謝勇飛，趙 鋼，孫 娜，呂銀萍，吳 勇，沈美辰，呂文犇，高俊山

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥230036）

0 引言

棕色棉是具有棕色纖維特征的一種有色棉花，它是有色棉紡織品的重要原料之一，由于其在制成紡織品的過(guò)程中無(wú)需經(jīng)過(guò)染色、還有漂白等處理，不但能減少污染，還能降低生產(chǎn)成本，真正做到“綠色環(huán)?！保^為符合人們重歸自然的需求，因此棕色棉色素成因的研究越來(lái)越受到人們的注意[1-2]，但棕色棉纖維存在長(zhǎng)度短、強(qiáng)度不高、色素不穩(wěn)定等問(wèn)題[3-4]，引起了學(xué)者的關(guān)注，提升棕色棉纖維質(zhì)量問(wèn)題亟待解決。

學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，棕色棉纖維色素的形成和和色澤的累積與色素合成相關(guān)酶基因在纖維細(xì)胞中的特異性表達(dá)相關(guān)，棕色棉纖維色素的形成主要是由于纖維中積累了黃酮類(lèi)物質(zhì)，棕色棉纖維發(fā)育大致需要經(jīng)過(guò)纖維原始細(xì)胞的分裂突起、纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)、次生壁的加厚以及脫水成熟等4個(gè)時(shí)期[5-6]，棕色棉纖維的色素主要在纖維的中腔內(nèi)合成和累積[7-8]。邱新棉等[9-10]發(fā)現(xiàn)纖維發(fā)育的初期階段棕色棉并沒(méi)有色素的累積，色素的沉積主要在纖維發(fā)育的中后期階段，當(dāng)纖維進(jìn)入細(xì)胞壁加厚期時(shí)，纖維色澤逐漸表現(xiàn)出淡淡的棕色，而后色澤逐漸加深。

李廷春等[11]對(duì)棕色棉色素成分進(jìn)行研究表明，棕色棉纖維的色澤與原花青素相關(guān)物質(zhì)的累積具有一定的關(guān)聯(lián)，其認(rèn)為棕色棉色素的成分有可能為原花青素及其衍生物導(dǎo)致的。詹少華等[12]對(duì)不同溶劑提取的色素溶液進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜檢測(cè)，分析其結(jié)果得出棕色棉色素成分結(jié)構(gòu)中含有酚羥基官能團(tuán)，后又對(duì)棉籽種皮化學(xué)成分分析，認(rèn)為種皮細(xì)胞中的縮合單寧類(lèi)物質(zhì)可能在轉(zhuǎn)移纖維的過(guò)程中逐漸被氧化成醌類(lèi)物質(zhì)，而醌類(lèi)物質(zhì)被認(rèn)為是棕色棉色素的主要成分。Ryser[13]使用薄層色譜法和細(xì)胞化學(xué)等方法，在纖維的短絨中定性到單寧類(lèi)化合物的前體單元兒茶素及其衍生物，認(rèn)為這些物質(zhì)對(duì)棕色棉纖維的色澤呈現(xiàn)上起主要作用。Halloin[14]發(fā)現(xiàn)棉纖維是由種皮上細(xì)胞特化而來(lái)，所以原花青素很有可能與棕色棉纖維色素形成有關(guān)。Feng等[15]發(fā)現(xiàn)棕色棉中原花青素主要以表沒(méi)食子兒茶素等沒(méi)食子兒茶素為聚合單體聚合而成，與常見(jiàn)的原花青素有明顯區(qū)別。本實(shí)驗(yàn)室研究認(rèn)為棕色棉纖維色素主要成分是縮合單寧類(lèi)物質(zhì)，單寧類(lèi)化合物的前體物質(zhì)聚合成原花青素，氧化后形成色素成分[16]。

原花青素(Proanthocyanidin,PA)是屬于縮合單寧類(lèi)物質(zhì)，PA具有黃烷-3-醇和黃烷-3,4二醇結(jié)構(gòu)，由不同數(shù)量的沒(méi)食子兒茶素，表沒(méi)食子兒茶素，兒茶素，表兒茶素及其酯化產(chǎn)物縮合而成的聚合體，按照聚合度的大小可以分為低聚體和高聚體[17-19]，其主要存在于藍(lán)莓、葡萄、松樹(shù)皮等植物中。不同聚合度的PA在生物學(xué)活性上具有較大差異，低聚PA可以清除體內(nèi)的自由基和活性氧，有極強(qiáng)的抗氧化能力，能預(yù)防由于人體血液中低密度脂蛋白的氧化而引起的動(dòng)脈硬化、血管擴(kuò)張，具有抗炎、護(hù)膚、抗氧化和抗衰老等活性功能，更有維持血管的健康和改善微循環(huán)的作用[20-22]。目前，PAs作為一種非常有效的抗氧化劑，被廣泛應(yīng)用于日化、保健、食品、醫(yī)藥等方面[23-25]，同時(shí)以其穩(wěn)定性、無(wú)毒性、天然性等優(yōu)點(diǎn)備受人們的喜愛(ài)。

目前，植物中原花青素的提取研究較為廣泛和全面，有多種提取方法，如微波輔助法、雙酶法等。早期提取原花青素的方法主要是溶劑提取，常用溶劑是水，原料主要來(lái)自于葡萄籽、藍(lán)莓果渣、松樹(shù)皮等[26-27]。后來(lái)隨著技術(shù)的進(jìn)步，提取原花青素的方法大大的優(yōu)化及改進(jìn)，發(fā)展出了如超聲波輔助提取法、超臨界CO2提取法、微波提取法、超聲波微波聯(lián)用等提取工藝手段[27-30]。還有根據(jù)提取物的性質(zhì)不同，加入果膠纖維素酶制劑等，降解植物細(xì)胞壁，使原花青素提取物加速流出[31]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取原花青素的方法，得到最佳的原花青素提取工藝，為原花青素的生物活性研究和產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取生長(zhǎng)狀況良好且色澤為深棕的棕色棉品系‘棕彩選1號(hào)’(P26)，該品系被種植于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)高新技術(shù)農(nóng)業(yè)園。經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)，篩選原花青素含量最高的花后15天的棉桃，液氮冷凍，于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于索萊寶生物技術(shù)有限公司，甲醇、正丁醇、鹽酸試劑均為西隴科學(xué)股份有限公司分析純?cè)噭?80℃超低溫冰箱（合肥美菱股份有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），光照培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），移液器（德國(guó)Eppendorf公司），高壓蒸汽滅菌器購(gòu)買(mǎi)于（日本SANYO有限公司），-20℃冰箱（合肥美的電冰箱有限公司），紫外分光光度計(jì)（上海譜元儀器有限公司），超聲震蕩儀（昆山超聲儀器有限公司），離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 棕色棉纖維原花青素的提取及繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取開(kāi)花后15天的棕色棉桃，準(zhǔn)確稱(chēng)取棉纖維0.1000 g樣品于研缽中，液氮研磨，加入5 mL 80%甲醇，超聲溫度40℃，超聲頻率60 Hz，超聲處理30 min后，5000 r/min離心15 min。分別取400 μL上清液，吸取3 mL 5%鹽酸的正丁醇溶液，沸水浴20 min，迅速冰浴5 min，在550 nm可見(jiàn)光波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，使用80%的甲醇溶液作為對(duì)照溶液，梯度配置原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線，400 μL加入3 mL的5%鹽酸正丁醇溶液，繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線換算原花青素含量。

1.3.2 原花青素提取率 原花青素提取率的計(jì)算見(jiàn)公式(1)。

式中C為原花青素提取液濃度mg/mL；V為原花青素提取試液體積100 mL；W為棉纖維鮮重g。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別探討了不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇(70%、75%、80%、85%、90%)對(duì)原花青素得率的影響，其他條件為提取溫度20℃，超聲頻率設(shè)置為40 Hz，料液比為 1:20；不同溫度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)對(duì)原花青素得率的影響，其他條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度20℃，超聲頻率設(shè)置為40 Hz，料液比為1:20；不同的提取時(shí)間(15 min、20 min、25 min、30 min、35 min)對(duì)原花青素得率的影響，其他提取條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取溫度20℃，超聲頻率為40 Hz，料液比為1:20；不同料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)對(duì)原花青素整體得率的影響，其他反應(yīng)條件為提取溫度20℃，超聲頻率設(shè)置為40 Hz，料液比為1:20。

基于單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用Design Expert 8.0.5，Box-behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)超聲時(shí)間(A)、超聲溫度(B)、料液比(C)和甲醇濃度(D)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)（表1），以期獲得最佳的提取工藝條件。

表1 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝的試驗(yàn)因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，用1 mL 80%甲醇溶解，制備標(biāo)準(zhǔn)濃度1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，梯度稀釋制備成 100、200、300、400 μg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)原花青素溶液。用可見(jiàn)分光光度計(jì)在550 nm處依次測(cè)定吸光度值，甲醇作為對(duì)照溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍，得到線性回歸方程式(2)。

式中：Y為吸光度，X為原花青素濃度，單位μg/mL。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲時(shí)間對(duì)棕色棉纖維原花青素提取率的影響取棉纖維0.10 g，加入5 mL 80%甲醇研磨，改變不同的超聲時(shí)間(10～30 min)，用上述方法進(jìn)行原花青素得率測(cè)定。由圖1可以看出，在所選范圍內(nèi)原花青素的得率隨超聲時(shí)間的增大呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，超聲時(shí)間在10 min到15 min之間，原花青素得率隨超聲時(shí)間的增大迅速增加，而在15 min到25 min之間原花青素的得率趨于平緩，在25 min后趨于減弱。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在其他條件不變的情況下，選取15 min為適宜超聲時(shí)間。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)原花青素得率影響

2.2.2 超聲溫度對(duì)棕色棉纖維原花青素提取率的影響稱(chēng)取棉纖維0.10 g，加入5 mL 80%甲醇研磨，選取不同溫度(30℃～70℃)進(jìn)行試驗(yàn)，采用上述的方法測(cè)定原花青素含量。由圖2可以地看出，當(dāng)溫度接近50℃左右時(shí)，原花青素的提取率有所提高，但是溫度繼續(xù)上升，原花青素產(chǎn)量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，其原因可能和超聲溫度提高，原花青素結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定有關(guān)，直接影響其化學(xué)變化。因此，將溫度40℃～60℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)涉及的溫度范圍。

圖2 超聲溫度對(duì)原花青素得率影響

2.2.3 料液比對(duì)原花青素提取率的影響 稱(chēng)取棉纖維0.10 g，分別選取不同比例的料液比(1:40～1:65 g/mL)，通過(guò)鹽酸的正丁醇顯色反應(yīng)，在550 nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算原花青素的得率。結(jié)果顯示，隨著料液比的增大，棕色棉的原花青素得率緩慢增加，料液比為1:60以后，原花青素得率下降（圖3）。隨著萃取溶劑的增加，原花青素的提取率越高，當(dāng)溶劑比例過(guò)大時(shí)，溶液中的原花青素提取量達(dá)到飽和，濃度降低，造成試劑等材料的浪費(fèi)。因此，本次實(shí)驗(yàn)確定料液比1:60左右為最佳，并把料液比1:55～1:65 g/mL作為響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)的觀察范圍。

圖3 料液比對(duì)原花青素得率影響

2.2.4 甲醇濃度對(duì)棕色棉原花青素提取率的影響 稱(chēng)取棉纖維0.10 g，分別選取不同比例的甲醇濃度(75%～95%)進(jìn)行試驗(yàn)，按照上述同樣方法測(cè)定原花青素的得率。結(jié)果表明，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)增大，棕色棉原花青素得率值相應(yīng)增加，85%甲醇體積分?jǐn)?shù)在原花青素提取時(shí)得率最高，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)大于85%時(shí)，提取率稍微下降，而甲醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)90%后，得率繼續(xù)降低（圖4）。推測(cè)可能由于甲醇體積分?jǐn)?shù)升高，這導(dǎo)致醇溶性、色素、親脂性強(qiáng)的雜質(zhì)溶出率持續(xù)性增加，這些物質(zhì)更加容易和醇水結(jié)合，影響原花青素的溶出[13]。因此本次實(shí)驗(yàn)確定甲醇體積分?jǐn)?shù)為85%左右，提取的得率效果最佳，并把甲醇體積分?jǐn)?shù)80%～90%作為響應(yīng)面法的設(shè)計(jì)觀察范圍。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化棕色棉纖維原花青素提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案 提取條件按照Design Expert 8.0.5軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果

2.3.2 回歸方程分析 對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的原花青素得率進(jìn)行回歸分析，構(gòu)建二次回歸模型。

由方差分析（表3）的結(jié)果可知，該模型的f值3.00表明模型顯著，只有由于噪聲的存在，出現(xiàn)如此大的“模型f值”的概率為2.44%，小于0.0500的“Prob＞F”值，表明模型顯著，對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況較好。信噪比(Adeq Precisior)值為5.775，表示信號(hào)足夠，此模型可用于此次實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明C影響極其顯著，A2、C2、D2等因素與原花青素提取率關(guān)系密切。

表3 方差分析

綜上分析可知，該模型適合用于分析和預(yù)測(cè)棕色棉纖維原花青素提取能力，4種影響因子對(duì)提取率的影響程度依次為：超聲溫度＞甲醇濃度＞超聲時(shí)間＞料液比。

2.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化原花青素提取工藝 為了更好的系統(tǒng)地分析各因素對(duì)于原花青素提取的效率，使用響應(yīng)面法分析各個(gè)因素間的交互作用對(duì)原花青素提取效果的影響，其響應(yīng)曲面圖及其等高線圖如圖5。等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，高度越高等高線密度越大，代表兩因素交互關(guān)系較為顯著，相互影響也較大。由圖5可知，料液比、提取時(shí)間、甲醇濃度和提取溫度間的交互關(guān)系均出現(xiàn)弧形關(guān)系，得到的響應(yīng)面結(jié)果都具有一個(gè)極大值點(diǎn)，并且甲醇含量、料液比、提取時(shí)間和提取溫度的相互反應(yīng)等高線呈橢圓形，對(duì)提取率的影響較為顯著。

圖5 不同因素對(duì)原花青素提取效果影響的響應(yīng)面圖形和等高線

2.3.4 最優(yōu)原花青素提取工藝參數(shù) 基于選取的各因素范圍，通過(guò)Design Expect軟件分析及回歸模型，得出原花青素最優(yōu)提取條件為：甲醇濃度83%，料液比1:60.34 g/mL，超聲溫度41.56℃，超聲時(shí)間18 min，在此條件下，原花青素提取率的預(yù)測(cè)值為7.32%。考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)稍作調(diào)整為:甲醇濃度83%，料液比1:60 g/mL，超聲溫度42℃，超聲時(shí)間為18 min。

為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法測(cè)定結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，原花青素提取率為(7.16±0.03)%，與模型理論最大值(7.31%)接近，說(shuō)明模型可以?xún)?yōu)化原花青素提取的條件，也說(shuō)明了響應(yīng)面法對(duì)原花青素的提取條件參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化是可行的。實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)幾種不同方法對(duì)原花青素提取得率進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的甲醇-鹽酸正丁醇的方法提取原花青素的得率最高，平均值6.5%以上，依次是雙酶法，提取率大約為5.5%（圖6）。

圖6 不同方法提取原花青素的得率

3 討論

植物中原花青素提取有很多方法，如微波輔助法、雙酶法等。本研究將甲醇-鹽酸正丁醇與超聲輔助技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化甲醇濃度、料液比、超聲時(shí)間和溫度等條件，最大限度提高原花青素的提取率，獲得最佳棕色棉纖維原花青素的提取工藝。

在原花青素提取的過(guò)程中，目標(biāo)產(chǎn)物受溶劑的濃度、超聲時(shí)間和溫度、料液比等多種因素的影響，其中甲醇濃度在一定的范圍內(nèi)會(huì)影響目標(biāo)產(chǎn)物的得率，一般隨著甲醇濃度的升高而暫時(shí)的上升，但當(dāng)甲醇濃度超過(guò)85%的時(shí)候，得率不會(huì)發(fā)生顯著地變化，甚至還會(huì)下降。這種差異產(chǎn)生的可能原因是由于甲醇濃度過(guò)高，其他物質(zhì)溶出較多，競(jìng)爭(zhēng)加??；也有可能是甲醇過(guò)多，容易揮發(fā)，影響反應(yīng)的效率，導(dǎo)致提取率的下降。吳春等[32]用丙酮提取原花青素的最佳料液比為1:20，相較于丙酮危害性而言，選取低毒的甲醇更具安全性，并且擁有更好的效果。本試驗(yàn)用甲醇提取原花青素的最佳料液比為1:60，與硫酸-香草醛法[33]測(cè)定葡萄籽中原花青素含量相比差異明顯，這種差異可能是由于提取試劑和提取原料以及檢測(cè)方法的不同所致，在以往的報(bào)道中，原花青素多從葡萄籽中進(jìn)行提取，然而棕色棉中原花青素與葡萄籽中原花青素組成單元成分差異較大，組成成分不同，不同提取試劑的極性不同，所以選取不同的提取試劑，均會(huì)產(chǎn)生較大差異，如果能尋找到最佳的提取工藝，目標(biāo)產(chǎn)物得率會(huì)達(dá)到最高。在本試驗(yàn)中最佳甲醇濃度為83%，這可能是此濃度與提取的原花青素極性相當(dāng)?shù)脑?。在提取的過(guò)程中，溫度的升高有助于加速溶劑中分子運(yùn)動(dòng)的速度，原花青素?cái)U(kuò)散到溶劑中的速度加快，從而選取合適的超聲溫度使原花青素的得率增加，但溫度過(guò)高又會(huì)破壞原花青素結(jié)構(gòu)，而且還易使其他雜質(zhì)滲出，對(duì)后期的含量檢測(cè)有一定影響。因而提取過(guò)程中的溫度不宜設(shè)置的過(guò)高，本試驗(yàn)經(jīng)優(yōu)化最佳溫度為42℃，這與宋應(yīng)華等[34]得出原花青素的浸提溫度為50℃略有不同，差異可能與材料的品種差異、種植地、氣候，處理方法等因素有關(guān)。在提取時(shí)間上縮短為18 min為最佳，與其他方法的提取時(shí)間比較，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)提取時(shí)間有所縮短，可能是防止原花青素進(jìn)一步氧化聚合，從而影響得率。綜上所述，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究甲醇濃度、料液比、超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)棕色棉纖維中原花青素提取率的影響，在響應(yīng)面回歸分析法的基礎(chǔ)上，獲得了棕色棉纖維原花青素提取的最佳的工藝參數(shù)，雖然本文對(duì)棕色棉纖維原花青素進(jìn)行了提取分離，但前體單元的不同對(duì)原花青素聚合后的結(jié)構(gòu)功能影響巨大，后期生物學(xué)活性及功能需要更加深入的研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了棕色棉纖維原花青素的提取條件，結(jié)果顯示棕色棉纖維原花青素最佳提取工藝參數(shù)為：甲醇濃度為83%，料液比1:60 g/mL，超聲溫度42℃，超聲時(shí)間18 min，在此條件下的提取率為(7.16±0.03)%，比一般方法提高4%左右，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可應(yīng)用其他植物的原花青素提取，并能進(jìn)行批量提取，為今后原花青素的生物活性研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。