趙凌軍 楊衛(wèi)民 楊瀟遠(yuǎn) 李季

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)是常見的兒童眼內(nèi)惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率高，嚴(yán)重威脅著患兒視力與生命安全[1-2]。RB傳統(tǒng)治療方法包括放射治療、化學(xué)治療、激光以及眼球摘除等，但極易引起細(xì)菌感染、永久失明等，而且多數(shù)預(yù)后不良[3-5]。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的不斷提高，RB的治療目標(biāo)從只能保護患兒生命轉(zhuǎn)向提高患兒生存質(zhì)量；不僅需要保留患兒眼球，更需要保留患兒視功能。長鏈非編碼RNAs(long noncoding RNAs，lncRNAs)是由200多個堿基組成的一種非編碼RNA，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖與遷移的功能[6]。母系表達基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)定位在人類14q32.3染色體上，在人體正常組織中能夠廣泛表達，在一些腫瘤細(xì)胞中表達下降，且MEG3過表達能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖與遷移[7-8]。目前，lncRNA MEG3對RB的作用機制相關(guān)研究報道較少。因此，本研究基于Wnt/β-catenin信號通路探討lncRNA MEG3對RB細(xì)胞增殖與遷移的作用，為臨床RB治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人RB細(xì)胞系SO-Rb50細(xì)胞購自上海邦景實業(yè)有限公司。胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基、Wnt/β-catenin信號通路激活劑氯化鋰(LiCl)(美國Gibco公司)；兔抗人Wnt1多克隆抗體、兔抗人β-catenin、Cyclin D1單克隆抗體、辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔IgG(日本TaKaRa公司)；CCK-8試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(美國MedChemexpress生物科技公司)；熒光定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；脂質(zhì)體Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國SIM公司)；DFM-60C倒置熒光顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)取常規(guī)凍存復(fù)蘇的RB細(xì)胞系SO-Rb50細(xì)胞，接種于含體積分?jǐn)?shù)10% FBS、100 U·mL-1青霉素及20 mg·L-1慶大霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2～3 d傳代一次，選取對數(shù)生長期SO-Rb50細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 分組與細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期的RB細(xì)胞，按照200×103個·mL-1的密度將其接種到6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長密度在70%以上時按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將質(zhì)粒與脂質(zhì)體混勻，室溫孵育20 min，轉(zhuǎn)移至不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培育5 h，換成含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。48 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達到80%，可以進行后續(xù)實驗。將RB細(xì)胞分為對照組(不做任何處理)、NC組(含lncRNA MEG3-NC無序干擾序列的pcDNA3.1質(zhì)粒)、lncRNA MEG3組(含lncRNA MEG3序列的pcDNA3.1質(zhì)粒)、激活劑組(含lncRNA MEG3序列的pcDNA3.1質(zhì)粒+Wnt/β-catenin通路激活劑LiCl)，激活劑LiCl濃度為25 mmol·L-1。

1.2.3 RT-qPCR檢測各組RB細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3表達取各組轉(zhuǎn)染RB細(xì)胞，提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行RT-qPCR。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 15 s；退火58 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 20 s，共45個循環(huán)；然后72 ℃ 10 min，4 ℃終止反應(yīng)。lncRNA MEG3上游引物: 5’-CTTGACTTACCGTGAGTGT-3’，下游引物: 5’-CAGATGCACTTCTCAGACA-3’。采用2-△△Ct法對lncRNA MEG3表達進行定量分析。

1.2.4 CCK-8法檢測lncRNA MEG3對RB細(xì)胞增殖的影響取各組轉(zhuǎn)染RB細(xì)胞，調(diào)整RB細(xì)胞密度為50×103個·mL-1，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加10 μL CCK-8試劑，室溫繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測定490 nm的各孔吸光度(D)值，計算RB細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞抑制率=(D對照孔-D處理孔)/D對照孔×100%。

1.2.5 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染各組RB細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為200×103個·mL-1；在Transwell小室下室加入600 μL含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，上室加100 μL細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室，吸干上室液體，移入含800 μL甲醇的孔中，固定0.5 h；取出小室，吸干上室甲醇，移入含800 μL Giemsa染液的孔中，染色0.5 h；用清水緩慢沖洗5次，取出小室，吸去上室液體，小心擦去底部膜表面的細(xì)胞；揭下膜，底面朝上晾干，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。隨機取10個視野對RB細(xì)胞進行計數(shù)，求平均值。

1.2.6 RT-PCR檢測各組細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1的mRNA表達取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染各組RB細(xì)胞，用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。檢測各組RB細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA相對表達量。引物序列如下：Wnt1上游引物為5’-ACTCTCGACCGCGACTACAG-3’，下游引物為5’-GGCGACTCTCAGAGTGAACC-3’，大小為276 bp；β-catenin上游引物為5’-AAGTCTTGGCTATTACGACA-3’，下游引物為5’-AAGTCCACCTTCACGACCTT-3’ ，大小為253 bp；Cyclin D1上游引物為5’-CAGAGTCAGAGCTTAGGTCT-3’，下游引物為5’-GTAACGGAGTGTGCACAGCG-3’ ，大小為298 bp。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 15 s；退火58 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 25 s，40個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃終止反應(yīng)。采用2-△△Ct法對RB細(xì)胞中不同因子mRNA表達定量分析。

1.2.7 Western blot 檢測各組細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白表達取各組轉(zhuǎn)染RB細(xì)胞，提取總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量。95 ℃水浴變性8 min，進行聚丙烯酰氨凝膠電泳，電泳結(jié)束，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，封閉液室溫封閉2 h，分別加入Wnt1多克隆抗體、β-catenin、Cyclin D1單克隆抗體(按體積比12000 進行稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(按體積比14000進行稀釋)，37 ℃孵育1 h。TBST清洗6次，加入ECL顯色，拍照。以GAPDH作為內(nèi)參，檢測各組RB細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 各組RB細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3相對表達水平比較對照組、NC組、lncRNA MEG3組和激活劑組RB細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3相對表達水平分別為 0.81±0.27、0.78±0.26、3.88±0.39、3.76±0.38，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=28.515，P<0.05)。與對照組和NC組相比，lncRNA MEG3組和激活劑組RB細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3相對表達水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(與對照組相比:t=14.472、14.151，均為P<0.05；與NC組相比:t=14.789、14.472，均為P<0.05)；NC組與對照組、激活劑組與lncRNA MEG3組RB細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3相對表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.179，P=0.862；t=0.493，P=0.635)。

2.2 lncRNA MEG3對各組RB細(xì)胞增殖的影響CCK-8法檢測結(jié)果顯示：各組RB細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h細(xì)胞增殖抑制率組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與NC組相比，lncRNA MEG3組RB細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；與lncRNA MEG3組相比，激活劑組RB細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h細(xì)胞增殖抑制率逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。激活劑組與NC組RB細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 細(xì)胞增殖抑制率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。NC組、lncRNA MEG3組、激活劑組RB細(xì)胞增殖抑制率均隨時間延長而升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(見表1)。

表1 lncRNA MEG3對各組RB細(xì)胞增殖的影響

2.3 lncRNA MEG3對各組RB細(xì)胞遷移的影響對照組、NC組、lncRNA MEG3組和激活劑組RB細(xì)胞遷移數(shù)分別為(78.50±8.01)個、(72.80±7.25)個、(26.60±3.03)個、(54.60±5.79)個，組間細(xì)胞遷移數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=49.581，P<0.05)。與對照組相比，lncRNA MEG3組和激活劑組細(xì)胞遷移數(shù)均減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.551、5.407，均為P<0.05)；與NC組相比，lncRNA MEG3組和激活劑組細(xì)胞遷移數(shù)也均減少，差異也均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.147、4.386，均為P<0.05)；與lncRNA MEG3組相比，激活劑組細(xì)胞遷移數(shù)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.581，P<0.05)；NC組與對照組細(xì)胞遷移數(shù)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.180，P=0.272)(見圖1)。

圖1 各組RB細(xì)胞遷移情況(放大倍數(shù)：×200) A：對照組；B：NC組；C：lncRNA MEG3組；D：激活劑組。

2.4 各組RB細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1的mRNA相對表達水平比較qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：與對照組和NC組相比，lncRNA MEG3組和激活劑組RB細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA相對表達水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；與lncRNA MEG3組相比，激活劑組RB細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA相對表達水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。NC組與對照組RB細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA相對表達水平相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)(見表2)。

表2 各組RB細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA相對表達水平比較

2.5 各組RB細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白相對表達水平比較Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組和NC組相比，lncRNA MEG3組和激活劑組RB細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白相對表達水平均降低(均為P<0.05)；與lncRNA MEG3組相比，激活劑組RB細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白相對表達水平均升高(均為P<0.05)；NC組與對照組RB細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白相對表達水平相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)(見表3、圖2)。

表3 各組RB細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白相對表達水平比較

圖2 各組RB細(xì)胞中不同因子蛋白的表達 A：對照組；B：NC組；C：lncRNA MEG3組；D：激活劑組。

3 討論

RB是兒童中多發(fā)的遺傳性眼內(nèi)惡性腫瘤，嚴(yán)重影響患兒外貌、視力、心理發(fā)育等，甚至威脅患兒的生命安全。lncRNAs在多種疾病中發(fā)揮重要作用，甚至包括腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs在腫瘤的發(fā)生進展過程中具有抑癌基因的作用，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等過程[9]。MEG3是潛在的抑癌基因，其表達產(chǎn)物是第一個被發(fā)現(xiàn)具有腫瘤抑制功能的lncRNA。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA MEG3呈低表達，在宮頸癌細(xì)胞中高表達lncRNA MEG3可以增加細(xì)胞凋亡及減少細(xì)胞增殖。lncRNA MEG3在RB中研究較少，且其作用機制尚未完全清楚?？娚荷旱萚11]研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素能夠抑制RB細(xì)胞系 Y79細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路活化有關(guān)。因此，本研究分析了lncRNA MEG3對RB細(xì)胞增殖、遷移的作用，并探討是否與Wnt/β-catenin信號通路活化有關(guān)。

細(xì)胞增殖和凋亡在正常情況下維持著動態(tài)平衡，增殖失控或凋亡受阻導(dǎo)致平衡被打破，進而腫瘤發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3通過調(diào)控Notch信號通路有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖[12]。Lu等[13]在非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞系中過表達lncRNA MEG3后檢測細(xì)胞功能變化，結(jié)果顯示,細(xì)胞增殖明顯減少，細(xì)胞凋亡增加，提示lncRNA MEG3在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮抑癌作用。另外，lncRNA MEG3在肺癌及肝癌細(xì)胞的增殖與凋亡中也起關(guān)鍵作用[14-15]。本研究結(jié)果也顯示，lncRNA MEG3組較對照組RB細(xì)胞增殖抑制率升高，細(xì)胞遷移數(shù)減少；且RB細(xì)胞增殖抑制率隨作用時間延長而升高，表明過表達lncRNA MEG3能夠抑制RB細(xì)胞增殖及遷移能力。

Wnt/β-catenin信號通路廣泛存在于多細(xì)胞生物體內(nèi)，由Wnt基因調(diào)控，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化等生命過程中發(fā)揮重要作用，并參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移與凋亡過程[16-17]。在正常分化的細(xì)胞中，細(xì)胞膜上的β-catenin蛋白被磷酸化，通過泛素化降解，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中游離β-catenin蛋白減少，不能激活Wnt/β-catenin信號通路下游效應(yīng)因子的表達。當(dāng)Wnt/β-catenin信號通路被異常激活時，β-catenin和Wnt蛋白表達異常，激活下游Cyclin D1蛋白，使Cyclin D1蛋白異常表達，促進細(xì)胞增殖和遷移，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[18]。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路是人類多種疾病發(fā)生的關(guān)鍵，其被異常激活會促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[19-20]。鄧榮華等[21]研究發(fā)現(xiàn)，過表達lncRNA MEG3可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞凋亡。Liu等[22]通過對口腔鱗狀細(xì)胞癌進行研究，發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3能夠通過Wnt/β-catenin信號通路參與疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，與對照組和NC組相比，lncRNA MEG3組RB細(xì)胞Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA和蛋白相對表達水平均降低；添加Wnt/β-catenin信號通路激活劑后，與lncRNA MEG3組相比，激活劑組RB細(xì)胞Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA和蛋白相對表達水平均升高，表明lncRNA MEG3抑制RB細(xì)胞增殖及遷移，可能是通過增強Wnt1、β-catenin蛋白的磷酸化，加速泛素化降解，抑制Cyclin D1等靶基因的轉(zhuǎn)錄從而阻斷Wnt/β-catenin信號通路，抑制RB細(xì)胞的增殖及遷移。

綜上所述，lncRNA MEG3能夠抑制人RB細(xì)胞的增殖和遷移，其機制可能是通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路來發(fā)揮作用的。本研究結(jié)果可為RB的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。