李榮田,馬騰旭,王皓然,劉長華,3
(1黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱150080;2黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心,哈爾濱150500;3黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院,哈爾濱150080)
水稻是世界上最重要的糧食作物之一,世界上一半以上的人口以稻米為主食[1]。中國是世界上最大的水稻生產(chǎn)國,黑龍江省是中國最大的稻作區(qū)之一[2]。東北大米以其綠色優(yōu)質(zhì)深受消費(fèi)者青睞,特別是五?!净ㄏ?號(hào)’大米具有良食味、香味等特點(diǎn)成為世界級(jí)優(yōu)質(zhì)粳米[3]。不過,因?yàn)椤净ㄏ?號(hào)’水稻生育期長,只能在黑龍江省第1積溫區(qū)上限、平原、自流灌溉區(qū)域種植,再加上其易倒伏、豐產(chǎn)性差、出米率低等,使得五?!净ㄏ?號(hào)’大米數(shù)量少、價(jià)格高,不能滿足市場需求。同時(shí),地處黑龍江省第1積溫區(qū)下限的哈爾濱市廣大區(qū)域具有與五常類似的、生產(chǎn)頂級(jí)優(yōu)質(zhì)米的生態(tài)環(huán)境。缺少適應(yīng)優(yōu)質(zhì)米生產(chǎn)的品種,是把哈爾濱市建設(shè)成為“中國優(yōu)質(zhì)稻米之都”的限制因子之一[4]。因此,培育適于黑龍江省第1積溫區(qū)下限的、高產(chǎn)良食味品種,是十分必要的。抽穗期(Heading date,Hd)決定了水稻品種在不同區(qū)域的適應(yīng)能力和產(chǎn)量[5]。Hd2是決定水稻抽穗期主效基因之一,定位在第7號(hào)染色體上[6]。hd2是Hd2的突變基因,hd2位點(diǎn)其中的一個(gè)SNP是T2129C的變化,Hd2具有XcmI酶切位點(diǎn)(5’-CCANNNNNNNNNTGG-3’),hd2相應(yīng)的序列(5’-CTANNNNNNNNNTGG-3’)失去了該酶切位點(diǎn),據(jù)此開發(fā)了Hd2-Caps標(biāo)記[7]。Hd4是另一個(gè)控制水稻抽穗期主效QTL[8]。由Hd4突變?yōu)閔d4基因是在其CDS第157個(gè)堿基由G突變?yōu)門,Hd4具有XhoI酶切位點(diǎn)(5’-CTCGAG-3’),而hd4相應(yīng)的序列(5’-CTCTAG-3’)失去了此酶切位點(diǎn),依據(jù)該SNP開發(fā)了Hd4-Caps標(biāo)記[7]。黑龍江省水稻晚熟品種大多數(shù)具有Hd2和Hd4基因,早熟品種具有hd2及hd4基因[9]。水稻香味主要物質(zhì)是 2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2AP)[10]。香味主效基因Fgr/fgr位于第8號(hào)連鎖群上,有Fgr基因的水稻2-AP合成受到抑制,沒有香味,F(xiàn)gr基因突變?yōu)閒gr,促進(jìn)了2-AP的合成,水稻產(chǎn)生香味[11]。在香稻品種中,常見的是Fgr基因的第7外顯子有1個(gè)8 bp的缺失和3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn),依據(jù)這個(gè)特點(diǎn)設(shè)計(jì)了4條PCR引物的Fgr-SNP標(biāo)記[12,13]。水稻‘稻花香2號(hào)’具有Hd2Hd2Hd4Hd4基因型。水稻‘空育131’是黑龍江省第3積溫區(qū)品種,具有hd2hd2hd4hd4基因型。以‘稻花香2號(hào)’為受體,‘空育131’為hd2和hd4供體,利用全基因組選擇技術(shù),回交轉(zhuǎn)育創(chuàng)制了導(dǎo)入系‘稻花香2號(hào)(hd2hd4)’。水稻‘吉粳88’適于吉林省北部和黑龍江省南部地區(qū)種植,具有株型直立、抗倒伏、耐冷、豐產(chǎn)、出米率高、米質(zhì)較好等優(yōu)良農(nóng)藝性狀[14-15]。以‘稻花香2號(hào)’為藍(lán)本,保留其良食味、香味及粒型等基因及性狀,同時(shí)利用‘空育131’早熟抽穗期基因及‘吉粳88’的優(yōu)良農(nóng)藝性狀,對其株型、熟期、抗倒伏性、豐產(chǎn)性及碾磨品質(zhì)等性狀進(jìn)行遺傳改良,培育生育期較早、高產(chǎn)良食味品種,有利于五常式優(yōu)質(zhì)米生產(chǎn)區(qū)域擴(kuò)大。為此,配制了雜交組合‘吉粳88’ב稻花香2號(hào)(hd2hd4)’,利用分子標(biāo)記與田間性狀選擇相結(jié)合的方法培育適于黑龍江省第1積溫區(qū)下限的高產(chǎn)良食味水稻新品種。
1.1.1 水稻‘吉粳88’,‘稻花香2號(hào)(hd2hd4)’。
‘吉粳88’ב稻花香2號(hào)(hd2hd4)’的各個(gè)分離世代,以及經(jīng)過鑒定選擇形成的穩(wěn)定品系。
‘稻花香2號(hào)’,作對照?!晒诺尽?,稻瘟病全感品種。
1.1.2 分子標(biāo)記 用于鑒定基因位點(diǎn)Hd2(hd2)和Hd4(hd4)以及Fgr(fgr)的功能性分子標(biāo)記見表1。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。實(shí)驗(yàn)中所用的化學(xué)試劑和分子生物學(xué)試劑均購于生工生物工程(上海)股份有限公司。
表1 鑒定水稻Hd2(hd2)、Hd4(hd4)和Fgr(fgr)基因位點(diǎn)的功能性分子標(biāo)記
1.2.1 水稻基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物酶切 在秧苗期取水稻葉片,依據(jù)CTAB法[16]提取水稻基因組DNA,將提取后的DNA置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
Hd2-Caps和Hd4-Caps標(biāo)記PCR反應(yīng)體系20 μL:1.5 μL水稻DNA,0.5 μL正向引物(10 μmol/L),0.5 μL反向引物(10 μmol/L),5.15 μL Taq PCR Master Mix(0.1 U/μL Taq DNA Polymerase,2×PCR buffer,3 mmol/L MgCl2,0.4 mmol/L dNTP),12.35 μL ddH2O。
Hd2-Caps和Hd4-Caps標(biāo)記PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,59℃復(fù)性30 s,72℃延伸30 s,38循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存∞。
Hd2-Caps或Hd4-Caps標(biāo)記酶切:PCR產(chǎn)物體系加入 1.0 μL cutsmart緩沖液,0.2 μL XcmI或 XhoI酶(10 U/μL),形成酶切反應(yīng)體系。酶切反應(yīng)體系置于37℃酶切2 h左右。取出,電泳檢測。
Fgr-SNP 標(biāo) 記 PCR 反應(yīng) 體系 20 μL:2 μL 水 稻DNA ,0.5 μL P1(10 μmol/L),0.5 μL P2(10 μmol/L),0.5 μL P3(10 μmol/L),0.5 μL P4(10 μmol/L),6 μL Taq PCR Master Mix(0.1 U/μL Taq DNA Polymerase,2 ×PCR buffer,3 mmol/L MgCl2,0.4 mmol/L dNTP),10 μL ddH2O。
Fgr-SNP標(biāo)記PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,54℃復(fù)性30 s,72℃延伸30 s,30循環(huán);72℃延伸10min;4℃保存∞。
利用1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切的PCR產(chǎn)物及PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。
1.2.2 ‘黑大香1’的培育過程‘黑大香1’培育過程見圖1。所有田間試驗(yàn)在黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)水稻基地和海南省三亞市南濱國營農(nóng)場黑龍江大學(xué)水稻南繁基地進(jìn)行。
圖1 培育水稻‘黑大香1’的工作流程
1.2.3 ‘吉粳88’和‘稻花香2號(hào)(hd2hd4)’田間性狀比較‘吉粳88’和‘稻花香2號(hào)(hd2hd4)’插秧栽培,各項(xiàng)農(nóng)事操作同當(dāng)?shù)厣a(chǎn)田。試驗(yàn)設(shè)計(jì)為隨機(jī)區(qū)選法,3次重復(fù),小區(qū)為3行區(qū),行長4 m,行距30 cm,株距12 cm,小區(qū)面積4.6 m2,單本插秧。抽穗期調(diào)查莖葉株型指標(biāo)和葉瘟級(jí)別,株型指標(biāo)包括主莖劍葉與莖基角、張角和披垂角等3個(gè)性狀,葉瘟級(jí)別根據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評價(jià)技術(shù)規(guī)程》(NY/T2646-2014)進(jìn)行劃分。黃熟期田間調(diào)查倒伏指數(shù),調(diào)查方法同文獻(xiàn)[17]。室內(nèi)考種調(diào)查結(jié)實(shí)率、千粒重和稻谷長寬比。每小區(qū)調(diào)查5株,以5株平均數(shù)代表小區(qū)值,以小區(qū)平均數(shù)進(jìn)行方差分析及差異性比較。
1.2.4 水稻品系田間性狀鑒定 水稻品系和‘稻花香2號(hào)’插秧栽培,各項(xiàng)農(nóng)事操作同當(dāng)?shù)厣a(chǎn)田。試驗(yàn)設(shè)計(jì)為隨機(jī)取組法,3次重復(fù),小區(qū)為8行區(qū),行長5 m,行距30 cm,株距12 cm,每蔸插3棵苗,小區(qū)面積12.0 m2。生長發(fā)育期間,每個(gè)小區(qū)按對角線定點(diǎn)5蔸,每蔸選擇1個(gè)主莖標(biāo)記葉位,直至孕穗期止,根據(jù)葉位結(jié)果即知主莖葉片數(shù)。調(diào)查莖葉形態(tài)各指標(biāo)同1.2.3。收獲期每小區(qū)取5株進(jìn)行室內(nèi)考種,考種性狀包括株高、穗數(shù)、穗粒數(shù)、穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、粒長、粒寬、長寬比等。收獲期每小區(qū)按對角線選2點(diǎn)每點(diǎn)收割1 m2測產(chǎn),稻谷用于室內(nèi)分析精米率、香味和食味值。食味值根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《糧油檢驗(yàn)稻谷、大米蒸煮食用品質(zhì)感官評價(jià)方法》(GB/T 15682-2008)進(jìn)行評分。以小區(qū)平均數(shù)進(jìn)行方差分析,t測驗(yàn)檢驗(yàn)水稻品系與‘稻花香2號(hào)’的差異顯著性。
1.2.5 ‘黑大香1’的稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒性鑒定鑒定水稻‘黑大香1’的稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒性,對照‘稻花香2號(hào)’。鑒定方法及試驗(yàn)設(shè)計(jì)同參考文獻(xiàn)[18]和[19]。
2.1.1 分子鑒定選擇體系 圖2顯示分子標(biāo)記Hd2-Caps、Hd4-Caps和Fgr-SNP在‘吉粳88’ב稻花香2號(hào)(hd2hd4)’的雙親之間有明顯的多態(tài)性,母本和父本分別具有Hd2Hd2Hd4Hd4FgrFgr和hd2hd2hd4hd4fgrfgr基因型,可以用于檢測基因位點(diǎn)Hd2(hd2)、Hd4(hd4)和Fgr(fgr)。
圖2 抽穗期及香味基因分子標(biāo)記在‘吉粳88’和‘稻花香2號(hào)(hd2hd4)’間的多態(tài)性
2.1.2 田間觀察選擇體系‘吉粳88’和‘稻花香2號(hào)(hd2hd4)’田間農(nóng)藝性狀見表2。由表2可見,與‘吉粳88’比較,‘稻花香2號(hào)(hd2hd4)’株型披散、易倒伏、結(jié)實(shí)性差,稻谷子粒較大、較長,有香味。據(jù)此建立了田間農(nóng)藝性狀選擇體系:株型直立,抽穗期和黃熟期田間選擇莖葉夾角小的植株;抗倒伏,黃熟期以手觸摸莖基部節(jié)間,選擇莖基部節(jié)間耐壓力強(qiáng)的植株;耐冷性,黃熟期選擇分蘗穗空粒少的植株;粒型,黃熟期選擇稻谷大粒、長寬比高的植株。
表2 水稻‘吉粳88’和‘稻花香2號(hào)(hd2hd4)’田間農(nóng)藝性狀
2.2.1 F1世代植株鑒定選擇‘吉粳88’ב稻花香2號(hào)(hd2hd4)’的F1代。利用分子標(biāo)記Hd2-Caps對F1代植株進(jìn)行鑒定,結(jié)果見圖3。由圖3可知,在10個(gè)F1代植株中2、3、4、5、6、7、8、9號(hào)植株表現(xiàn)為雜合帶型,是真雜種;1、10號(hào)植株是偽雜種,予以剔除。收獲真雜種的種子形成F2代。
圖3 水稻‘吉粳88’ב稻花香2號(hào)(hd2hd4)’的F1代植株Hd2-Caps分子表型
2.2.2 自交世代植株鑒定選擇 F2世代。用F2世代種子育苗,選擇健壯的秧苗至少107株,分子檢測水稻秧苗。按照具有hd2、Hd4和fgr基因的原則選擇秧苗。入選秧苗移植到本田,田間按著莖葉直立、抗倒伏、結(jié)實(shí)好、大長粒及生長健壯的原則初選及決選植株,收獲決選的植株形成F3株系。具體見表3。
表3 水稻F2世代的分子標(biāo)記及田間性狀的鑒定選擇
F3世代。F3世代5個(gè)株系,每個(gè)株系秧苗期分子檢測17株。依據(jù)具有hd2、Hd4和fgr基因的原則選擇水稻秧苗,移植至本田。本田階段田間依據(jù)農(nóng)藝性狀優(yōu)良且Hd2(hd2)、Hd4(hd4)和Fgr(fgr)位點(diǎn)目標(biāo)基因盡量純合的原則,每個(gè)株系決選1株并收獲種子形成F4世代。具體見表4。
表4 水稻F3材料分子鑒定及田間選擇
F4世代。與F3世代工作類似,秧苗期分子鑒定與本田階段田間農(nóng)藝性狀選擇相結(jié)合,每個(gè)株系決選1株,收獲種子,形成F5世代。具體見表5。此外,由表5可知,F(xiàn)4世代決選株基因型為hd2hd2Hd4Hd4fgrfgr。
表5 水稻育種材料F4代分子鑒定及田間選擇
F5世代。F5世代秧苗期各株系隨機(jī)選5株提取DNA,株系內(nèi)各株DNA等量混合形成混合DNA。以混合DNA為模板分子檢測的基因型見圖4。圖4顯示F5世代5個(gè)株系均為hd2hd2Hd4Hd4fgrfgr的純系。F5世代每個(gè)株系本田插秧17株,形成株行。本田階段田間目測選擇結(jié)實(shí)好、莖葉直立、抗倒伏、大長粒的株系及其植株,每個(gè)株系選1株收獲種子,形成F6世代。
圖4 分子檢測水稻F5世代株系Hd2(hd2)、Hd4(hd4)和Fgr(fgr)基因型
F6及其以后世代。F6世代以株系為單位育苗移栽,各個(gè)株系不少于17株。本田階段進(jìn)行農(nóng)藝性狀選擇,各個(gè)株系決選1株,形成下一世代株系。F7及其以后世代重復(fù)F6世代工作,直至形成穩(wěn)定一致株系時(shí)為止。收獲株系,形成品系,即‘品系-1’、‘品系-2’、‘品系-3’、‘品系-4’和‘品系-5’。
水稻品系田間表現(xiàn)見表6。表6顯示,與‘稻花香2號(hào)’比較,各品系主莖葉片數(shù)變少,莖葉直立,株高變矮,穗數(shù)變多,穗粒數(shù)變少,結(jié)實(shí)率增加,精米率提高,豐產(chǎn)性變好。同時(shí)各品系具有大長粒粒型,香味,以及食味優(yōu)良等特征。其中,‘品系-4’綜合表現(xiàn)最好,選擇‘品系-4’并命名為‘黑大香1’。
表6 水稻品系及其對照的田間性狀
水稻‘黑大香1’的稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒伏性的鑒定結(jié)果見圖5。由圖5可知,‘黑大香1’與‘稻花香2號(hào)’稻瘟病葉瘟及穗頸瘟發(fā)病級(jí)別、耐冷性結(jié)實(shí)率均未見顯著性差異,倒伏指數(shù)極顯著地降低。說明‘黑大香1’與‘稻花香2號(hào)’比,抗稻瘟病性和耐冷性相似,抗倒伏性增強(qiáng)。
圖5 水稻‘黑大香1’的稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒伏性
水稻抽穗期及香味受Hd2(hd2)、Hd4(hd4)及Fgr(fgr)位點(diǎn)控制。周文甲等[20]以黑龍江省第2積溫區(qū)水稻品種‘綏粳14’為材料,利用CRISPR/Cas9技術(shù)對基因Hd2進(jìn)行基因編輯,使Hd2基因突變?yōu)閔d2,創(chuàng)造了早熟香味水稻‘綏粳14-d1’和‘綏粳14-d2’。薛為亞等[21]研究‘汕優(yōu)63’衍生的F2群體,發(fā)現(xiàn)了Hd4基因的自然變異是調(diào)控水稻抽穗期和產(chǎn)量潛力的重要因素。桑茂鵬等[22]分子標(biāo)記可以有效地從水稻育種群體中選擇fgr基因及其香味性狀。本研究結(jié)果證明晚熟水稻‘吉粳88’具有Hd2Hd2Hd4Hd4抽穗期基因型,早熟水稻‘稻花香2號(hào)(hd2hd4)’具有hd2hd2hd4hd4基因型,利用功能性分子標(biāo)記從‘吉粳88’ב稻花香2號(hào)(hd2hd4)’組合后代中選擇的具有hd2hd2Hd 4Hd4fgrfgr基因型水稻品系,植株體及稻米具有香味,主莖葉片數(shù)13片左右。
株型、粒型、抗倒伏等性狀是水稻重要的農(nóng)藝性狀,遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜。目前利用分子標(biāo)記進(jìn)行這些農(nóng)藝性狀的鑒定選擇尚有難度。張洪熙等[23]利用田間選擇方法在長江中下游稻區(qū)培育成功了秈型水稻理想株型材料。李揚(yáng)等[24]依據(jù)田間目測觀察結(jié)合分子標(biāo)記檢測,定向改良了株系‘SAGC-4’的粒長性狀。王笑見等[25]利用分子標(biāo)記結(jié)合田間農(nóng)藝性狀鑒定選擇,創(chuàng)建了一批抗倒伏、抗稻瘟病或褐飛虱的恢復(fù)系。本研究利用田間目測觀察莖葉姿態(tài)、子粒大小及形狀、成熟期莖稈基部耐壓能力等特征,選擇出了株型直立、大長粒、抗倒伏的水稻品系。
利用分子標(biāo)記與田間觀察相結(jié)合鑒定選擇育種材料,是創(chuàng)制水稻新種質(zhì)、培育水稻新品種的有效方法。裘燁等[26]利用分子標(biāo)記輔助選擇抗稻瘟病基因,同時(shí)田間進(jìn)行農(nóng)藝性狀的鑒定選擇,獲得了抗病、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻恢復(fù)系。閆影等[27]以優(yōu)質(zhì)米品種‘南粳46’為母本、早熟香粳品種‘廣陵香粳’為父本,通過雜交、回交并利用分子標(biāo)記選擇香味基因badh2-E7、軟米基因Wx-mq,田間選擇熟期,室內(nèi)選擇直鏈淀粉含量,培育成功了‘滬早香軟1號(hào)’品種。本研究在秧苗階段分子標(biāo)記選擇水稻抽穗期及香味基因,縮小了本田階段育種材料群體,為田間準(zhǔn)確地鑒定農(nóng)藝性狀提供了前提。分子標(biāo)記與田間觀察相結(jié)合培育的水稻‘黑大香1’具有香味、主莖葉片數(shù)13片、株型直立、大長粒、抗倒伏、適口性好及高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等特征。
Hd2(hd2)、Hd4(hd4)及Fgr(fgr)位點(diǎn)是決定黑龍江省水稻抽穗期及香味的主效基因,Hd2-Caps、Hd4-Caps及Fgr-SNP標(biāo)記可以有效地鑒定選擇Hd2(hd2)、Hd4(hd4)及Fgr(fgr)基因。田間目測觀察水稻莖葉姿態(tài)、稻谷大小及形狀、以及以手觸摸莖稈基部判斷耐壓能力強(qiáng)弱等,選擇株型、粒型、抗倒伏等農(nóng)藝性狀是可行及有效的。在水稻秧苗階段,利用功能性分子標(biāo)記選擇目標(biāo)基因及性狀,縮小了本田階段育種材料規(guī)模,保證了田間觀察農(nóng)藝性狀的準(zhǔn)確性。利用分子標(biāo)記和田間農(nóng)藝性狀選擇相結(jié)合的方法,培育出了‘黑大香1’水稻品系具有hd2hd2Hd4Hd4fgrfgr基因型及中熟、有香味、莖葉直立、抗倒伏、豐產(chǎn)、出米率高、大長粒、適口性好等特征,可以用于黑龍江省第1積溫區(qū)下限良食味稻米生產(chǎn)。