鄭鑫輝，崔慧麗，邵 進(jìn)，孔德策，趙一丁，楊鐵毅

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)研究生院，寧夏 銀川 750004；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000；3.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院骨科，上海 200135)

克羅恩?。–rohn's disease，CD）是一種慢性炎癥性腸道疾病，以免疫介導(dǎo)和臨床反復(fù)發(fā)作過程為特征，CD 和潰瘍性結(jié)腸炎統(tǒng)稱為炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）[1，2]。CD 病因的確切機(jī)制尚不清楚，但有研究認(rèn)為可能是腸道通透性受損以及自身免疫、環(huán)境因素等共同導(dǎo)致的結(jié)果[3，4]。糞鈣衛(wèi)蛋白（fecal calprotectin，F(xiàn)C）可以作為CD 患者腸道嚴(yán)重程度的量化指標(biāo)[5]；zonulin 是調(diào)節(jié)細(xì)胞間緊密連接的調(diào)節(jié)劑，參與腸道通透性的調(diào)節(jié)[6]；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是參與CD 病理生理學(xué)相關(guān)的促炎細(xì)胞因子[7]，這些指標(biāo)對(duì)CD 的診斷和治療進(jìn)展都有深遠(yuǎn)的影響。CD 患者有降低BMD 和骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)，據(jù)報(bào)道[8，9]，CD 和骨質(zhì)疏松癥存在顯著相關(guān)性，且CD 患者發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加。CD 導(dǎo)致骨密度（bone mineral density，BMD）降低可能機(jī)制包括吸收不良和營(yíng)養(yǎng)不良、限制飲食（低維生素D 和鈣的攝入）、類固醇的使用、低身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）等[10，11]。然而腸道炎癥過程本身的作用及腸道通透性的作用尚未廣泛研究。骨質(zhì)疏松癥作為炎性腸病的主要并發(fā)癥如何受腸道炎癥影響的發(fā)病機(jī)制尚不明確。基于此，本研究通過對(duì)腸道炎癥指標(biāo)FC、血清zonulin、血清TNF-α 水平及對(duì)腸道組織進(jìn)行免疫組化和免疫熒光的觀察，探究CD 患者骨質(zhì)疏松癥可能的影響因素，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年1 月～2020 年10 月上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院診斷的60 例CD 患者設(shè)為CD組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合CD 診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡≥50歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病以及自身免疫系統(tǒng)疾病、遺傳性相關(guān)疾病患者；②肝腎功能異?；颊?；③就診前服用過影響骨代謝藥物史患者；④傳染病史。另選取同期門診就診的20 例體檢健康人員作為健康對(duì)照組。CD 組男28 例，女32 例，年齡51～79 歲，平均年齡61.55 歲；健康對(duì)照組男10 例，女10 例，年齡50～73 歲，平均年齡60.09 歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已經(jīng)通過上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審批并取得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 BMD 檢測(cè) 采用美國(guó)GE 公司生產(chǎn)的Prodigy型雙能X 線吸收骨密度儀，BMD 值以g/cm2為單位，測(cè)定部位為L(zhǎng)1～L4腰椎。參照2014 年WHO 制定的骨質(zhì)疏松癥T 值界定標(biāo)準(zhǔn)：T 值≥-1.0 為骨量正常，T 值-2.5～-1.0 為骨量減少,T 值≤-2.5 判定為骨質(zhì)疏松。

1.2.2 糞鈣衛(wèi)蛋白測(cè)定 患者于門診就診時(shí)直接留取其糞便標(biāo)本，按照9 ml/g 加0.01 mol/L PBS 進(jìn)行配比，最終得到糞便質(zhì)量：PBS 體積為1∶9。在冰上震蕩15 min 后于5000 xg 離心10 min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)糞鈣衛(wèi)蛋白試劑盒（華美生物，武漢）說明書中實(shí)驗(yàn)步驟，測(cè)定其含量。

1.2.3 血清zonulin、炎性因子測(cè)定 早晨空腹抽取受試者外周肘靜脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定zonulin、TNF-α 水平。根據(jù)zonulin 蛋白試劑盒（華美生物，武漢）、TNF-α 試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物，上海）說明書中實(shí)驗(yàn)步驟，在涂有特定單克隆抗體的96 孔板中添加標(biāo)準(zhǔn)液和測(cè)試血清，室溫孵育1 h 后，將板子在緩沖液中漂洗后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育45 min，再次漂洗后加入配置好的顯色液，使用酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific Inc.，USA）測(cè)量各孔的吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相應(yīng)含量[12]。

1.2.4 組織取材及ZO-1 表達(dá)檢測(cè) 在持續(xù)心電監(jiān)護(hù)狀態(tài)下分別使用電子腸鏡及活檢鉗留取受試者結(jié)腸組織標(biāo)本，大小為2 mm×3 mm。組織標(biāo)本置于40 g/L多聚甲醛溶液（pH 7.4）中，放置4 ℃固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸潤(rùn)，利用石蠟包埋后，使用組織切片機(jī)進(jìn)行切片處理，每個(gè)切片片厚4 μm。放到干燥箱內(nèi)烘烤，設(shè)置溫度為80 ℃。脫蠟、脫水，利用H2O2去離子水消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后利用枸櫞酸鈉緩沖液在高溫高壓下抗原修8 min，再用PBS 洗滌。滴加正常山羊血清封閉液，隨后滴加稀釋的一抗工作液（抗ZO-1 抗體，購(gòu)自Abcam 公司，1∶800 稀釋），4 ℃環(huán)境下放置一夜。在常規(guī)溫度下進(jìn)行復(fù)溫處理，PBS 洗滌5 次。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（羊抗鼠IgG，購(gòu)自博奧森公司，1∶800 稀釋），孵育40 min，PBS 洗滌3 遍。一方面免疫組化DAB 顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，OlympusIX51 顯微鏡下觀察腸粘膜組化免疫顯色情況；另一方面免疫熒光滴加二抗（綠）（羊抗鼠IgG，購(gòu)自博奧森公司，1∶1000 稀釋），室溫孵育3 h，PBS洗3 遍，Hochest 染色液5 min，PBS 洗3 遍，甘油封片，Olympus IX51 顯微鏡下觀察ZO-1 的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料呈正態(tài)分布且方差齊性采用t檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布但方差不齊采用校正t檢驗(yàn)，均以（）表示；不符合正態(tài)分布，則采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，以[M（P25，P75）]表示。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以[n（%）]表示。線性相關(guān)分析采用Spearman 秩相關(guān)，相關(guān)系數(shù)以r表示。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組BMD、FC、血清zonulin、TNF-α 比較 CD 組BMD 低于對(duì)照組，F(xiàn)C、血清zonulin、TNF-α 高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 CD 患者BMD 與血清zonulin、FC、TNF-α 相關(guān)性分析 Spearman 相關(guān)分析顯示，BMD 與FC、血清zonulin、TNF-α 均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見表2。

表1 兩組BMD、FC、血清zonulin、TNF-α 比較[，M（P25，P75）]

表1 兩組BMD、FC、血清zonulin、TNF-α 比較[，M（P25，P75）]

表2 CD 患者BMD 與血清zonulin、FC、TNF-α 相關(guān)性分析

2.3 健康對(duì)照組和CD 組結(jié)腸組織中ZO-1 表達(dá)及熒光強(qiáng)度情況比較 免疫組化染色顯示，與健康對(duì)照組相比較，CD 組結(jié)腸內(nèi)ZO-1 表達(dá)減少、熒光強(qiáng)度減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；免疫熒光染色顯示，與健康對(duì)照組比較，CD 組中黃色顆粒狀物質(zhì)明顯減少；且健康對(duì)照組中有豐富表達(dá)典型的網(wǎng)狀蛋白（ZO-1 的網(wǎng)狀染色），CD 組網(wǎng)狀蛋白形態(tài)被破壞并且不規(guī)則地分布，見圖1。

圖1 健康對(duì)照組和CD 組結(jié)腸組織中ZO-1 表達(dá)及熒光強(qiáng)度情況

3 討論

骨質(zhì)疏松是一種以骨量下降和骨細(xì)微結(jié)構(gòu)破壞為特征的系統(tǒng)性骨病，尤其在中高齡群體常發(fā)，是骨折風(fēng)險(xiǎn)的高危因素，已成為CD 患者發(fā)病率較高的腸外表現(xiàn)。研究表明[12-14]，CD 患者中骨質(zhì)疏松癥的診斷率高達(dá)19.8%，其主要的危險(xiǎn)因素包括腸道炎癥的活動(dòng)性和嚴(yán)重程度、腸道吸收不良導(dǎo)致的鈣、鋅的攝入不足等。因此，減少CD 患者的腸道炎癥程度可能成為治療骨質(zhì)疏松的必要環(huán)節(jié)。FC 作為腸道炎癥的敏感標(biāo)志物，是由炎癥反應(yīng)中被活化的腸道中性粒細(xì)胞分泌，能抵抗酶的降解，一方面其表達(dá)水平不僅能夠預(yù)測(cè)治療效果，還能夠反映腸道粘膜病變的嚴(yán)重程度[15]；另一方面，F(xiàn)C 含量與CD 的組織學(xué)緩解和粘膜是否愈合具有良好的相關(guān)性，而且FC 與CD 的組織學(xué)檢查結(jié)果（內(nèi)窺鏡評(píng)分）有也很好的相關(guān)性[16，17]，因此其可作為監(jiān)測(cè)CD 炎癥活動(dòng)狀態(tài)的輔助措施。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD 組FC 水平較健康組升高，且與BMD 存在負(fù)相關(guān)（P＜0.05），提示腸道炎癥的嚴(yán)重程度可能影響B(tài)MD 的水平，進(jìn)一步驗(yàn)證了FC 作為CD 診斷的輔助性檢查指標(biāo)的可靠性[18]。同時(shí)，有研究顯示[10]，CD 患者骨質(zhì)疏松發(fā)生率有明顯上升趨勢(shì)，表明腸道炎癥與BMD 下降具有相關(guān)性，當(dāng)腸道炎癥的活動(dòng)性增高時(shí)，很可能會(huì)導(dǎo)致BMD的下降。但腸道炎癥本身會(huì)導(dǎo)致多種有害因素，而這些有害因素與BMD 降低具有一定的相關(guān)性，研究表明[19]，CD 患者的BMD 會(huì)隨著病情的緩解而有所改善。因此，采用非侵入性且簡(jiǎn)單有效的檢查手段量化CD 患者的腸道炎癥的改變，進(jìn)而通過治療腸道炎癥來減緩骨質(zhì)疏松的進(jìn)程，這種方式可能成為未來治療CD 誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的主要方向。

血清zonulin 升高會(huì)通過破壞腸道上皮細(xì)胞的緊密連接來影響腸通透性，使緊密蛋白ZO-1 的結(jié)構(gòu)破壞，其濃度的增加與腸道屏障完整性的喪失有關(guān)，腸通透性的增加在CD 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了核心的作用[20，21]。粘膜屏障的改變會(huì)導(dǎo)致腸道通透性增加，從而促進(jìn)腸腔內(nèi)物質(zhì)的暴露，并觸發(fā)腸道炎癥的免疫反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致CD 的發(fā)生[22]。既往研究表明[23，24]，在CD 患者中血清zonulin 水平明顯升高。本研究中CD 組血清zonulin 水平高于健康對(duì)照組，且與BMD存在負(fù)相關(guān)（P＜0.05），提示CD 患者的腸通透性受損，使血清zonulin 的表達(dá)上調(diào)并且腸道屏障的破壞與BMD 下降具有相關(guān)性。盡管目前關(guān)于血清zonulin 與BMD 關(guān)系的研究較少，但有研究表明[25]，腸道屏障功能參與糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥（GIO），并確定了腸道是預(yù)防GIO 的新型治療靶標(biāo)。因此，腸道通透性的增加可能是CD 誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的重要條件，通過定量檢測(cè)血清zonulin 的水平來觀察腸道通透性的改變，一方面zonulin 水平可能成為CD 的輔助診斷，另一方面其還可以作為CD 誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的進(jìn)展評(píng)估。ZO-1 是腸道屏障的組成部分，當(dāng)腸道屏障遭到破壞時(shí)，ZO-1 表達(dá)及其結(jié)構(gòu)就會(huì)遭到破壞[26，27]。本研究中通過腸道活檢發(fā)現(xiàn)，CD 患者的腸道免疫組化和免疫熒光結(jié)果顯示緊密連接蛋白遭到破壞，進(jìn)一步驗(yàn)證了CD 患者的腸通透性受損。這些觀察結(jié)果與以下假設(shè)相符：增加腸道通透性可能是CD 誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的重要條件。因此，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以評(píng)估CD 患者若恢復(fù)腸屏障功能能否對(duì)骨質(zhì)疏松的進(jìn)展起到抑制作用。

CD 患者體內(nèi)存在著免疫介導(dǎo)的炎癥狀態(tài)，其特征是不同炎癥通路的激活和TNF-α 等不同細(xì)胞因子的異常分泌，抗TNF-α 是治療CD 的首選生物療法[7]。TNF-α 是破骨細(xì)胞形成的主要角色，可通過誘導(dǎo)NF-κB 轉(zhuǎn)錄的激活，并通過抑制成骨細(xì)胞分化減少骨形成，進(jìn)而導(dǎo)致BMD 改變[28]。因此，TNF-α不僅在CD 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮核心作用，還參與骨代謝，通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性促進(jìn)骨吸收。本研究結(jié)果顯示，CD 組TNF-α 水平高于健康對(duì)照組，且與BMD 存在負(fù)相關(guān)（P＜0.05），提示腸道炎癥誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松可能與自身免疫調(diào)節(jié)異常有關(guān)。持續(xù)的炎癥或腸道屏障完整性的長(zhǎng)期失調(diào)會(huì)引發(fā)或加劇CD，而且炎癥性細(xì)胞因子TNF-α 增加通過改變緊密連接功能和結(jié)構(gòu)使上皮通透性增加[29]。因此猜測(cè)，腸道炎癥改變、腸道通透性增加和炎癥相關(guān)通路三者之間相互影響，共同促進(jìn)BMD 下降。但由于本研究的樣本少，設(shè)計(jì)局限，觀察周期短等不足之處，上述猜測(cè)需進(jìn)一步深入研究證實(shí)。

綜上所述，F(xiàn)C、血清zonulin 的水平檢測(cè)對(duì)CD患者腸道炎癥改變和腸道通透性評(píng)估具有一定價(jià)值，CD 誘導(dǎo)的BMD 改變與腸道炎癥改變、腸道通透性增加及血清TNF-α 具有相關(guān)性。但針對(duì)炎癥反應(yīng)的治療仍需進(jìn)一步探索，以緩解或恢復(fù)CD 患者的腸道功能，從而控制骨質(zhì)疏松。