趙宇卓 吳 盡 楊天雄 姚茂林 裴 欣 付藍(lán)儀 劉學(xué)東

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

動(dòng)物腸道環(huán)境中寄生著大量微生物，與宿主間形成共生關(guān)系[1]。傳統(tǒng)腸道微生物研究方法主要是在體外從復(fù)雜樣本中分離獲得單一菌株，純培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定分析，然而純培養(yǎng)技術(shù)能獲得的細(xì)菌僅占自然界細(xì)菌的一小部分，很大程度上低估了臨床和自然環(huán)境樣本中微生物的多樣性[2]。伴隨著高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析技術(shù)的發(fā)展，2005年Eckburg等[3]首次對(duì)人類糞便以及結(jié)腸區(qū)域的細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序分析，揭示了人類糞便樣本中含有大量非培養(yǎng)細(xì)菌和未被發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌。Gill等[4]通過全宏基因組測(cè)序分析人類腸道菌群，表明腸道微生物參與到多糖、氨基酸和外源生物的代謝等重要途徑中。以上兩項(xiàng)研究為腸道微生物領(lǐng)域研究提供了新的方法論，成為研究腸道微生物的主要方式，研究人員逐步揭示出腸道微生物在動(dòng)物的代謝[5]和免疫[6]等多種重要的生理過程中所扮演的關(guān)鍵角色。因此，充分了解動(dòng)物腸道微生物的組成及功能在野生動(dòng)物生理生態(tài)等研究中具有重要意義。本篇綜述中，我們將對(duì)宏基因組技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)，并結(jié)合宏基因組技術(shù)在野生脊椎動(dòng)物腸道微生物領(lǐng)域中的具體應(yīng)用，從而探討宏基因組技術(shù)在野生動(dòng)物領(lǐng)域研究中的應(yīng)用前景，以及在野生動(dòng)物保護(hù)與管理中所能起到的作用。

1 宏基因組學(xué)在腸道微生物中的研究方法

目前被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物腸道微生物研究的高通量宏基因組技術(shù)，主要為標(biāo)志基因擴(kuò)增子分析和全宏基因組分析，兩種方法各自有其優(yōu)缺點(diǎn)(表1)，應(yīng)根據(jù)研究的目的需求來進(jìn)行方法的選擇。

表1 兩種宏基因組分析方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

1.1 標(biāo)志基因擴(kuò)增子分析

標(biāo)志基因擴(kuò)增子測(cè)序，基于PCR擴(kuò)增微生物群基因組特定區(qū)域，此類區(qū)域通常包含至少一個(gè)高度可變區(qū)，用于微生物分類學(xué)鑒定，高變區(qū)的兩側(cè)是高度保守的區(qū)域，可作為PCR引物的結(jié)合位點(diǎn)，隨后通過高通量測(cè)序分析來研究樣本中的微生物的組成及功能。目前，應(yīng)用較為廣泛的擴(kuò)增子分析有用于鑒定細(xì)菌和古菌的16S rRNA基因、真核生物的18S rRNA基因以及真菌的ITS區(qū)域。腸道微生物組成以細(xì)菌為主，因此選擇16S rRNA擴(kuò)增子進(jìn)行研究。

1.1.1 樣本處理與建庫(kù)測(cè)序

在腸道微生物研究中，首先需要從糞便樣本中提取完整的DNA，Costea等[7]對(duì)21種糞便DNA提取方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明提取方法會(huì)明顯影響DNA的質(zhì)量以及數(shù)據(jù)分析結(jié)果，比如不同方法對(duì)于革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的提取效率會(huì)存在明顯差別，因此實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)樣本情況來選取合適的提取方法。

在獲取高質(zhì)量DNA后，利用通用引物擴(kuò)增16S rRNA基因區(qū)域并完成建庫(kù)測(cè)序。細(xì)菌16S rRNA基因由9個(gè)可變區(qū)域組成。目前大部分研究使用的是以Illumina為代表的二代測(cè)序平臺(tái)，由于其短讀長(zhǎng)的特點(diǎn)，因此只能對(duì)16S rRNA基因的部分可變區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序分析，然而對(duì)不同可變區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增分析，最終產(chǎn)生的物種分類結(jié)果會(huì)存在較大差異[8]，并且在物種注釋時(shí)大部分只能分類到屬水平以及會(huì)出現(xiàn)分類錯(cuò)誤的情況，而對(duì)16S rRNA進(jìn)行全長(zhǎng)分析則能獲得更高的分類分辨率以及準(zhǔn)確度[9]。Karst等[10]將分子合成標(biāo)簽技術(shù)與二代測(cè)序平臺(tái)結(jié)合使用，能實(shí)現(xiàn)對(duì)全長(zhǎng)16S rRNA和18S rRNA基因進(jìn)行分析，但該方法也僅限于對(duì)長(zhǎng)度小于2 000 bp的擴(kuò)增子研究。近年來，Pacbio的SMRT(single-molecule real-time sequencing)測(cè)序[11]和Oxford的納米孔測(cè)序[12]等三代單分子測(cè)序技術(shù)具備長(zhǎng)讀取的特點(diǎn)，極大地拓展了擴(kuò)增子技術(shù)可測(cè)量的范圍。但是三代單分子測(cè)序技術(shù)普遍存在測(cè)序高錯(cuò)誤率問題，Pacbio平臺(tái)采用的SMAT測(cè)序會(huì)發(fā)生的是隨機(jī)錯(cuò)誤，即錯(cuò)誤不會(huì)總發(fā)生在同一個(gè)位置，在環(huán)形一致測(cè)序(circular consensus sequencing)模式下，聚合酶的讀長(zhǎng)通常大于插入片段的長(zhǎng)度，會(huì)對(duì)插入片段進(jìn)行多次測(cè)序，通過算法進(jìn)行自我糾錯(cuò)便可以得到高準(zhǔn)確度的序列[13]。與之相比，Oxford的納米孔測(cè)序的缺點(diǎn)主要在于同聚物和串聯(lián)重復(fù)區(qū)域形成的錯(cuò)誤難以消除，并且在高GC區(qū)域產(chǎn)生刪除和錯(cuò)配的幾率也顯著增加[14]。因此Pacbio測(cè)序平臺(tái)憑借高準(zhǔn)確率和長(zhǎng)讀取的優(yōu)勢(shì)將成為擴(kuò)增子研究中的主要工具。

1.1.2 數(shù)據(jù)處理與分析

測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)通過SMRT Link軟件處理，獲得高質(zhì)量循環(huán)一致序列(CCS read)，隨后利用主流的擴(kuò)增子分析平臺(tái)Mothur[15]、Usearch[16]以及QⅡME2[17]，對(duì)CCS序列進(jìn)行擴(kuò)增引物去除、聚類或降噪以及嵌合體去除，最終獲得可操作分類單元(OTUs)或擴(kuò)增子序列變體(ASVs)。將聚類或降噪獲得的代表性序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，從而實(shí)現(xiàn)物種注釋，用于16S rRNA擴(kuò)增子分析的常用公共參考數(shù)據(jù)庫(kù)有RDP[18]、Greengene[19]、SILVA[20]。

多樣性分析是擴(kuò)增子測(cè)序分析中的重要部分，α多樣性主要衡量單一樣本微生物群落的豐度和多樣性；β多樣性則反應(yīng)對(duì)不同樣品或不同組間樣品的微生物群落構(gòu)成的相異性。此外，根據(jù)擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于微生物群落的功能預(yù)測(cè)，常用的軟件有PICRUSt2[21]和Tax4Fun[22]等。

1.2 全宏基因組分析

全宏基因組分析是對(duì)樣本內(nèi)微生物群總DNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析，包含有細(xì)菌、古菌、原生動(dòng)物、病毒與真菌。與標(biāo)記基因擴(kuò)增子分析相比，宏基因組測(cè)序不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因此不存在引物偏好性影響結(jié)果，并且可以獲取更為詳細(xì)的遺傳學(xué)信息和更高的分類學(xué)分辨率。

1.2.1 樣本處理與建庫(kù)測(cè)序

在實(shí)際應(yīng)用中，由于二代測(cè)序技術(shù)獲得的微生物基因組由于短讀長(zhǎng)往往存在片段化問題，在組裝時(shí)會(huì)遺漏很多生物學(xué)信息，而三代長(zhǎng)讀測(cè)序能夠?qū)Χ套x產(chǎn)生的缺失部分進(jìn)行覆蓋，因此使用二、三代結(jié)合測(cè)序分析，能夠獲得更加完整且準(zhǔn)確的宏基因組[23]。相比于擴(kuò)增子分析，全宏基因組分析獲取的信息更多，但也因此在建庫(kù)和測(cè)序上成本和難度會(huì)更大。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理與分析

獲取下機(jī)數(shù)據(jù)后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制并且去除宿主基因，然后通過組裝軟件對(duì)序列進(jìn)行組裝，組裝是宏基因組數(shù)據(jù)處理的關(guān)鍵部分，對(duì)后續(xù)分析起重要作用，組裝軟件可分為二代測(cè)序數(shù)據(jù)組裝軟件MEGAHIT[24]等，三代測(cè)序數(shù)據(jù)組裝軟件Canu[25]、MECAT[26]等，以及二、三代測(cè)序混合組裝軟件metaSPAdes[27]、OPERA-MS[23]等?；诮M裝結(jié)果，對(duì)序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，目前主要有兩種方式，一種是根據(jù)已知序列，通過相似性對(duì)比，進(jìn)行同源預(yù)測(cè)，該方法依賴數(shù)據(jù)庫(kù)信息，不能注釋出新基因，并且十分消耗計(jì)算資源及時(shí)間；另一種方法為根據(jù)序列特征進(jìn)行預(yù)測(cè)的從頭預(yù)測(cè)法，如Metagenemark2[28]、MetaProdigal[29]等軟件。預(yù)測(cè)完成后，根據(jù)基因序列聚類相似度以及基因序列聚類覆蓋度，使用CD-HIT軟件對(duì)預(yù)測(cè)的基因序列進(jìn)行聚類，構(gòu)建非冗余基因集[30]，再通過Salmon軟件能進(jìn)一步計(jì)算出基因在樣本中的表達(dá)豐度[31]，將基因預(yù)測(cè)結(jié)果，與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比完成對(duì)于基因的功能注釋。

基于全宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行物種組成分析時(shí)，主要通過分箱和分類兩種方式，兩種方式在實(shí)際應(yīng)用中經(jīng)常交替使用。在復(fù)雜的宏基因組樣本中包含大量非培養(yǎng)細(xì)菌，分箱方法根據(jù)核酸組成區(qū)分不同物種來源的序列，從而獲得微生物群落中單個(gè)菌株的基因組草圖，是獲取樣本中非培養(yǎng)微生物基因組的重要途徑[32]，目前常用的分箱軟件有MaxBin2[33]、MetaBat2[34]。而分類是基于參考數(shù)據(jù)庫(kù)與測(cè)序序列的對(duì)比，對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行物種注釋，Ye等[35]比較了20種宏基因組分類軟件，評(píng)估其在宏基因組分類中的表現(xiàn)、參考數(shù)據(jù)庫(kù)大小和更新速度以及硬件要求，為分類軟件的選擇提供了重要的參考。

2 宏基因組學(xué)在野生動(dòng)物腸道微生物中的應(yīng)用進(jìn)展

2.1 哺乳類

動(dòng)物腸道微生物組成和其飲食結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。He等[36]利用全宏基因組測(cè)序分析，揭示了圈養(yǎng)東北虎(Pantheratigrisaltaica)腸道微生物組成結(jié)構(gòu)及功能，結(jié)果顯示其腸道功能主要以碳水化合物代謝、氨基酸代謝以及膜轉(zhuǎn)運(yùn)為主，具有典型肉食動(dòng)物的腸道微生物結(jié)構(gòu)。大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)和小熊貓(Ailurusfulgens)在系統(tǒng)發(fā)育中屬于食肉目(Carnivora)動(dòng)物，但二者均專竹食生活，研究表明相比于食肉動(dòng)物，二者腸道中用于消化纖維素、半纖維素的細(xì)菌豐度較高，以助于消化竹子[37-39]。鯨目(Cetacea)動(dòng)物從食草的陸生偶蹄目(Artiodactyla)動(dòng)物進(jìn)化而來，與牛(Bostaurus)和河馬(Hippopotamusamphibius)有親緣關(guān)系[40]，長(zhǎng)須鯨(Balaenopteraphysalus)腸道菌群表現(xiàn)出在蛋白質(zhì)消化和生物合成相關(guān)基因方面與食肉海洋魚類菌群相似，而在碳代謝和能量代謝相關(guān)基因方面與食草動(dòng)物相似，這說明了飲食和進(jìn)化史結(jié)合在一起形成了鯨目動(dòng)物腸道中的微生物多樣性[41]。

腸道微生物動(dòng)態(tài)變化是野生動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境的重要手段。通過比較冬季和春季藏酋猴(Macacathibetana)腸道微生物樣本，發(fā)現(xiàn)其腸道中碳水化合物和能量代謝途徑相關(guān)功能的細(xì)菌在春季樣本中顯著增長(zhǎng)，使藏酋猴從冬季經(jīng)歷的嚴(yán)重能量損失中快速恢復(fù)[42]。腸道菌群組成和功能的變化為能量和營(yíng)養(yǎng)攝入的季節(jié)性波動(dòng)提供了緩沖，以適應(yīng)食物供應(yīng)的變化。孫國(guó)雷[43]對(duì)羊亞科(Caprinae)的喜馬拉雅塔爾羊(Hemitragusjemlahicus)、巖羊(Pseudoisnayaur)和歐洲盤羊(Ovisariesmusimon)的腸道微生物進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序分析，結(jié)果顯示厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)在3個(gè)物種的腸道中均占主導(dǎo)地位，這兩個(gè)門類中分別以消化纖維素與半纖維素等粗纖維的梭菌目(Clostridiales)和擬桿菌目(Bacteroidales)細(xì)菌為主；另一方面喜馬拉雅塔爾羊的厚壁菌門與擬桿菌門的比值及梭菌目的豐度占比顯著高于其他兩種動(dòng)物，說明塔爾羊腸道能更加高效地將食物中的粗纖維轉(zhuǎn)變?yōu)槎替溨舅釓亩┙o能量，以適應(yīng)高海拔生活和惡劣環(huán)境。

2.2 鳥類

多數(shù)鳥類營(yíng)飛行生活，候鳥進(jìn)行長(zhǎng)距離遷徙以適應(yīng)季節(jié)變化，隨著越冬時(shí)期不斷推進(jìn)，白頭鶴(Grusmonacha)腸道中的厚壁菌門豐度呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，變形菌門(Proteobacteria)豐度則顯著下降[44]。新西蘭鸮鸚鵡(Strigopshabroptila)處于極度瀕危狀態(tài)，其腸道微生物多樣性較低，幾乎只包含厚壁菌門和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)，該研究為鸮鸚鵡極危物種的保護(hù)提供了重要的微生物基礎(chǔ)[45]。通過與陸生動(dòng)物進(jìn)行比較，鳥類的腸道微生物表現(xiàn)出與宿主系統(tǒng)發(fā)育或飲食的相關(guān)性非常微弱[46]，這可能與鳥類為適應(yīng)飛行減輕體重，而發(fā)育的特殊排泄系統(tǒng)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.3 兩棲爬行類

兩棲動(dòng)物在脊椎動(dòng)物進(jìn)化中具有重要地位，是由水生轉(zhuǎn)變?yōu)殛懮囊活愡^渡物種，爬行動(dòng)物由兩棲動(dòng)物進(jìn)化而來且完全適應(yīng)陸生生活。兩棲動(dòng)物幼體水生，成體陸生，中國(guó)林蛙(Ranachensinensis)在由水生蝌蚪變態(tài)發(fā)育至陸生成體過程中，腸道微生物組成發(fā)生極大轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為擬桿菌屬(Bacteroides)、鯨桿菌屬(Cetobacterium)和梭菌屬(Clostridium)等減少，并且在不同變態(tài)時(shí)期的腸道微生物的多樣性也表現(xiàn)出明顯地變化[47]。兩棲爬行類動(dòng)物是典型的變溫動(dòng)物，冬眠是其適應(yīng)低溫氣候的重要生活方式，研究表明揚(yáng)子鱷(Alligatorsinensis)在冬眠期其腸道特異性微生物通過利用宿主來源的粘蛋白糖苷從而維持生命，以適應(yīng)宿主冬眠禁食期間腸道內(nèi)食物匱乏的情況，這與多數(shù)非冬眠恒溫動(dòng)物選擇通過大量進(jìn)食來增加代謝并抵御低溫所采取的策略相反。而在活躍期，揚(yáng)子鱷腸道呈現(xiàn)典型食肉動(dòng)物特征，即高豐度的梭桿菌門(Fusobacteria)，并且具有水解蛋白質(zhì)、多肽及發(fā)酵氨基酸功能的細(xì)菌顯著富集以適應(yīng)高蛋白飲食[48]。

2.4 魚類

水體理化性質(zhì)(如溫度、鹽度等)的變化會(huì)影響著魚類腸道微生物，研究表明大西洋鮭魚(SalmosalarL.)腸道細(xì)菌數(shù)量會(huì)隨著水溫升高而增加[49]。Zhang等[50]在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下模擬淡水和海水環(huán)境探究不同鹽度對(duì)于尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)腸道微生物的影響，結(jié)果顯示處于高鹽度環(huán)境下假單胞菌(Pseudomonas)、鯨桿菌屬以及德沃斯氏菌屬(Devosia)豐度更高。

食性同樣也是影響魚類腸道微生物組成的重要因素。在草食性魚類腸道中，以纖維素溶解菌，如檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、纖毛菌屬(Leptotrichia)和梭菌屬為主；在肉食性魚類腸道中則以鯨桿菌屬和生產(chǎn)蛋白酶的鹽單胞菌屬(Halomonas)為主，證明食性在魚類腸道微生物中同樣有重要的影響，并且魚類腸道微生物多樣性也伴隨肉食、雜食、草食食性呈現(xiàn)遞減狀態(tài)[51]。

3 展望

綜上所述，伴隨著測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，對(duì)于野生動(dòng)物腸道微生物的研究重點(diǎn)逐漸由簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)組成分析深入到微生物功能分析，涉及食性、健康以及環(huán)境適應(yīng)等諸多方面，為野生動(dòng)物保護(hù)與管理提供了重要的參考和應(yīng)用價(jià)值。首先，腸道微生物多樣性可以作為評(píng)估野生動(dòng)物所在棲息地是否適宜生存的重要指標(biāo)。研究表明由于人類活動(dòng)導(dǎo)致的動(dòng)物棲息地污染[52]、破碎化以及縮減[53]都會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物腸道微生物的多樣性下降，多樣性的損失對(duì)宿主的健康產(chǎn)生影響。其次，應(yīng)用于實(shí)施遷地保護(hù)物種的野化放歸過程中。由于人工圈養(yǎng)條件下的生活環(huán)境相比野外要更加干凈，動(dòng)物因此喪失了大量環(huán)境來源的微生物，直接導(dǎo)致了腸道微生物多樣性下降，即使人工模擬野外飲食條件也很難使其腸道微生物結(jié)構(gòu)與野生種群一致[54]，腸道微生物多樣性決定著圈養(yǎng)動(dòng)物在放歸后對(duì)于野外環(huán)境是否有足夠的抵抗力和適應(yīng)力，因此腸道微生物多樣性應(yīng)作為是否適于放生的重要考量指標(biāo)。

不僅限于腸道樣本研究，宏基因組技術(shù)目前也已廣泛應(yīng)用于各種臨床樣本(如口腔，皮膚和腦脊液等)的病原體診斷中[55]，近年來由野生蝙蝠(Chiroptera)攜帶的病原體導(dǎo)致的疾病在人類中大規(guī)模爆發(fā)，如馬爾堡病毒和亨德拉病毒等，蝙蝠口腔和排泄物中的病原體伴隨季節(jié)性繁殖的進(jìn)行而發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，并且排泄行為可能是其病原體脫落并傳播的重要途徑[56]。研究人員通過對(duì)已死亡的馬來穿山甲(Manisjavanica)的多個(gè)器官進(jìn)行宏基因組病毒分析，檢測(cè)到多種可以傳染人類的病毒，如仙臺(tái)病毒及冠狀病毒，表明穿山甲可以作為冠狀病毒傳播的中間宿主[57]，由此可以看出宏基因組技術(shù)將被廣泛地應(yīng)用于野生動(dòng)物檢疫中，從而促進(jìn)野生動(dòng)物醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生學(xué)的發(fā)展。

宏基因組技術(shù)雖然已成為目前微生物研究中的重要工具，但該技術(shù)的局限性在于其只能獲得微生物群的組成結(jié)構(gòu)和整體功能圖譜，不能了解微生物群的功能基因的瞬時(shí)表達(dá)情況，需要同宏轉(zhuǎn)錄組、代謝組學(xué)[58]以及宏蛋白組[59]等組學(xué)技術(shù)進(jìn)行結(jié)合使用，然而成本較高以及對(duì)分析流程進(jìn)行整合優(yōu)化仍是多組學(xué)聯(lián)合分析面臨的問題。相信在以上問題得以解決后，研究人員將會(huì)更全面地了解微生物在野生動(dòng)物生活史中所扮演的角色。