宮田嬌 付 源 李 冰 周 影 王樂天 張世宇 楊淑芳*

(1.吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院，吉林吉林 132012；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118；3.德惠市園藝特產(chǎn)工作室，吉林長春 130300)

我國是世界上最大的蠶絲生產(chǎn)國，作為蠶絲生產(chǎn)的副產(chǎn)物，鮮蠶蛹年產(chǎn)量超過50萬t，占世界總產(chǎn)量的70%以上[1]。蠶蛹的蛋白質(zhì)含量在50%以上，遠遠高于一般食品，且蛋白質(zhì)中的必需氨基酸種類齊全[2]。柞蠶蛹蛋白質(zhì)由18種氨基酸組成，其中人體必需的8種氨基酸含量很高，比例適當(dāng)，符合FAO/WHO(聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織)的要求；蠶蛹也含有鉀、納、鈣、鎂、鐵、銅、錳、鋅、磷、硒等微量元素[3]，維生素A、E、B1、B2，胡蘿卜素等[4]；蠶蛹中的不飽和脂肪酸的含量非常豐富，約占總脂肪的72.5%。此外，蠶蛹還具有很多藥理作用：例如具有降低人的血清膽固醇的功能；對冠心病、動脈硬化、高血壓、肝硬化和糖尿病有較好的防治作用[5]；柞蠶蛹蛋白肽還具有抗疲勞、抗氧化、抗衰老的功能；可用于治療白血球減少癥，急慢性、中毒性肝炎和生理衰退等病癥[6]。

2020年月4月24日，Attaribo Thomas等[7]研究表明家柞蠶蛹蛋白(SPP)與花青苷-3- O-葡萄糖苷(C3G)的相互作用對花青素保護穩(wěn)定性的影響。 2020年3月21日，F(xiàn)elix Manuel等[8]重點研究了從家蠶蛹中提取的蛋白濃縮物(SPC)的技術(shù)功能特性(界面和發(fā)泡特性)和體外抗氧化活性。2019年月1月30日，閔建華、王浩等[9]研究柞蠶蛹蛋白抗氧化活性肽的分離技術(shù)，并分析抗氧化活性肽的氨基酸成分等實驗。2005年，趙鵬[10]以柞蠶蛹蛋白為原料，采用酶水解方法研究了蠶蛹活性肽。

近年來利用微生物發(fā)酵法除臭脫脂柞蠶蛹蛋白和制備抗氧化肽報道較少。本文采用微生物發(fā)酵法脫除柞蠶蛹蛋白臭味和制備抗氧化肽，并采用響應(yīng)面優(yōu)化了最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

菌種：副干酪乳桿菌(1.9089)、嗜熱鏈球菌(1.1855)、青春雙歧桿菌(1.2190)三種菌從中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)購置。

培養(yǎng)基：CGMCC提供培養(yǎng)基配方。搖瓶培養(yǎng)基[11]：全價脫脂柞蠶蛹蛋白粉50 g /L，121 ℃滅菌20 min。

1.2 材料與儀器

材料：全價脫脂柞蠶蛹蛋白粉，由吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院提供；DPPH自由基 ( 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) ，購自美國 Sigma 公司。其他試劑均為分析純。

儀器：超凈工作臺，培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，pH計，全自動凱氏定氮儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 單菌種的篩選

取斜面培養(yǎng)基保藏的菌種接種在平板培養(yǎng)基中，在42 ℃下活化培養(yǎng)23 h，然后在平板培養(yǎng)基用接種環(huán)挑取1-2環(huán)生長旺盛的菌落，接入裝有100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，42 ℃下，170 r/min搖床培養(yǎng)23 h。以4%接種量接到搖瓶培養(yǎng)基中 ，42 ℃下，170 r/min 搖床培養(yǎng) 23 h。然后，4 800 r/min離心20 min，得到不同菌種的搖瓶發(fā)酵液。測定不同菌種發(fā)酵液的可溶性多肽含量、SN-TCA指數(shù)、DPPH自由基清除率，感官評定值來篩選主發(fā)酵菌種。

1.3.2 混合菌種的篩選

選用篩選出來的菌種作為主發(fā)酵菌種，將該菌種與兩種不同的乳酸菌分別組合進行混合發(fā)酵，以不同組合菌種發(fā)酵液的可溶性多肽含量、SN-TCA指數(shù)、DPPH自由基清除率，感官評定值來篩選最佳組合菌種。

1.3.3 單因素試驗

表1-1 單因素試驗因素水平表

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

表1-2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗水平表

1.3.5 柞蠶蛹多肽含量的測定[12]

向10 mL不同菌種發(fā)酵液中加入10 mL10%三氯乙酸，混勻室溫放置30 min后，4 000 r/min離心20 min，利用凱氏定氮法測定上清液中的柞蠶蛹多肽含量。

1.3.6 樣品種總氮(蛋白質(zhì))的測定

根據(jù)國標(biāo)GB5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》的方法進行試驗。

1.3.7 SN-TCA指數(shù)的測定[13-14]：

SN-TCA 指數(shù)( % ) = ( 樣品中可溶性氮量/樣品中的總氮量) × 100%

1.3.8 DPPH自由基清除率的測定

以95%乙醇為溶劑，配制 DPPH自由基的濃度為 0. 2mmol /L。取發(fā)酵液2 mL，定容到100 mL?；旌险鹗幒笤谑覝叵路胖?0 min，517 nm測定吸光值。

表1-3 DPPH自由基實驗加樣表

計算公式：DPPH自由基清除率SA(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100%

1.3.9 發(fā)酵液感官評定[15-16]

表1-4 發(fā)酵液脫臭感官評定值標(biāo)準(zhǔn)

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均為平行測三次的值，采用origin9.0、Design-Expert8.0、Excel軟件進行分析。綜合利用產(chǎn)業(yè)化開發(fā)作了探討。

2 結(jié)果與分析

2.1 主發(fā)酵菌種的確定

取10名感官評定員的評分值的平均值為最終感官值，結(jié)果見表2-1。由表可以看出，嗜熱鏈球菌的發(fā)酵液的氣味比青春雙歧桿菌的氣味淡，且副干酪乳桿菌發(fā)酵液中稍有臭味，可能是由于菌種生長環(huán)境的不穩(wěn)定性造成的。由圖1可知，對不同菌種發(fā)酵液進行可溶性多肽、SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率進行測定。結(jié)果表明，嗜熱鏈球菌的多肽含量、SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率比其他兩種菌高。綜上考慮，本實驗采用嗜熱鏈球菌作為主發(fā)酵菌，更能提高蛋白質(zhì)的水解效果。

表2-1 單菌種發(fā)酵液感官評定值

圖1 不同菌種可溶性多肽含量、SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率的比較

2.2 混合菌種組合的確定

表2-2為感官評分設(shè)定表。由表2-2可以看出，嗜熱鏈球菌和青春雙岐桿菌的發(fā)酵液的臭味比嗜熱鏈球菌和副干酪乳桿菌的淡，且嗜熱鏈球菌和副干酪乳桿菌發(fā)酵液中略有臭味。由圖2可知，菌種組合為嗜熱鏈球菌和青春雙岐桿菌的多肽含量、SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率較高，可以判斷菌種組合為嗜熱鏈球菌和青春雙岐桿菌混合發(fā)酵脫脂柞蠶蛹蛋白得到的發(fā)酵產(chǎn)物提取抗氧化肽較好。綜上考慮，本實驗決定采用嗜熱鏈球菌和青春雙歧桿菌這一菌種組合作為最終發(fā)酵菌種。

表2-2 混合菌種組合發(fā)酵液感官評定值

圖2 混合菌種組合可溶性多肽含量、SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率的比較

2.3 菌種比例的確定

按1.3.1操作，不同菌種比例在接種量4%、pH6.8、42 ℃、170 r/min下?lián)u床發(fā)酵23 h，測定發(fā)酵液的上清液SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率。表2-3為感官評分設(shè)定表。由表2-3可以看出，菌種比例為1∶3(青春雙歧桿菌∶嗜熱鏈球菌)時，發(fā)酵液的感官評定值最高且味道無異味。由圖3可知，菌種接種比例為1∶3(青春雙歧桿菌∶嗜熱鏈球菌)DPPH自由基清除率和SN-TCA指數(shù)最大。綜合考慮選擇菌種比例為1∶3(青春雙歧桿菌∶嗜熱鏈球菌)。

表2-3 不同菌種比例發(fā)酵液感官評定值

圖3 不同菌種比例SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率的比較

2.4 接種量的確定

按1.3.1操作，不同接種量在菌種比例為1∶3(青春雙歧桿菌∶嗜熱鏈球菌)、pH6.8、42 ℃、170 r/min下?lián)u床發(fā)酵23 h，測定發(fā)酵液的上清液SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率。表2-4為感官評分設(shè)定表。由表2-4可以看出，接種量為4%時，發(fā)酵液的感官評定值最高且無異味。由圖4可知，當(dāng)菌種接種量在1%～3%之間變化時，DPPH自由基清除率、SN-TCA指數(shù)沒有顯著的差異，而當(dāng)接種量為5%時，DPPH自由基清除率較低，可能是菌種將一部分的多肽進行利用，導(dǎo)致抗氧化能力降低。當(dāng)接種量為4%時，DPPH自由基清除率、SN-TCA指數(shù)對比其他接種量較高，說明此接種量適合菌種生長同時發(fā)揮功能性作用。綜合考慮選擇最適菌種接種量為4%。

表2-4 不同接種量發(fā)酵液感官評定值

圖4 不同接種量SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率的比較

2.5 發(fā)酵溫度的確定

按1.3.1操作，不同發(fā)酵溫度在菌種比例為1∶3(青春雙歧桿菌∶嗜熱鏈球菌)、接種量4%、pH6.8、170 r/min下?lián)u床發(fā)酵23 h，測定發(fā)酵液的上清液SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率。表2-5為感官評分設(shè)定表.由表2-5可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度為42 ℃時，發(fā)酵液的感官評定值最高為4.45且無異味。如圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，各溫度下的發(fā)酵液的上清液SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率無顯著性差異。當(dāng)發(fā)酵溫度為42 ℃時，DPPH自由基清除率達最大。綜合考慮選擇最適發(fā)酵溫度為42 ℃。

表2-5 不同發(fā)酵溫度發(fā)酵液感官評定值

圖5 不同發(fā)酵溫度SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率的比較

2.6 發(fā)酵時間的確定

按1.3.1操作，不同發(fā)酵時間在菌種比例為1∶3(青春雙歧桿菌∶嗜熱鏈球菌)、接種量4%、pH6.8、42 ℃、170 r/min下?lián)u床發(fā)酵一定時間，測定發(fā)酵液的上清液SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率。表2-6為感官評分設(shè)定表.由表2-6可以看出，當(dāng)發(fā)酵時間為22 h時，發(fā)酵液的感官評定值最高為4.13且無異味。由圖6可知，隨著發(fā)酵時間的延長，DPPH自由基清除率、水解度都隨之增大，當(dāng)發(fā)酵時間達到22 h時，DPPH自由基清除率達最大。綜合考慮選擇最適發(fā)酵時間為22 h。

表2-6 不同發(fā)酵時間發(fā)酵液感官評定值

圖6 不同發(fā)酵時間SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率的比較

2.7 pH的確定

按1.3.1操作，菌種比例為1∶3(青春雙歧桿菌∶嗜熱鏈球菌)、接種量4%、42 ℃、170 r/min下?lián)u床發(fā)酵23 h，測定發(fā)酵液的上清液SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率。表2-7為感官評分設(shè)定表。由表2-7可以看出，當(dāng)pH為6.8 時，發(fā)酵液的感官評定值最高為4.74且無異味。由圖7可知，當(dāng)pH在6.4～6.6、7.0～7.2之間變化時，DPPH自由基清除率變化不大，SN-TCA指數(shù)呈先升高后降低變化趨勢，當(dāng)pH為6.8時，DPPH自由基清除率最好，可能在此條件下，菌種生長較好，菌種與產(chǎn)物結(jié)合能力較高，酶活力較高，SN-TCA指數(shù)也較高，使產(chǎn)物的抗氧化能力增加。綜合考慮選擇最適pH值為6.8。

表2-7 不同pH發(fā)酵液感官評定值

圖7 不同pH SN-TCA指數(shù)和DPPH自由基清除率的比較

2.8 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實驗設(shè)計原理，以pH、菌種接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為自變量，以感官評定值為除臭指標(biāo)，以DPPH自由基清除率為提取抗氧化肽指標(biāo)，設(shè)計四因素三水平響應(yīng)曲面實驗。

2.8.1 以感官評定值為指標(biāo)的響應(yīng)面實驗

由表2-8可以看出，感官評定值整體模型的P值<0.0001，說明模型極顯著，失擬項的P值分別是0.0579>0.05，說明實驗方法是可靠的，使用這個模型模擬真實的四因素三水平的分析是可行的。相關(guān)系數(shù)R2為0.9683，表明感官評定值的預(yù)測值與實際值之間具 有 較 好 的 擬 合 度。其 校 正 決 定 系 數(shù) R2Adj為0.9365，表明只有約6.35%的總變異不能用此模型來解釋，模型的信噪比為17.863>4，進一步說明本模型設(shè)計是非常成功的。從三個因素對水解效果的影響來看，回歸方程的一次項A(P<0.0001)和B(P<0.0001)對感官評定值的線性效應(yīng)有極顯著影響，影響評定值順序為pH>菌種接種量>發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度；二次項A2、B2、C2、D2均<0.001，說明對感官評定值的曲面效應(yīng)均有極顯著影響。AD<0.05，說明交互作用顯著，而其他因素交互作用的P值均大于0.5，說明其交互作用均對感官評定值的影響不顯著。其交互作用的響應(yīng)曲面見圖8。

表2-8 感官評定值回歸模型方差分析

圖8 各因素對感官評定值的影響

通過Design Expert 8.0軟件回歸分析，得到與各因素之間的二次多項回歸方程為：

Y=4.55-0.043A-0.084B+0.026C+0.031D+0.000AB+0.023AC+0.050AD+5.000×10-3BC+2.500×10-3BD+0.010CD-0.088A2-0.11B2-0.12C2-0.070D2

2.8.2 以DPPH自由基清除率為指標(biāo)的響應(yīng)面實驗

由表2-9可以看出，DPPH自由基清除率整體模型的P值<0.0001，說明模型極顯著，失擬項的P值分別是0.0807>0.05，說明實驗方法是可靠的，使用這個模型模擬真實的四因素三水平的分析是可行的。相關(guān)系數(shù)R2為0.9472，表明感官評定值的預(yù)測值與實際值之間具 有 較 好 的 擬 合 度。其 校 正 決 定 系 數(shù) R2Adj為0.8945，表明只有約10.55%的總變異不能用此模型來解釋，模型的信噪比為15.727>4，進一步說明本模型設(shè)計是非常成功的。從三個因素對水解效果的影響來看，回歸方程的一次項A(P<0.05)對DPPH自由基清除率的線性效應(yīng)有顯著影響，影響評定值順序為pH>發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>接種量；二次項A2、C2、D2均<0.001說明對DPPH自由基清除率的曲面效應(yīng)均有極顯著影響。AC、BC和CD<0.05，說明交互作用顯著，而其他因素交互作用的P值均大于0.5，說明其交互作用均對感官評定值的影響不顯著。其交互作用的響應(yīng)曲面見圖9。

表2-9 DPPH·清除率回歸模型方差分析

圖9 各因素對DPPH自由基清除率的影響

通過Design Expert 8.0軟件回歸分析，得到與各因素之間的二次多項回歸方程為：

Y=93.48-0.073A-0.078B+0.024C+0.033D+0.095AB+1.25AC+0.043AD-0.77BC+0.040BD+1.32CD-2.34A2-1.04B2-3.34C2-1.87D2

2.8.3 驗證實驗

由 Design Expert 8.0分析實驗結(jié)果，得出感官評定值響應(yīng)曲面的最優(yōu)方案為: pH為6.76，接種量為3.61%，發(fā)酵溫度為42.72 ℃，發(fā)酵時間為23.31 h，在此條件下感官評分理論上可達到4.57174；以DPPH自由基清除率響應(yīng)面的最優(yōu)方案為：pH為6.77，接種量為4.02%，發(fā)酵溫度為42.56 ℃，發(fā)酵時間為23.19 h，在此條件下DPPH自由基清除率理論上可達到93.5498%。在此條件下進行實驗得出: SN-TCA 指數(shù)為 48.38%，DPPH自由基清除率79.82%。由于實驗操作的可行性，將微生物發(fā)酵法脫除柞蠶蛹蛋白臭味和制備抗氧化肽的工藝條件修正為pH為6.8，接種量為4%，發(fā)酵溫度為43 ℃，發(fā)酵時間為23 h，在此條件進行3次平行驗證實驗，感官評定均值為4.65，DPPH自由基清除率為93.78%，證實該模型的有效性。

3 結(jié) 論

1)采用3種乳酸菌發(fā)酵脫脂柞蠶蛹蛋白，通過測定感官評定值、可溶性多肽含量、SN-TCA指數(shù)，以及發(fā)酵產(chǎn)物的DPPH自由基清除率選擇嗜熱鏈球菌(1.1855)作為發(fā)酵制備脫脂柞蠶蛹蛋白抗氧化肽的主發(fā)酵菌種。

2)選用篩選出來的嗜熱鏈球菌(1.1855)作為主發(fā)酵菌種，將該菌種與兩種不同的乳酸菌分別組合進行混合發(fā)酵，以不同組合菌種發(fā)酵液的可溶性多肽含量、SN-TCA指數(shù)、DPPH自由基清除率，感官評定指標(biāo)值確定最佳混合菌種組合為青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌，菌種比例為1∶3。

3)通過響應(yīng)面分析優(yōu)化微生物發(fā)酵法脫除柞蠶蛹蛋白臭味和制備抗氧化肽的工藝條件，得到最佳工藝條件為：pH為6.8，接種量為4%，發(fā)酵溫度為43 ℃，發(fā)酵時間為23 h。在最佳條件下進行發(fā)酵試驗，測得感官評定值為4.65，DPPH自由基清除率為93.78%。