小且分布更均勻，此時得到的人工韌帶性能也最佳。

（4）固體表面Zeta 電位測試結果表明，所有樣品都帶負電荷，且絲素蛋白在堿性條件下更容易產(chǎn)生負電荷。