張成才，向增旭

（南京農業(yè)大學園藝學院，南京210095）

0 引言

菊科蒼術屬多年生植物——茅蒼術Atractylodes lancea(Thunb.)DC為江蘇省茅山地區(qū)道地藥材，具有燥濕健脾，祛風散寒，明目等功效[1]，其質量和療效也備受歷代醫(yī)家推崇，近年來由于生境變化、人為采挖等導致茅蒼術野生資源已瀕臨滅絕，種苗來源不足是制約人工栽培進展的主要原因之一[2]。為了保護這一種質資源、滿足市場需求，將組織培養(yǎng)應用于實際生產中，能在短期內獲得大量優(yōu)質試管苗，滿足生產種苗需求，目前已應用于工廠化生產中[3]。但研究發(fā)現(xiàn)，組培材料在長期繼代培養(yǎng)過程中存在著廣泛的遺傳變異，而大量變異會影響種苗的品質。因此，探究茅蒼術試管苗在長期繼代培養(yǎng)中的遺傳穩(wěn)定性具有非常重要的意義。

近年來，生物技術的發(fā)展使得藥用植物研究更加多元化，利用分子標記技術對組培材料進行遺傳穩(wěn)定性的檢測，可準確檢測出變異發(fā)生的代數(shù)，有利于優(yōu)良種質資源的保存和利用，目前，已成功應用于多種藥用植物中[4-5]。其中，簡單序列間重復(inter-simple sequence repeat,ISSR)作為目前廣泛應用的DNA分子標記技術，具有操作技術簡單，靈敏度高等優(yōu)點。DNA甲基化水平的變化受生理狀態(tài)、發(fā)育階段及環(huán)境刺激多種因素的影響，是一種重要的表觀遺傳修飾形式[6]。組培材料在經過多次繼代培養(yǎng)后甲基化水平往往會發(fā)生變化，甲基化敏感擴增多態(tài)性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技術常用于DNA甲基化水平和模式的分析，具有簡單易行、通用性強、可有效監(jiān)測DNA甲基化與基因表達關系等優(yōu)點[7-8]。許夢云等[9]運用ISSR分子標記技術對茅蒼術和北蒼術進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)茅蒼術比北蒼術的遺傳多樣性更高，與北蒼術有很近的親緣關系，且茅蒼術具有明顯的遺傳分化。王紅娟[10]運用ISSR分子標記技術研究二倍體和同源四倍體茅蒼術的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)茅蒼術二倍體和四倍體的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)差異較大，運用MSAP技術研究其基因組DNA甲基化水平及模式變化，發(fā)現(xiàn)四倍體基因組DNA全甲基化率低于二倍體，半甲基化率高于二倍體，與二倍體相比，四倍體DNA甲基化模式發(fā)生調整的基因位點占總檢測位點的52.53%。本研究以茅蒼術試管苗為材料，分別采用ISSR、MSAP兩種分子標記技術進行分析，探究不同繼代次數(shù)對茅蒼術試管苗基因組遺傳穩(wěn)定性及DNA甲基化的影響，以期為茅蒼術種質資源保存和工廠化生產提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

茅蒼術野生植株2018年7月采挖于江蘇省茅山地區(qū)，經南京農業(yè)大學園藝學院向增旭副教授鑒定為茅蒼術Atractylodes lancea(Thunb.)DC。取茅蒼術健壯頂芽建立無菌系轉入相同的繼代培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA)進行繼代培養(yǎng)，以25天為培養(yǎng)周期，共繼代10代，樣本從第1代到第10代分別編號為J、G、2、3、4、5、6、7、8、9。

限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自上海澤葉生物科技有限公司。Taq酶和d NTPs購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 茅蒼術基因組DNA提取、引物篩選、ISSR-PCR反應體系優(yōu)化和擴增產物檢測

采取改良的CTAB法進行DNA提取，提取產物取2～3 μL，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

ISSR-PCR反應擴增體系(25 μL)為：DNA模板約40 ng，10×Bufer2.5 μL，primer 0.3 μmol/L，4種dNTPs各0.25 μmol/L，MgCl21.5 mmol/L，TaqDNA聚合酶（北京優(yōu)吉科技有限公司）1.25 U/μL，引物0.6 μmol/L，緩沖液2 μL，dd H2O補足至20 μL。

PCR擴增程序為：94℃預變性5 min，然后進行35個循環(huán)：94℃變性 45 s，55～62℃復性 45 s，72℃延伸1.5 min；循環(huán)結束后72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR反應結束后，將PCR產物在2.0%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測。無DNA條帶記為0，有條帶記為1，形成ISSR的表型數(shù)據(jù)矩陣NTSYS軟件計算相似系數(shù)（DICE系數(shù)），并且按照遺傳系數(shù)進行UPGMA聚類分析。

選取J、3、6、9，4個樣品進行引物篩選，從56條隨機引物選出穩(wěn)定擴增并有多態(tài)性的10條引物（表1）進行分析試驗。所有引物由上海杰瑞生物科技有限公司合成。所有擴增產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳1 h，凝膠成像儀下拍照并觀察。

表1 ISSR分析試驗所用引物序列

1.3 MSAP分析

用識別四堿基的HpaII和MspI同裂酶分別與識別六堿基的核酸內切酶EcoR I組合對樣本DNA進行雙酶切，DNA酶切反應體系為20 μL。在酶切片段的兩端加上人工設計的與EcoR I和Hpa II/Msp I酶切位點互補的人工接頭（表2）。接頭連接體系為20 μL：2 μL 10×T4 Buffer、0.4 μL 20 μmol/L EcoR I和Hpa II/Msp I接頭，其余用水補齊，16℃過夜。

表2 MSAP分析試驗所用接頭和引物信息

預擴增與選擇擴增反應參考韓盼盼等[11]的方法，并做適當調整。3730XL測序儀對PCR產物進行毛細管電泳后利用GeneMarker 2.2軟件將10個樣品、14對引物組合擴增產物測序儀得到的原始數(shù)據(jù)進行分析，根據(jù)無帶和有帶情況轉化為0，1數(shù)據(jù)矩陣，然后進行甲基化分析。

2 結果與分析

2.1 茅蒼術ISSR分子標記遺傳多樣性分析

2.1.1 ISSR引物檢測的位點數(shù)和多態(tài)性 根據(jù)PCR擴增結果，以引物ISS6的擴增電泳圖為基礎，用Quantity one軟件繪制電泳模式圖（圖1）。10條引物在10個樣品中共擴增出了80條清晰條帶，其中多態(tài)位點47個，多態(tài)百分數(shù)為25%～87.50%，平均多態(tài)百分數(shù)為56.58%。各引物擴增的條帶在6～12條之間，平均每條引物擴增的條帶數(shù)為8條；從單個引物擴增得到的多態(tài)位點來看，引物0531-018擴增得到的多態(tài)位點最多，為12個，10條引物擴增得到的多態(tài)位點平均為4.7個。引物P10(873)和ISSR4的擴增圖譜如圖2所示，茅蒼術試管苗從繼代第四代開始，條帶在個別位點有減弱或增強的變化，并且隨著繼代次數(shù)的遞增，變化愈明顯。在引物P10(873)擴增圖譜中，第4、7、10代條帶在200 bp左右位點發(fā)生缺失，但總體呈逐漸減弱趨勢。

圖1 電泳模式圖（引物ISSR6部分）

圖2 引物P10(873)和ISSR4的擴增圖譜

利用Popgene.32軟件對10個樣品的10條引物分別進行遺傳多樣性分析，結果如表3所示。觀察等位基因數(shù)Na范圍為1.2500～1.8750之間，有效等位基因數(shù)Ne在1.2455～1.5437的范圍之內，Nei’s基因多樣性的范圍在0.1239～0.3177之間，Shannon信息指數(shù)I為0.1721～0.4718，多態(tài)百分數(shù)在25.00%～87.50%之間，其中ISSR35的多態(tài)百分數(shù)最高為87.50%，而ISSR4的多態(tài)性百分數(shù)最低為25.00%，由以上數(shù)據(jù)可得，10個樣本之間遺傳多樣性較低。

表3 10個樣本遺傳多樣性分析結果

2.1.2 基于ISSR標記的茅蒼術遺傳多樣性分析 根據(jù)“0”，“1”矩陣數(shù)據(jù)，利用Popgene32軟件分別計算10個樣本遺傳相似系數(shù)矩陣，結果如表4所示。遺傳相似系數(shù)為0.4750～0.9875，其中相似系數(shù)最大的為0.9875（樣品4號與5號），親緣關系最近，最小為0.4750（樣品6號與G號），親緣關系最遠。根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣，對10份供試材料的ISSR數(shù)據(jù)的結果進行聚類分析，得到樹狀聚類圖（圖3）。樣本間遺傳相似系數(shù)平均值為0.7392，在遺傳距離為0.74處，將10個樣本劃分為兩個大類，第一類包括樣本J、G、2號，即為繼代培養(yǎng)的1～3代，其余樣本均為第二類。綜合以上數(shù)據(jù)可知，在繼代培養(yǎng)的初期，樣本遺傳穩(wěn)定性較高，隨著繼代次數(shù)的增加，遺傳穩(wěn)定性有所下降。

圖3 10個樣品基于遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類分析

表4 基于ISSR標記的10個樣品的遺傳相似系數(shù)矩陣

2.2 茅蒼術基因組DNA甲基化的MSAP分析

2.2.1 基因組DNA甲基化水平分析 依據(jù)HpaⅡ和MspⅠ對甲基化不同的敏感程度，MSAP片段可分為4種類型[16-17]。本試驗選取14對引物組合(E34/MSP49，E34MSP60， E38MSP44， E38MSP50， E38MSP61，E41MSP40， E41MSP50， E44MSP41， E46MSP39，E50MSP39， E50MSP41， E50MSP59， E77MSP41，E77MSP50)對雙酶切后的10個樣本進行擴增。以繼代次數(shù)第1代和第10代茅蒼術試管苗（樣品J與樣品9）為例，如表5所示，樣品J的總甲基化率79.09%，全甲基化率為70.17%，半甲基化率為8.92%，而樣品9總甲基化率78.83%，全甲基化率為65.27%，半甲基化率為13.56%。經過長期繼代培養(yǎng)后，總甲基化率降低了0.26%，全甲基化率降低4.9%，但半甲基化率提高了4.64%，表明甲基化水平雖然有所下降，但仍處于較高水平。

表5 樣品J與樣品9基因組DNA甲基化水平分析

2.2.2 樣品J與樣品9基因組DNA甲基化模式分析 茅蒼術試管苗經過長期繼代培養(yǎng)后，存在3種甲基化模式（表6），其中，甲基化條帶數(shù)無變化所占比例為67.3%，去甲基化模式占18.87%，而甲基化模式比例為13.6%。與第1代試管苗（樣品J）相比，繼代培養(yǎng)第10代試管苗（樣品9）的去甲基化比例為18.87%，甲基化模式的比例為13.46%，即在繼代培養(yǎng)過程中共有32.7%的DNA基因組甲基化模式發(fā)生了改變。以上數(shù)據(jù)表明，在茅蒼術試管苗經過長期繼代培養(yǎng)過程后，去甲基化模式和甲基化模式并存，但以去甲基化模式為主，說明長期繼代培養(yǎng)后有較多的基因被重新活化和表達。

表6 樣品J與樣品9基因組DNA甲基化模式分析

3 討論和結論

植株離體培養(yǎng)材料在長期的繼代培養(yǎng)過程中，往往會發(fā)生遺傳變異和生理變化，劉福平研究發(fā)現(xiàn)，經組織培養(yǎng)產生的變異頻率高于自然突變和常規(guī)繁殖方法。在一個組培周期內可產生1%～3%的無性系變異[12]。而不同植株、初始繼代材料、培養(yǎng)條件等都會影響組培材料在繼代培養(yǎng)中的遺傳穩(wěn)定性[13]。已有研究顯示，火龍果繼代到第4代時發(fā)生變異[14]，而番木瓜卻能夠繼代培養(yǎng)32代無明顯變異[15]，由此可見不同組培材料的遺傳穩(wěn)定性具有明顯的個體差異。另外一些組培材料經長期繼代培養(yǎng)后表觀遺傳修飾發(fā)生變化，但核苷酸序列并未改變。因此，在研究遺傳穩(wěn)定性時結合甲基化現(xiàn)象，能夠更為全面的分析組培材料在繼代過程中產生的遺傳變異。

茅蒼術ISSR分子標記遺傳多樣性分析結果顯示，10個樣本間遺傳多樣性較低，遺傳相似系數(shù)最低的為第1代（樣品J）與第10代（樣品9），親緣關系較遠。同時通過聚類分析，可將10個樣本分為兩大類，第1～3代為第一大類，其余樣本為第二類。在整個繼代過程中，茅蒼術試管苗主要遺傳位點皆相同，但從繼代第4代開始，在個別位點處譜帶發(fā)生增強或減弱的現(xiàn)象；在引物P10(873)的擴增圖譜中，第4、7、10代條帶在200 bp左右發(fā)生位點缺失，從整體來看，隨著繼代次數(shù)的增加，變化愈明顯。以上數(shù)據(jù)表明茅蒼術試管苗在繼代培養(yǎng)過程中雖然整體遺傳穩(wěn)定性較高，但從第4代開始仍發(fā)生了少量變異，變異程度隨繼代次數(shù)增加而遞增，與火龍果的產生變異的繼代次數(shù)相同，不同物種繼代的遺傳穩(wěn)定性有異同。通過MSAP分析長期繼代培養(yǎng)對對茅蒼術試管苗甲基化水平和甲基化模式的影響，發(fā)現(xiàn)經過長期繼代培養(yǎng)后，試管苗總甲基化率降低了0.26%，全甲基化率降低4.9%，但半甲基化率提高了4.64%，表明甲基化水平雖然有所下降，但仍處于較高水平，這與Li等[16]研究結果一致。與第1代試管苗（樣品J）相比，繼代培養(yǎng)第10代試管苗（樣品9）的去甲基化比例為18.87%，甲基化模式的比例為13.46%。甲基化狀態(tài)通常與基因表達失活有關，反之亦然[17]。茅蒼術試管苗在繼代培養(yǎng)后去甲基化模式和甲基化模式并存，但以去甲基化模式為主，DNA甲基化水平發(fā)生了一定程度的變異。以上數(shù)據(jù)表明，在長期繼代培養(yǎng)后共有18.87%的基因被重新活化和表達，13.46%的基因被抑制表達。

茅蒼術試管苗繼代培養(yǎng)過程中所用培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂(pH 5.8～5.9)，繼代出現(xiàn)變異現(xiàn)象可能與培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基成分如激素、蔗糖含量等）以及培養(yǎng)時間的長短不同等因素有關，這些因素影響繼代試管苗的遺傳穩(wěn)定性和DNA甲基化水平及模式，去甲基化模式高于甲基化模式可能也是植物適應性反應的跡象，從而導致更多的基因得到表達，今后將通過調控這些因素，降低茅蒼術試管苗繼代變異方面進一步研究。

本研究以茅蒼術幼嫩頂芽為初始材料，建立茅蒼術高效離體快繁體系并進行長期繼代培養(yǎng)，運用ISSR、MSAP分子標記技術對不同繼代次數(shù)的試管苗進行分析，茅蒼術繼代10代遺傳穩(wěn)定性較高，從繼代第4代開始出現(xiàn)少量變異，第1代與第10代樣本之間遺傳相似系數(shù)最低，親緣關系較遠。繼代長期培養(yǎng)后茅蒼術試管苗的甲基化水平有所下降，去甲基化模式和甲基化模式并存，但以去甲基化模式為主。綜上所述，本研究結果可為茅蒼術種質資源保存和工廠化生產提供一定的理論依據(jù)。