王志強(qiáng) 張慧華

(1.南陽市經(jīng)濟(jì)作物技術(shù)推廣站，河南南陽 473000；2.河南民興生物科技股份有限公司，河南社旗 473300)

用蠶絲生產(chǎn)絲織品的過程中需要經(jīng)過精練工序，以除去殘余的絲膠[1]和雜質(zhì)。絲膠蛋白具有保水吸濕[2]、抗氧化[3]、凝膠化[4]、防治糖尿病[5]、皮膚消炎和消毒[6]等多種生物活性，已廣泛應(yīng)用在織物后整理涂層、化妝品添加劑等領(lǐng)域[7-8]，是一種理想的醫(yī)藥和功能性生物材料[9]。從絹紡精練液中提取高純度、易溶性絲膠粉末,將絲膠廢液變廢為寶,對(duì)保護(hù)環(huán)境和增加生產(chǎn)效益具有重要意義。桑蠶絲條吐是絹紡材料之一，本文對(duì)桑蠶絲條吐精練液中回收的絲膠蛋白的氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量及溶解性進(jìn)行測定，以期為絲膠蛋白的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

絲膠蛋白粉，桑蠶絲條吐精練液中提取所得，蛋白質(zhì)含量91.26%(河南民興生物科技股份有限公司中式設(shè)備生產(chǎn)，具體工藝參照王志強(qiáng)等[10]的方法)；碳酸鈉、檸檬酸三鈉、丙烯酰胺、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺、氨水、丙酮(國藥試劑)；鹽酸、三羥甲基氨基甲烷、4×蛋白上樣緩沖液(含β-巰基乙醇)、四甲基乙二胺、過硫酸銨、氯化鈉、甲醇、冰醋酸、彩虹廣譜蛋白Marker(范圍11～180 KD、3.3～20.1 KD)、十二烷基硫酸鈉、甘氨酸、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán) G-250(北京索萊寶有限公司)；木瓜蛋白酶、大豆分離蛋白(美國 Sigma 公司)。

恒溫水浴鍋 HH-2(浙江力辰儀器科技有限公司)；pH計(jì) PHS-3E(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；紫外可見分光光度計(jì)752N (上海精密科學(xué)儀器有限公司)；電泳儀 DYY-300(美國Bio-Rad)；全自動(dòng)氨基酸分析儀(德國Mem Barpure GmbH公司)；超純水機(jī)、鼓風(fēng)干燥箱(浙江力辰儀器科技有限公司)；電子天平(上海恒平)；磁力攪拌器(金壇大地公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 絲膠蛋白氨基酸的組成

1)樣品處理：稱取25 g絲膠蛋白，去除脂肪、碳水化合物、色素和無機(jī)鹽。置于85 ℃烘箱烘干備用。酸水解：稱取干燥的絲膠蛋白7.5 mg，加入 2 mL5.7 mol/L鹽酸，置于110 ℃烘箱內(nèi)水解 24 h，然后除去過量的鹽酸，加入48 mL檸檬酸緩沖液稀釋到50 mL，搖勻，使蛋白質(zhì)完全變成氨基酸。取0.15 μmol的水解絲膠蛋白，分為20組上柱進(jìn)行分析。

2)分析：經(jīng)過上述處理后的絲膠蛋白上柱進(jìn)行分析。取水解絲膠蛋白 0.15μmol(水解絲膠蛋白干重為 0.45 mg)。在 pH5、100 ℃下進(jìn)行測定，反應(yīng)時(shí)間 12 min，生成的紫色物質(zhì)在 570 nm 波長下進(jìn)行比色測定，生成的黃色化合物在 440 nm 波長下進(jìn)行比色測定。同時(shí)將20組絲膠蛋白樣品一起裝入儀器，自動(dòng)按序分析，最后自動(dòng)計(jì)算出精確數(shù)值。重復(fù)測定3～5次，并以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(SD)的形式表示。

1.2.2 絲膠蛋白分子量的測定

采用SDS-PAGE法測定絲膠蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用15%的分離膠和4%的濃縮膠及1.5M pH8.8的Tris-鹽酸和1M pH6.8的Tris-鹽酸的緩沖液。制備凝膠，上樣(每孔上樣量10 μL，共10孔)，在80 V電壓下電泳30 min，120 V下電泳1 h，取出凝膠，固定(甲醇∶冰醋酸=4∶1 100),用考馬斯亮藍(lán) G-250溶液染色4 h以上，染色結(jié)束后脫色(甲醇∶冰醋酸=5∶1 100)3～5次，每次間隔30～60 min，直到蛋白質(zhì)條帶清晰可見，與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品條帶比對(duì)確定絲膠蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.3 絲膠蛋白的溶解性的測定

以絲膠蛋白溶液中牛血清白蛋白(BSA)當(dāng)量來表征其溶解性，BSA當(dāng)量越高，絲膠蛋白的溶解性越好。配置不同溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)和不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)的濃度為1.0%(w/V)的絲膠蛋白溶液，以探究溫度、pH值對(duì)絲膠蛋白的溶解性的影響。取5.00 mL 絲膠蛋白樣品10 000 g離心10 min，取500 μL稀釋20倍的上清液于試管中，加入 5.00 mL 考馬斯亮藍(lán) G-250溶液，混勻后室溫靜置 3 min，測定其在595 nm處的吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出BSA當(dāng)量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用0.04～0.20 mg/mL(5個(gè)濃度)的BSA代替絲膠蛋白樣品，其他操作同上，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(標(biāo)曲方程：y= 2.6286x +0.0135 , R2=0.997)。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲膠蛋白的氨基酸組成

絲膠蛋白氨基酸組成見表1。從表1可以看出，絲膠蛋白含有18種氨基酸，極性氨基酸占80.39%，非極性氨基酸占19.61%，其中絲氨酸含量最高，占氨基酸總量的27.52%，其次是天冬氨酸、蘇氨酸及甘氨酸，分別占15.91%、7.41%和7.29%。

表1 絲膠蛋白的氨基酸組成

2.2 絲膠蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的測定

絲膠蛋白電泳圖譜見圖1。

圖1 絲膠蛋白電泳圖

采用15%的分離膠和4%的濃縮膠及1.5 M pH8.8的Tris-鹽酸和1 M pH6.8的Tris-鹽酸的緩沖液電泳體系，來測定絲膠蛋白得相對(duì)分子質(zhì)量(圖1)。從圖1可以看出，桑蠶絲條吐精煉液中的絲膠蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大致分布在17～118 KD(條帶1、2、3)，集中分布于17～75 KD，通過膜過濾提取的絲膠蛋白分子量大致分布在17～75 KD(條帶4、5、6)，且隨脫膠條件的改變而有所不同。

2.3 絲膠蛋白溶解性的測定

不同溫度及pH值下絲膠蛋白的溶解性測定結(jié)果見圖2。

圖2 不同溫度及pH值下絲膠蛋白的溶解性

圖2A為不同溫度對(duì)絲膠蛋白溶解性的影響。從圖中可看出，在溫度從30 ℃升高至60 ℃時(shí)，絲膠蛋白的溶解性由0.14 mg/mL逐漸升高至0.18 mg/mL，SPI的溶解性由0.11 mg/mL升高至0.16 mg/mL，兩種蛋白的溶解性均隨著溫度的升高而增強(qiáng)，但在相同溫度下，絲膠蛋白的溶解性強(qiáng)于大豆分離蛋白。

圖2B為不同pH值下絲膠蛋白的溶解性。從圖中可看出，在pH值為3.0時(shí)，絲膠蛋白溶液中的可溶性蛋白含量最低為0.15 mg/mL，此時(shí)溶解性最差，這是由于絲膠蛋白等電點(diǎn)在pH 值3.5左右，此時(shí)絲膠蛋白的變性程度較大，溶解性最差；之后隨著pH值的升高，絲膠蛋白溶液的溶解性逐漸增強(qiáng)，這是由于當(dāng)pH值高于等電點(diǎn)后，隨著pH值的升高，絲膠蛋白所帶負(fù)電荷增多，溶解性增強(qiáng)。此外，在相同的pH值下，絲膠蛋白的溶解性強(qiáng)于大豆分離蛋白。

3 結(jié) 論

本文對(duì)從廢水中回收的絲膠蛋白的氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量及溶解性進(jìn)行測定，以期為絲膠蛋白的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)絲膠蛋白質(zhì)的氨基酸含量十分豐富，絲膠蛋白含有18種氨基酸，極性氨基酸占80.39%，非極性氨基酸占19.61%，其中絲氨酸含量最高，占氨基酸總量的27.52%，其次是天冬氨酸、蘇氨酸及甘氨酸，分別占15.91%、7.41%和7.29%。蠶絲桑條吐精煉液中的絲膠蛋白分子量分布在17～135 KD之間，集中分布于17～75 KD之間，且隨脫膠條件的改變而有所不同。絲膠蛋白具有良好的溶解性，其溶解性優(yōu)于水解膠原蛋白。