李榮田，馬騰旭，王皓然，劉長華,3

（1黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點實驗室，哈爾濱150080；2黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱150500；3黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150080）

0 引言

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，世界上一半以上的人口以稻米為主食[1]。中國是世界上最大的水稻生產(chǎn)國，黑龍江省是中國最大的稻作區(qū)之一[2]。東北大米以其綠色優(yōu)質(zhì)深受消費者青睞，特別是五?！净ㄏ?號’大米具有良食味、香味等特點成為世界級優(yōu)質(zhì)粳米[3]。不過，因為‘稻花香2號’水稻生育期長，只能在黑龍江省第1積溫區(qū)上限、平原、自流灌溉區(qū)域種植，再加上其易倒伏、豐產(chǎn)性差、出米率低等，使得五?！净ㄏ?號’大米數(shù)量少、價格高，不能滿足市場需求。同時，地處黑龍江省第1積溫區(qū)下限的哈爾濱市廣大區(qū)域具有與五常類似的、生產(chǎn)頂級優(yōu)質(zhì)米的生態(tài)環(huán)境。缺少適應(yīng)優(yōu)質(zhì)米生產(chǎn)的品種，是把哈爾濱市建設(shè)成為“中國優(yōu)質(zhì)稻米之都”的限制因子之一[4]。因此，培育適于黑龍江省第1積溫區(qū)下限的、高產(chǎn)良食味品種，是十分必要的。抽穗期(Heading date，Hd)決定了水稻品種在不同區(qū)域的適應(yīng)能力和產(chǎn)量[5]。Hd2是決定水稻抽穗期主效基因之一，定位在第7號染色體上[6]。hd2是Hd2的突變基因，hd2位點其中的一個SNP是T2129C的變化，Hd2具有XcmI酶切位點(5’-CCANNNNNNNNNTGG-3’)，hd2相應(yīng)的序列(5’-CTANNNNNNNNNTGG-3’)失去了該酶切位點，據(jù)此開發(fā)了Hd2-Caps標(biāo)記[7]。Hd4是另一個控制水稻抽穗期主效QTL[8]。由Hd4突變?yōu)閔d4基因是在其CDS第157個堿基由G突變?yōu)門，Hd4具有XhoI酶切位點（5’-CTCGAG-3’），而hd4相應(yīng)的序列(5’-CTCTAG-3’)失去了此酶切位點，依據(jù)該SNP開發(fā)了Hd4-Caps標(biāo)記[7]。黑龍江省水稻晚熟品種大多數(shù)具有Hd2和Hd4基因，早熟品種具有hd2及hd4基因[9]。水稻香味主要物質(zhì)是 2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2AP)[10]。香味主效基因Fgr/fgr位于第8號連鎖群上，有Fgr基因的水稻2-AP合成受到抑制，沒有香味，F(xiàn)gr基因突變?yōu)閒gr，促進(jìn)了2-AP的合成，水稻產(chǎn)生香味[11]。在香稻品種中，常見的是Fgr基因的第7外顯子有1個8 bp的缺失和3個單核苷酸多態(tài)性位點，依據(jù)這個特點設(shè)計了4條PCR引物的Fgr-SNP標(biāo)記[12,13]。水稻‘稻花香2號’具有Hd2Hd2Hd4Hd4基因型。水稻‘空育131’是黑龍江省第3積溫區(qū)品種，具有hd2hd2hd4hd4基因型。以‘稻花香2號’為受體，‘空育131’為hd2和hd4供體，利用全基因組選擇技術(shù)，回交轉(zhuǎn)育創(chuàng)制了導(dǎo)入系‘稻花香2號(hd2hd4)’。水稻‘吉粳88’適于吉林省北部和黑龍江省南部地區(qū)種植，具有株型直立、抗倒伏、耐冷、豐產(chǎn)、出米率高、米質(zhì)較好等優(yōu)良農(nóng)藝性狀[14-15]。以‘稻花香2號’為藍(lán)本，保留其良食味、香味及粒型等基因及性狀，同時利用‘空育131’早熟抽穗期基因及‘吉粳88’的優(yōu)良農(nóng)藝性狀，對其株型、熟期、抗倒伏性、豐產(chǎn)性及碾磨品質(zhì)等性狀進(jìn)行遺傳改良，培育生育期較早、高產(chǎn)良食味品種，有利于五常式優(yōu)質(zhì)米生產(chǎn)區(qū)域擴(kuò)大。為此，配制了雜交組合‘吉粳88’ב稻花香2號(hd2hd4)’，利用分子標(biāo)記與田間性狀選擇相結(jié)合的方法培育適于黑龍江省第1積溫區(qū)下限的高產(chǎn)良食味水稻新品種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水稻‘吉粳88’，‘稻花香2號(hd2hd4)’。

‘吉粳88’ב稻花香2號(hd2hd4)’的各個分離世代，以及經(jīng)過鑒定選擇形成的穩(wěn)定品系。

‘稻花香2號’，作對照?！晒诺尽疚敛∪衅贩N。

1.1.2 分子標(biāo)記 用于鑒定基因位點Hd2(hd2)和Hd4(hd4)以及Fgr(fgr)的功能性分子標(biāo)記見表1。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。實驗中所用的化學(xué)試劑和分子生物學(xué)試劑均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

表1 鑒定水稻Hd2(hd2)、Hd4(hd4)和Fgr(fgr)基因位點的功能性分子標(biāo)記

1.2 方法

1.2.1 水稻基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物酶切 在秧苗期取水稻葉片，依據(jù)CTAB法[16]提取水稻基因組DNA，將提取后的DNA置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

Hd2-Caps和Hd4-Caps標(biāo)記PCR反應(yīng)體系20 μL：1.5 μL水稻DNA，0.5 μL正向引物(10 μmol/L)，0.5 μL反向引物(10 μmol/L)，5.15 μL Taq PCR Master Mix(0.1 U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR buffer，3 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTP)，12.35 μL ddH2O。

Hd2-Caps和Hd4-Caps標(biāo)記PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，59℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，38循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存∞。

Hd2-Caps或Hd4-Caps標(biāo)記酶切：PCR產(chǎn)物體系加入 1.0 μL cutsmart緩沖液，0.2 μL XcmI或 XhoI酶(10 U/μL)，形成酶切反應(yīng)體系。酶切反應(yīng)體系置于37℃酶切2 h左右。取出，電泳檢測。

Fgr-SNP 標(biāo) 記 PCR 反應(yīng) 體系 20 μL：2 μL 水 稻DNA ，0.5 μL P1(10 μmol/L)，0.5 μL P2(10 μmol/L)，0.5 μL P3(10 μmol/L)，0.5 μL P4(10 μmol/L)，6 μL Taq PCR Master Mix(0.1 U/μL Taq DNA Polymerase，2 ×PCR buffer，3 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTP)，10 μL ddH2O。

Fgr-SNP標(biāo)記PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，30循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存∞。

利用1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切的PCR產(chǎn)物及PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

1.2.2 ‘黑大香1’的培育過程‘黑大香1’培育過程見圖1。所有田間試驗在黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)水稻基地和海南省三亞市南濱國營農(nóng)場黑龍江大學(xué)水稻南繁基地進(jìn)行。

圖1 培育水稻‘黑大香1’的工作流程

1.2.3 ‘吉粳88’和‘稻花香2號(hd2hd4)’田間性狀比較‘吉粳88’和‘稻花香2號(hd2hd4)’插秧栽培，各項農(nóng)事操作同當(dāng)?shù)厣a(chǎn)田。試驗設(shè)計為隨機(jī)區(qū)選法，3次重復(fù)，小區(qū)為3行區(qū)，行長4 m，行距30 cm，株距12 cm，小區(qū)面積4.6 m2，單本插秧。抽穗期調(diào)查莖葉株型指標(biāo)和葉瘟級別，株型指標(biāo)包括主莖劍葉與莖基角、張角和披垂角等3個性狀，葉瘟級別根據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻品種試驗稻瘟病抗性鑒定與評價技術(shù)規(guī)程》(NY/T2646-2014)進(jìn)行劃分。黃熟期田間調(diào)查倒伏指數(shù)，調(diào)查方法同文獻(xiàn)[17]。室內(nèi)考種調(diào)查結(jié)實率、千粒重和稻谷長寬比。每小區(qū)調(diào)查5株，以5株平均數(shù)代表小區(qū)值，以小區(qū)平均數(shù)進(jìn)行方差分析及差異性比較。

1.2.4 水稻品系田間性狀鑒定 水稻品系和‘稻花香2號’插秧栽培，各項農(nóng)事操作同當(dāng)?shù)厣a(chǎn)田。試驗設(shè)計為隨機(jī)取組法，3次重復(fù)，小區(qū)為8行區(qū)，行長5 m，行距30 cm，株距12 cm，每蔸插3棵苗，小區(qū)面積12.0 m2。生長發(fā)育期間，每個小區(qū)按對角線定點5蔸，每蔸選擇1個主莖標(biāo)記葉位，直至孕穗期止，根據(jù)葉位結(jié)果即知主莖葉片數(shù)。調(diào)查莖葉形態(tài)各指標(biāo)同1.2.3。收獲期每小區(qū)取5株進(jìn)行室內(nèi)考種，考種性狀包括株高、穗數(shù)、穗粒數(shù)、穗實粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重、粒長、粒寬、長寬比等。收獲期每小區(qū)按對角線選2點每點收割1 m2測產(chǎn)，稻谷用于室內(nèi)分析精米率、香味和食味值。食味值根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《糧油檢驗稻谷、大米蒸煮食用品質(zhì)感官評價方法》(GB/T 15682-2008)進(jìn)行評分。以小區(qū)平均數(shù)進(jìn)行方差分析，t測驗檢驗水稻品系與‘稻花香2號’的差異顯著性。

1.2.5 ‘黑大香1’的稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒性鑒定鑒定水稻‘黑大香1’的稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒性，對照‘稻花香2號’。鑒定方法及試驗設(shè)計同參考文獻(xiàn)[18]和[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 培育水稻‘黑大香1’的選擇體系

2.1.1 分子鑒定選擇體系 圖2顯示分子標(biāo)記Hd2-Caps、Hd4-Caps和Fgr-SNP在‘吉粳88’ב稻花香2號(hd2hd4)’的雙親之間有明顯的多態(tài)性，母本和父本分別具有Hd2Hd2Hd4Hd4FgrFgr和hd2hd2hd4hd4fgrfgr基因型，可以用于檢測基因位點Hd2(hd2)、Hd4(hd4)和Fgr(fgr)。

圖2 抽穗期及香味基因分子標(biāo)記在‘吉粳88’和‘稻花香2號(hd2hd4)’間的多態(tài)性

2.1.2 田間觀察選擇體系‘吉粳88’和‘稻花香2號(hd2hd4)’田間農(nóng)藝性狀見表2。由表2可見，與‘吉粳88’比較，‘稻花香2號(hd2hd4)’株型披散、易倒伏、結(jié)實性差，稻谷子粒較大、較長，有香味。據(jù)此建立了田間農(nóng)藝性狀選擇體系：株型直立，抽穗期和黃熟期田間選擇莖葉夾角小的植株；抗倒伏，黃熟期以手觸摸莖基部節(jié)間，選擇莖基部節(jié)間耐壓力強的植株；耐冷性，黃熟期選擇分蘗穗空粒少的植株；粒型，黃熟期選擇稻谷大粒、長寬比高的植株。

表2 水稻‘吉粳88’和‘稻花香2號(hd2hd4)’田間農(nóng)藝性狀

2.2 水稻‘黑大香1’的培育

2.2.1 F1世代植株鑒定選擇‘吉粳88’ב稻花香2號(hd2hd4)’的F1代。利用分子標(biāo)記Hd2-Caps對F1代植株進(jìn)行鑒定，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在10個F1代植株中2、3、4、5、6、7、8、9號植株表現(xiàn)為雜合帶型，是真雜種；1、10號植株是偽雜種，予以剔除。收獲真雜種的種子形成F2代。

圖3 水稻‘吉粳88’ב稻花香2號(hd2hd4)’的F1代植株Hd2-Caps分子表型

2.2.2 自交世代植株鑒定選擇 F2世代。用F2世代種子育苗，選擇健壯的秧苗至少107株，分子檢測水稻秧苗。按照具有hd2、Hd4和fgr基因的原則選擇秧苗。入選秧苗移植到本田，田間按著莖葉直立、抗倒伏、結(jié)實好、大長粒及生長健壯的原則初選及決選植株，收獲決選的植株形成F3株系。具體見表3。

表3 水稻F2世代的分子標(biāo)記及田間性狀的鑒定選擇

F3世代。F3世代5個株系，每個株系秧苗期分子檢測17株。依據(jù)具有hd2、Hd4和fgr基因的原則選擇水稻秧苗，移植至本田。本田階段田間依據(jù)農(nóng)藝性狀優(yōu)良且Hd2(hd2)、Hd4(hd4)和Fgr(fgr)位點目標(biāo)基因盡量純合的原則，每個株系決選1株并收獲種子形成F4世代。具體見表4。

表4 水稻F3材料分子鑒定及田間選擇

F4世代。與F3世代工作類似，秧苗期分子鑒定與本田階段田間農(nóng)藝性狀選擇相結(jié)合，每個株系決選1株，收獲種子，形成F5世代。具體見表5。此外，由表5可知，F(xiàn)4世代決選株基因型為hd2hd2Hd4Hd4fgrfgr。

表5 水稻育種材料F4代分子鑒定及田間選擇

F5世代。F5世代秧苗期各株系隨機(jī)選5株提取DNA，株系內(nèi)各株DNA等量混合形成混合DNA。以混合DNA為模板分子檢測的基因型見圖4。圖4顯示F5世代5個株系均為hd2hd2Hd4Hd4fgrfgr的純系。F5世代每個株系本田插秧17株，形成株行。本田階段田間目測選擇結(jié)實好、莖葉直立、抗倒伏、大長粒的株系及其植株，每個株系選1株收獲種子，形成F6世代。

圖4 分子檢測水稻F5世代株系Hd2(hd2)、Hd4(hd4)和Fgr(fgr)基因型

F6及其以后世代。F6世代以株系為單位育苗移栽，各個株系不少于17株。本田階段進(jìn)行農(nóng)藝性狀選擇，各個株系決選1株，形成下一世代株系。F7及其以后世代重復(fù)F6世代工作，直至形成穩(wěn)定一致株系時為止。收獲株系，形成品系，即‘品系-1’、‘品系-2’、‘品系-3’、‘品系-4’和‘品系-5’。

2.3 水稻品系田間表現(xiàn)

水稻品系田間表現(xiàn)見表6。表6顯示，與‘稻花香2號’比較，各品系主莖葉片數(shù)變少，莖葉直立，株高變矮，穗數(shù)變多，穗粒數(shù)變少，結(jié)實率增加，精米率提高，豐產(chǎn)性變好。同時各品系具有大長粒粒型，香味，以及食味優(yōu)良等特征。其中，‘品系-4’綜合表現(xiàn)最好，選擇‘品系-4’并命名為‘黑大香1’。

表6 水稻品系及其對照的田間性狀

2.4 ‘黑大香1’的稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒性

水稻‘黑大香1’的稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒伏性的鑒定結(jié)果見圖5。由圖5可知，‘黑大香1’與‘稻花香2號’稻瘟病葉瘟及穗頸瘟發(fā)病級別、耐冷性結(jié)實率均未見顯著性差異，倒伏指數(shù)極顯著地降低。說明‘黑大香1’與‘稻花香2號’比，抗稻瘟病性和耐冷性相似，抗倒伏性增強。

圖5 水稻‘黑大香1’的稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒伏性

3 討論與結(jié)論

水稻抽穗期及香味受Hd2(hd2)、Hd4(hd4)及Fgr(fgr)位點控制。周文甲等[20]以黑龍江省第2積溫區(qū)水稻品種‘綏粳14’為材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對基因Hd2進(jìn)行基因編輯，使Hd2基因突變?yōu)閔d2，創(chuàng)造了早熟香味水稻‘綏粳14-d1’和‘綏粳14-d2’。薛為亞等[21]研究‘汕優(yōu)63’衍生的F2群體，發(fā)現(xiàn)了Hd4基因的自然變異是調(diào)控水稻抽穗期和產(chǎn)量潛力的重要因素。桑茂鵬等[22]分子標(biāo)記可以有效地從水稻育種群體中選擇fgr基因及其香味性狀。本研究結(jié)果證明晚熟水稻‘吉粳88’具有Hd2Hd2Hd4Hd4抽穗期基因型，早熟水稻‘稻花香2號(hd2hd4)’具有hd2hd2hd4hd4基因型，利用功能性分子標(biāo)記從‘吉粳88’ב稻花香2號(hd2hd4)’組合后代中選擇的具有hd2hd2Hd 4Hd4fgrfgr基因型水稻品系，植株體及稻米具有香味，主莖葉片數(shù)13片左右。

株型、粒型、抗倒伏等性狀是水稻重要的農(nóng)藝性狀，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜。目前利用分子標(biāo)記進(jìn)行這些農(nóng)藝性狀的鑒定選擇尚有難度。張洪熙等[23]利用田間選擇方法在長江中下游稻區(qū)培育成功了秈型水稻理想株型材料。李揚等[24]依據(jù)田間目測觀察結(jié)合分子標(biāo)記檢測，定向改良了株系‘SAGC-4’的粒長性狀。王笑見等[25]利用分子標(biāo)記結(jié)合田間農(nóng)藝性狀鑒定選擇，創(chuàng)建了一批抗倒伏、抗稻瘟病或褐飛虱的恢復(fù)系。本研究利用田間目測觀察莖葉姿態(tài)、子粒大小及形狀、成熟期莖稈基部耐壓能力等特征，選擇出了株型直立、大長粒、抗倒伏的水稻品系。

利用分子標(biāo)記與田間觀察相結(jié)合鑒定選擇育種材料，是創(chuàng)制水稻新種質(zhì)、培育水稻新品種的有效方法。裘燁等[26]利用分子標(biāo)記輔助選擇抗稻瘟病基因，同時田間進(jìn)行農(nóng)藝性狀的鑒定選擇，獲得了抗病、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻恢復(fù)系。閆影等[27]以優(yōu)質(zhì)米品種‘南粳46’為母本、早熟香粳品種‘廣陵香粳’為父本，通過雜交、回交并利用分子標(biāo)記選擇香味基因badh2-E7、軟米基因Wx-mq，田間選擇熟期，室內(nèi)選擇直鏈淀粉含量，培育成功了‘滬早香軟1號’品種。本研究在秧苗階段分子標(biāo)記選擇水稻抽穗期及香味基因，縮小了本田階段育種材料群體，為田間準(zhǔn)確地鑒定農(nóng)藝性狀提供了前提。分子標(biāo)記與田間觀察相結(jié)合培育的水稻‘黑大香1’具有香味、主莖葉片數(shù)13片、株型直立、大長粒、抗倒伏、適口性好及高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等特征。

Hd2(hd2)、Hd4(hd4)及Fgr(fgr)位點是決定黑龍江省水稻抽穗期及香味的主效基因，Hd2-Caps、Hd4-Caps及Fgr-SNP標(biāo)記可以有效地鑒定選擇Hd2(hd2)、Hd4(hd4)及Fgr(fgr)基因。田間目測觀察水稻莖葉姿態(tài)、稻谷大小及形狀、以及以手觸摸莖稈基部判斷耐壓能力強弱等，選擇株型、粒型、抗倒伏等農(nóng)藝性狀是可行及有效的。在水稻秧苗階段，利用功能性分子標(biāo)記選擇目標(biāo)基因及性狀，縮小了本田階段育種材料規(guī)模，保證了田間觀察農(nóng)藝性狀的準(zhǔn)確性。利用分子標(biāo)記和田間農(nóng)藝性狀選擇相結(jié)合的方法，培育出了‘黑大香1’水稻品系具有hd2hd2Hd4Hd4fgrfgr基因型及中熟、有香味、莖葉直立、抗倒伏、豐產(chǎn)、出米率高、大長粒、適口性好等特征，可以用于黑龍江省第1積溫區(qū)下限良食味稻米生產(chǎn)。