劉金月 劉德凱 王璐瑤 李 響 賈博文 劉艷華

(東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護地學(xué)院，哈爾濱，150040)

動物腸道菌群的組成受環(huán)境和地理因素的影響，并且在宿主生長和發(fā)育等許多方面起著重要作用[1]。在過去的10年里，腸道微生物在健康和疾病中的作用已經(jīng)成為一個具有重大科學(xué)意義和臨床研究的重要性領(lǐng)域。在各種生態(tài)位中，動物腸道擁有復(fù)雜和豐富的微生物群落，是宿主-微生物相互作用的舞臺，具有局部和系統(tǒng)的影響[2]。腸道微生物在營養(yǎng)消化吸收、腸道健康和免疫等諸多方面發(fā)揮著重要作用，是動物生存和適應(yīng)環(huán)境的關(guān)鍵[3]。大量研究表明，哺乳動物腸道疾病的發(fā)生與腸道微生物的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[4-6]。腸道微生物的結(jié)構(gòu)受很多因素的影響，例如食性、疾病、生活方式等。

西伯利亞狍(Capreoluspygargus)隸屬于偶蹄目(Artiodactyla)，鹿科(Cervidae)，狍屬。主要分布于亞洲中部、歐洲、蒙古、俄羅斯等地區(qū)。在我國，分布于東北大興安嶺亞區(qū)、長白山地亞區(qū)、松遼平原亞區(qū)，華北區(qū)黃淮平原亞區(qū)、黃土高原亞區(qū)，蒙新區(qū)天山山地亞區(qū)和青藏區(qū)青海藏南亞區(qū)；邊緣分布于西南區(qū)西南山地亞區(qū)、華中區(qū)東部丘陵平原亞區(qū)。目前，狍的養(yǎng)殖主要分布在長白山地區(qū)，如白山市、通化縣、吉安市等，在河北、內(nèi)蒙古和新疆地區(qū)也有被飼養(yǎng)的狍[7]。目前，我國人工飼養(yǎng)狍的方式主要2種，分別為庭院式養(yǎng)殖和場區(qū)式養(yǎng)殖。因為野生狍馴化難度較大，大規(guī)模養(yǎng)殖場少，飼養(yǎng)方式落后，養(yǎng)殖技術(shù)含量低，預(yù)防疾病的體系不完善，沒有形成養(yǎng)殖規(guī)模和標(biāo)準(zhǔn)化，養(yǎng)殖者對狍科學(xué)養(yǎng)殖的知識儲備不足，嚴重制約了狍養(yǎng)殖的科學(xué)發(fā)展[8]。

腸道菌群是宿主不可分割的組成部分。微生物群在宿主的健康中起關(guān)鍵作用，包括腸道細胞的增殖，病原體的防御，次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生以及復(fù)合碳水化合物的消化。一些腸道微生物與脊椎動物形成了內(nèi)在的共生關(guān)系，這對健康至關(guān)重要。通過現(xiàn)代生活方式破壞這些共生關(guān)系，可能導(dǎo)致了疾病的增加[9]。反芻動物有獨特的消化特性和微生物有助于適應(yīng)高纖維食品，它們也容易感染多種疾病。家養(yǎng)反芻動物通常以大量的谷物和少量的纖維為食。當(dāng)反芻動物飼喂缺乏纖維時，體內(nèi)生理機制的穩(wěn)態(tài)將被破壞，瘤胃的pH值將下降，微生物生態(tài)系統(tǒng)將發(fā)生改變，并且動物變得更易患病，代謝紊亂，在某些情況下還容易受到傳染性疾病的影響[10]。因此研究圈養(yǎng)狍腸道菌群多樣性，根據(jù)腸道菌群特點，為開展飼料科學(xué)化配制的研究工作提供理論依據(jù)，科學(xué)化養(yǎng)狍，向狍養(yǎng)殖的區(qū)域化、規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究樣品取自吉林省舒蘭市上營鎮(zhèn)狍養(yǎng)殖基地，共采集14只圈養(yǎng)(JY)狍糞便樣品。其中雌性8只，雄性6只(表1)。14只狍均為健康個體，在過去的3個月里沒有注射過任何抗生素或消炎藥。為了保持糞便新鮮、不受污染，狍圈舍在前一天被提前清理干凈，所有糞便在脫糞后10 min內(nèi)立即被收集起來，戴上一次性無菌手套，每收集一個個體糞便樣品，換一次一次性無菌手套，以避免人為污染。收集后立即將樣品置于含95%酒精的無菌離心管中并密封以避免樣品之間交叉污染，然后置于移動式冰箱運輸?shù)綄嶒炇?，并?80℃冷凍直至DNA提取。

表1 圈養(yǎng)狍個體信息

1.2 DNA的提取和純化

稱取200 mg的樣品，放入滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL 70%乙醇，震蕩混勻，10 000 rpm室溫離心3 min，棄置上層液體。加入1×PBS溶液，震蕩混勻，10 000 rpm室溫離心3 min，棄置上層液體。倒置2 mL管于吸水紙上1 min，直至沒有液體流出。將樣品管放入55℃烘箱10 min，使殘留酒精完全揮發(fā)，根據(jù)OMEGA試劑盒E.Z.N.A.TMMag-Bind Soil DNA Kit的使用說明書(http：//omegabiotek.com/store/product/soil-dna-kit/)提取DNA。利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。

1.3 PCR擴增

以純化的DNA為模板進行PCR擴增。第一輪擴增區(qū)域為16S rRNA基因的V3—V4區(qū)。PCR所用的引物，341F引物：CCTACGGGNGGCWGCAG，805R引物：GACTACHVGGGTATCTAATCC。第二輪擴增，引入Illumina橋式PCR兼容引物，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測。利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對回收DNA精確定量后，按照1∶1的等量混合進行測序。等量混合時，每個樣品DNA量取10 ng，最終上機測序濃度為20 pmol。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Illumina MiseqTM得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別(base calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列(sequenced reads)。Miseq測序序列中含有barcode序列，以及測序時加入的引物和接頭序列。首先需要去除引物接頭序列，再根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads 拼接(merge)成一條序列，然后按照barcode標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行質(zhì)控過濾，得到各樣本的有效數(shù)據(jù)。按相似性將序列分成不同的操作分類單元(OTU)，相似度大于等于97%。使用Mothur進行α多樣性指數(shù)分析。物種分類分析可以得知樣品在各分類水平上的分類學(xué)比對情況。β多樣性分析，可以很好地反映各分類水平上群落分布組成的異同。距離熱圖能通過顏色直觀地展現(xiàn)樣本與樣本之間的距離關(guān)系，即樣本與樣本之間的相似程度。X軸和Y軸均為樣本，顏色塊代表距離值，顏色越紅表示樣本間距離越近，相似度越高，越藍則距離越遠。通過PCoA可以觀察個體或群體間的差異。X軸和Y軸表示兩個選定的主成分，百分比表示主成分對樣本組成差異的貢獻值。不同顏色的點代表不同組中的樣本，樣本間相似度越高則在圖中越聚集，反之樣本間相似度越低則在空間距離越遠。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量分析

14只狍糞便樣品共獲得1 216 315條有效序列，平均長度為413.98 bp，雌性樣本平均為(78 880±17 035)條序列，雄性樣本平均為(97 545±18 018)條序列?；?7%有效序列相似度進行OTU聚類，共獲得16 221個OTUs，OTU個數(shù)雌性樣本平均為(1 145±286)，雄性樣本平均為(1 176±394)。

2.2 Alpha多樣性分析

根據(jù)OTU數(shù)據(jù)繪制了稀疏性曲線(圖1)，Specaccum物種累積曲線(圖2)。稀疏性曲線末端趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)有效反映了狍腸道微生物菌群的多樣性。物種累積曲線反映了持續(xù)抽樣下新OTU(新物種)出現(xiàn)的速率。在樣本量為0—10內(nèi)，曲線急劇上升，表示群落中有大量物種被發(fā)現(xiàn)，樣本量約為15左右時，曲線趨于平緩，表示微生物的種類不會隨狍糞便樣品數(shù)量的增加而有明顯的增加。Alpha多樣性指數(shù)如2表所示，Ace指數(shù)范圍2 128.93—772.98，Chao1指數(shù)范圍2 128.89—785.27，Shannon指數(shù)范圍5.44—3.78，Simpson指數(shù)范圍0.07—0.01。

2.3 物種分類分析

2.3.1 門水平菌群組成差異

對于雌性和雄性腸道菌群在門水平上進行了扇形圖展示(圖3)。其中雌雄主要的3個門類是相同的，分別是Firmicutes(雌55.91%，雄57.19%)，Bacteroidetes(雌30.66%，雄27.50%)，Proteobacteria(雌雄都是6.84%)。還有一些所占比例較小的門類，Verrucomicrobia在雌性所占比例為2.57%，在雄性占0.95%。Spirochaetes在雌性中所占比例為1.69%，在雄性占2.94%。通過對比發(fā)現(xiàn)，在門水平上的各類菌群在不同性別狍腸道內(nèi)存在比例上的差異，前三大優(yōu)勢門類雖然都是Firmicutes，Bacteroidetes，Proteobacteria，但它們所占的比例不同，雌性個體第四優(yōu)勢門類是Verrucomicrobia，而雄性個體是Spirochaetes。同時在個體樣本中也發(fā)現(xiàn)個體門類組成的差異(圖4)，雌性個體JY3和雄性個體JY9除Firmicutes，Bacteroidetes，Proteobacteria這三類菌群外，其他門類菌群所占比例都很低。

2.3.2 科水平菌群組成差異

對于雌性和雄性共有38個主要的科水平細菌分類，進行了扇形圖展示(圖5)，其中雌雄主要的4個科類是相同的，分別是Ruminococcaceae(雌27.78%，雄31.18%)，Lachnospiraceae(雌17.23%，雄11.61%)，Porphyromonadaceae(雌12.34%，雄9.75%)，Bacteroidaceae(雌10.64%，雄7.92%)。還有一些所占比例較小的門類，Succinivibrionaceae在雌性所占比例為3.73%，在雄性占2.47%。Prevotellaceae在雌性中所占比例為3.04%，在雄性占3.93%。同時通過對比發(fā)現(xiàn)，個體間的微生物豐度在科水平上有差異。雌性個體中Ruminococcaceae在JY7和JY13腸道內(nèi)含量相對較少，Bacteroidaceae在JY7、JY10和JY13中含量較高(圖6)。雄性個體中Ruminococcaceae在JY11和JY14腸道內(nèi)含量較少，Prevotellaceae在JY4中含量較少(圖6)。

2.3.3 屬水平菌群組成差異

在屬水平上，雌性未分類菌群占42.15%，雄性未分類菌群占44.59%(圖7)。雌雄狍腸道內(nèi)前3個主要菌屬相同分別為Bacteroides(雌10.63%，雄7.92%)，ClostridiumXIVa(雌7.44%，雄5.57%)，ClostridiumIV(雌3.82%，雄4.57%)。還有一些占比較小的菌群，Succinivibrio(雌3.72%，雄2.47%)，Ruminococcus(雌2.74%，雄2.7%)，Alistipes(雌2.55%，雄2.18%)，Akkermansia(雌2.38%，雄0.73%)等，除上述菌群外，雌性特有的菌屬為Roseburia(1.31%)，Alloprevotella(1.05%)，Lachnospiraceae_incertae_sedis(1%)和Coprococcus(0.8%)；雄性特有的菌屬為Fusobacterium(1.86%)，Succiniclasticum(1.22%)，Streptococcus(0.9%)和Clostridiumsensustricto(0.69%)。

2.3.4 Beta多樣性分析

圖8是基于weighted-UniFrac的樣品距離heatmap圖。圖9為不同性別樣本的PCoA(principal co-ordinates analysis)分析圖。從以上2個圖中可以看出，狍樣本幾乎混在一起，沒有明顯差異，從而說明beta多樣性分析顯示雌雄狍腸道內(nèi)菌群無顯著差異。

3 討論

本研究采用16S rRNA Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)來研究狍腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示：圈養(yǎng)狍雌雄腸道菌群結(jié)構(gòu)無顯著差異。在不同物種分類水平上，狍腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群有些不同。在門的水平上前三大優(yōu)勢菌群是相同的，其中前兩大優(yōu)勢菌門為Firmicutes，Bacteroidetes，這與其他先前反芻動物腸道菌群的研究結(jié)果一致[11-12]。第三大優(yōu)勢菌門為Proteobacteria，在小熊貓(Ailurusfulgens)中，Proteobacteria被認為是優(yōu)勢物種，它們在消化木質(zhì)素的主要食物來源中起著關(guān)鍵作用[13-14]。雌性第四優(yōu)勢門類是Verrucomicrobia，而雄性是Spirochaetes。雌雄前4個主要的科類是相同的，所占比例不同。在科水平上雌性第五大優(yōu)勢菌是Succinivibrionaceae，而雄性第五大優(yōu)勢菌為Prevotellaceae。在受飼料限制的動物中，瘤胃中乙酸：丙酸比例(A∶P)的降低與飼料效率的提高和甲烷產(chǎn)量的降低有關(guān)，在瘤胃中生長的Succinivibrionaceae可以減少甲烷的排放，因為這一科的一些成員利用氫氣來產(chǎn)生琥珀酸鹽，而氫氣也被產(chǎn)甲烷菌利用來產(chǎn)生丙酸鹽[15]。有研究證明，GRS分數(shù)高、Prevotellaceae含量高的女性BMI較高，而Prevotellaceae含量低的女性BMI較低[16]。腸道中的Prevotellaceae與肥胖和性別相關(guān)。在屬水平上，雌雄狍腸道內(nèi)前3個主要菌屬相同，雌性第四大優(yōu)勢菌屬為Succinivibrio，雄性第四大優(yōu)勢菌屬為Treponema。

有些學(xué)者研究表明，野生動物腸道菌群的多樣性與其性別有關(guān)系。一項針對人體的性別特異性腸道菌群研究報告稱，女性組體重指數(shù)(BMI)α多樣性有差異。但是，男性BMI組之間的α多樣性沒有顯著差異[17]。Zhao等[18]對原麝(Moschusmoschiferus)的研究結(jié)果表明不同BMI水平的原麝，性別可能會影響微生物群的組成。這可能是因為在不同的發(fā)育階段，雌性和雄性個體的不同免疫抵抗。有研究表明，免疫系統(tǒng)的性別差異和激素會影響腸道菌群的形成。內(nèi)分泌系統(tǒng)與微生物組之間的相互作用有助于細菌輔助激素的產(chǎn)生和宿主激素穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[19]。Chen等[3]對不同性別的獵豹(Acinonyxjubatus))腸道微生物群進行了研究，結(jié)果表明獵豹腸道微生物群在性別上不存在顯著差異，此結(jié)果與本文研究結(jié)果圈養(yǎng)狍雌雄腸道菌群結(jié)構(gòu)無顯著差異相似。董元秋[20]對不同性別的越冬白頭鶴(Grusmonacha)腸道菌群進行了比較研究，其研究結(jié)果表明鳥類不同性別腸道菌群組成結(jié)構(gòu)沒有顯著差異。很多研究表明性類固醇激素與腸道菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)[21]。

狍是一種反芻動物，其獨特的消化特性和微生物群落有助于適應(yīng)高纖維含量的食物，并在腸道生理和調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但是，圈養(yǎng)狍的健康狀況不佳。很多較小養(yǎng)殖場，都陸續(xù)倒閉了。據(jù)推測，標(biāo)準(zhǔn)合成飼料中不適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)物質(zhì)和高含量的礦物質(zhì)鹽使其易患各種疾病[22]。大量研究表明，腸道微生物穩(wěn)態(tài)的失衡導(dǎo)致腸道和代謝性疾病的發(fā)生[12，23]。目前，大量研究表明，狍的飲食、健康狀況和基因型對腸道微生物的結(jié)構(gòu)有影響[24-25]。本研究為深入了解狍腸道菌群的多樣性提供了新的視角，有利于狍的生理和健康研究，為圈養(yǎng)狍的繁育和圈養(yǎng)動物的野外再引種奠定了基礎(chǔ)。