王 成，孔亞林，劉承利，蒲 猛，趙 剛，張洪義

Yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）是Hippo通路下游的一種轉錄激活子[1]，它所在的Hippo通路主要行使調(diào)控細胞增殖功能。YAP蛋白與人和小鼠的肝癌進展密切相關[2-3]。YAP基因在其他實體癌中[4-6]也被視為一種癌基因。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是肝細胞增殖的負性調(diào)節(jié)因子，在肝再生晚期表達增強[7]。肝癌患者外周血中TGF-β1 mRNA明顯升高[8]。TGF-β1可通過激活Hippo通路來抑制YAP功能，從而抑制肝癌細胞增殖[9]，2種因子在調(diào)控肝癌細胞增殖方面關系密切。目前針對YAP的靶向抑制是控制肝癌增殖的熱點，但靶向治療是否會帶來相關因子的變化和新的問題需要更多的關注。本研究擬應用RNA干擾技術下調(diào)MHCC97H細胞中YAP mRNA水平，測試干擾后該細胞中TGF-β1 mRNA的變化，將有利于針對YAP基因的靶向治療的研究。另外，前期研究發(fā)現(xiàn)，MHCC97H細胞的YAP mRNA高于與其同源的另一肝癌細胞MHCC97L[10]。本研究擬測試YAP mRNA水平較低的MHCC97L細胞中TGF-β1 mRNA水平，并與MHCC97H細胞內(nèi)TGF-β1 mRNA水平相比較，進一步在自然存在的肝癌細胞中尋找二者相關性的有力證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系 人肝癌細胞系MHCC97（包括97H和97L）購自上海細胞庫，是裸鼠人肝癌轉移模型在體外建立的（97H肺轉移率為100%，97L肺轉移率較低，為40%）。

1.1.2 RNA干擾序列 用于行YA P基因干擾的序列選自短發(fā)夾R N A克隆庫。有效抑制靶點序列：YAP1 NM_001130145 Human,5'-CATTGCTGCTGTTAATGTA-3'。

1.1.3 PCR引物 所有引物為人源，由上海生工公司設計合成，經(jīng)Primer BLAST（NCBI）驗證特異性好。Y A P引物：正向鏈序列：5'-ACCCACAGCTCAGCATCTTCG-3'，反向鏈序列5'-TGGCTTGTTCCCATCCATCAG-3'，引物長度257 b p；TGF-β1引物：正向鏈序列5'-TTCCTGGCGATACCTCAGCAACC-3'，反向鏈5'-CGCTAAGGCGAAAGCCCTCAAT-3'，引物長度131 bp；內(nèi)參GAPDH引物：正向鏈序列5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，反向鏈序列5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'，引物長258 bp。

1.1.4 主要試劑、儀器 培養(yǎng)液：高糖DMEM（Hyclone）＋10%胎牛血清（Gibco），培養(yǎng)液加青、鏈霉素各100單位/ml。細胞裂解試劑：Trizol?Reagent（大連寶生物科技有限公司，中國）。逆轉錄試劑盒：PrimeScript?RT reagent Kit Perfect Real-Time DRR03S（大連寶生物科技有限公司，中國）。熒光定量PCR試劑盒：SYBR PremixEx Taq（Perfect Real-Time）DRR041S（大連寶生物科技有限公司，中國）。實驗儀器：實時熒光定量PCR 儀（羅氏，瑞士）。

1.2 實驗方法

1.2.1 RNA干擾及PCR實驗

1.2.1.1 慢病毒載體構建 慢病毒載體（pMagic 4.1）構建依托上海賽博醫(yī)療生物科技有限公司完成，編號：SB1262-C。慢病毒的包裝、濃縮和滴度測定結果滿意。

1.2.1.2 細胞培養(yǎng)、轉染細胞 復蘇凍存的97H細胞，懸浮于含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)、傳代2次。將細胞分為干擾組和對照組，每組各3份細胞。轉染：慢病毒溶于含聚凝胺（8 mg/ml，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，中國）培養(yǎng)基中。干擾組將含質(zhì)粒的慢病毒轉染97H細胞；對照組加入空載體，轉染時間為72 h，之后同時提取總RNA。

1.2.1.3 RNA提取 取干擾組及對照組的97H細胞加入Trizol試劑裂解細胞，應用氯仿、異丙醇、乙醇純化RNA。紫外吸收檢測RNA的濃度和純度。

1.2.1.4 反轉錄合成cDNA 反應體系配置按試劑盒（PrimeScript? RT reagent Kit Perfect Real-Time：DRR03S）操作。條件：37 ℃ 15 min（反轉錄）→85 ℃5 s（失活）所得產(chǎn)物用于下一步PCR擴增。

1.2.1.5 熒光定量PCR 反應體系按試劑盒（SYBR Premix Ex Taq Perfect Real-Time：DRR041S）配置。條件：95 ℃ 10 s→95 ℃ 5 s→60 ℃ 20 s×35 Cycles。應用LightCycler軟件分析得出各個樣品YAP mRNA、TGF-β1mRNA及內(nèi)參的Ct值結果，共得到6組數(shù)據(jù)。

1.2.2 97H細胞與97L細胞中2種因子的mRNA水平比較（PCR實驗） 復蘇凍存的97H和97L細胞，每種細胞各3份，至對數(shù)生長期后同時行RNA提取、反轉錄合成cDNA、熒光定量PCR，方法、試劑、條件同前面實驗，測試2種細胞中YAP mRNA、TGF-β1mRNA及內(nèi)參的量。應用LightCycler軟件分析得出各個樣品Ct值結果，共得到6組數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用2--△△Ct法[11]，比較RNA干擾前后97H細胞中2種因子的mRNA量的變化。應用直接比較Ct值的方法，比較2種細胞中2種因子的mRNA量的差別。干擾因素少按內(nèi)參GAPDH的Ct值行數(shù)據(jù)加權，應用Excel 2003對PCR結果行配對比較，并制作圖表，Ct值越低，mRNA水平越高，1個Ct值約相當于2倍核酸拷貝數(shù)之差。

2 結果

2.1 MHCC97H細胞YAP mRNA和TGF-β1 mRNA變化 對YAP基因行RNA干擾后97H細胞內(nèi)的YAP mRNA總量較對照組減少，伴隨TGF-β1 mRNA量升高。干擾組和對照組細胞分別受干擾試劑及對照試劑作用72 h后，細胞內(nèi)的YAP mRNA和TGF-β1 mRNA同時發(fā)生變化，干擾組YAP mRNA拷貝數(shù)降低到對照組的48.3%（表1），同時TGF-β1 mRNA拷貝數(shù)升高到對照組的1.2倍（表2），變化明顯。

表1 MHCC97H細胞干擾組和對照組的YAP mRNA變化

表2 MHCC97H細胞干擾組和對照組的TGF-β1 mRNA變化

2.2 97H與97L細胞中TGF-β1 mRNA和YAP mRNA水平 YAP mRNA水平較低的97L細胞中TGF-β1 mRNA水平較高。在內(nèi)參GAPDH 的Ct相等的情況下，在同一種細胞97H細胞中YAP mRNA水平高于TGF-β1 mRNA，二者相差0.39個Ct值。在同一種細胞97L中YAP mRNA水平低于TGF-β1 mRNA，二者相差0.52個Ct值（圖1）。按內(nèi)參GAPDH的Ct值行數(shù)據(jù)加權后，比較2種細胞后發(fā)現(xiàn)：97L細胞的YAP mRNA水平低于97H。同時，97L細胞的TGF-β1mRNA水平高于97H（圖1）。可見，自然存在的人肝癌97系列細胞中如YAP mRNA水平較低的細胞TGF-β1 mRNA水平較高。

圖1 2種細胞（97H、97L）中的2種因子mRNA的PCR反應結果

3 討論

肝細胞癌中的YAP蛋白被認為是影響病人無瘤生存期和總生存期的獨立危險因素[12]。針對YAP基因的靶向治療可能成為肝癌治療的重要方法。在前期研究中發(fā)現(xiàn)在人肝癌細胞MHCC97H中針對YAP基因的RNA干擾作用能夠抑制YAP蛋白表達，并抑制癌細胞增殖[10]，本研究所用干擾序列及方法與前期研究[10]相同。針對某一種靶基因的治療是否會影響其他相關基因和蛋白的表達是靶向治療需要特別關注的問題。作為主要功能為抑制肝細胞增殖并在肝癌組織中呈高表達的TGF-β1是針對YAP的靶向治療需首先關注的基因，它與YAP基因的關系及在靶向治療中的變化會影響靶向治療的效果。

在人的正常肝臟中TGF-β1 mRNA和蛋白一般無明顯表達[13]，只有在肝發(fā)生纖維化或硬化時，間質(zhì)細胞可表達TGF-β1 mRNA。然而已有研究證明肝細胞癌的細胞內(nèi)有相對較高的TGF-β1表達[14]。

本研究中，當人肝癌細胞MHCC97H的YAP mRNA受RNA干擾作用而下調(diào)后，TGF-β1 mRNA水平出現(xiàn)同步升高。當干擾組YAP mRNA拷貝數(shù)降低到對照組的48.3%，TGF-β1 mRNA拷貝數(shù)升高到對照組的1.2倍。這提示YAP基因和或蛋白變化會影響內(nèi)源性TGF-β1 mRNA水平，目前尚不知這種變化是否有利于實現(xiàn)抑制肝癌細胞增殖的最初目的。

另外，前期研究[10]證明97L細胞的YAP mRNA水平低于97H，并且其增殖力也低于97H，這是一種天然的水平比較，測試該細胞的TGF-β1 mRNA的水平可以回答天然存在的YAP mRNA水平下降是否伴隨TGF-β1 mRNA升高。因97H和97L是人肝癌細胞MHCC97的2種不同亞型細胞，從共同的細胞起源分離而來，具有同源性，不易受外因影響，兩者的比較更加科學。并且在同一細胞中行2種核酸的相對定量比較可減少誤差，較為科學，結果可信度大。

實驗中發(fā)現(xiàn)，97L細胞中YAP mRNA水平低于97H，而97L的TGF-β1 mRNA的確高于97H。不僅如此，還發(fā)現(xiàn)YAP mRNA和TGF-β1 mRNA在2種細胞中出現(xiàn)“此消彼長”的現(xiàn)象，即在97H細胞中YAP mRNA水平高于TGF-β1 mRNA；在97L細胞中YAP mRNA水平低于TGF-β1 mRNA。

假設從97H細胞到97L細胞存在一個細胞演變過程，此過程中YAP mRNA水平下降，同時伴隨TGF-β1 mRNA水平升高，這種態(tài)勢與前述的YAP mRNA受干擾后的二者的變化結果非常相似。綜合基因干擾實驗及自然存在的2種亞型肝癌細胞的對比研究后，可以認為：在肝癌細胞中YAP的下調(diào)對內(nèi)源性TGF-β1 mRNA有明顯的上調(diào)作用。雖然早先已有研究提示，YAP可抑制TGF-Smad通路功能[15]，但YAP對肝癌細胞內(nèi)源性TGF-β1 mRNA的影響尚未見報道，結合本實驗結果推測YAP做為核轉錄因子有可能參與調(diào)控肝癌細胞自身的TGF-β1 mRNA的量，并起到抑制作用，即高水平YAP存在時TGF-β1 mRNA水平受抑制，當YAP水平下降時，TGF-β1 mRNA水平升高。這一結果對針對YAP基因的靶向治療研究有重要意義。