王春紅， 楊 璐， 胡 敏， 王曉云， 王利劍

(1. 天津工業(yè)大學 紡織科學與工程學院， 天津 300387；2. 天津工業(yè)大學 先進紡織復合材料重點實驗室， 天津 300387)

烏拉草是莎草科薹草屬植物[1]，其纖維含量達50%左右[2]，主要生長于中國東北、俄羅斯遠東地區(qū)以及日本等地區(qū)的沼澤濕地[3]。由于其具有獨特的抗菌和保暖性，對于烏拉草的開發(fā)使用已有悠久的歷史,常被編織成鞋墊、草鞋或者床墊等[4-5]。隨著對烏拉草的深入探索，科研人員對其進行脫膠、漂白或熱解等處理以獲得較高質(zhì)量的烏拉草產(chǎn)品[6]，或用其制備復合材料、納米晶須[7]及多孔碳材料[8]等。

烏拉草的功能性不僅體現(xiàn)在纖維中，還體現(xiàn)在提取液中。烏拉草纖維木質(zhì)素含量高，剛性大，手感粗糙，而提取液為液體，具有再加工開發(fā)高效益、精細化產(chǎn)品的潛能。余克嬌[9]對烏拉草提取液進行濃縮提純，確定了純化后的抗菌物質(zhì)為木犀草素。木犀草素為黃酮類化合物，在植物界分布廣泛,大量研究表明其在止咳、祛痰、消炎、抗腫瘤等方面具備藥理作用[10-12]。目前，對于木犀草素的確定及其含量測試主要采取高效液相色譜法[13-14]，其測定簡便，精度高，測定結果準確。但關于多種測試方法之間進行對比，以及烏拉草提取液中木犀草素含量與抗菌性能之間關系的研究卻很少。

本文采用水醇提取法，利用不同醇水比制備烏拉草提取液。通過紫外分光光度法和高效液相色譜法測試提取液中的抗菌物質(zhì)木犀草素的含量，并通過體外抗菌法對提取液進行抗菌性能研究，以期為烏拉草提取液作為抗菌劑使用提供數(shù)據(jù)支撐，擴大烏拉草的應用領域。

1 實驗部分

1.1 主要原料

烏拉草秸稈，產(chǎn)自齊齊哈爾市鐵鋒區(qū)，其成分占比為：脂蠟質(zhì)2.4%，果膠3.4%，半纖維素14%，水溶物5.7%，木質(zhì)素4.5%，纖維素70%。木犀草素，由南京源植生物科技有限公司提供；甲醇、乙醇、98%濃磷酸，由天津市風船化學試劑科技有限公司提供；牛肉膏、瓊脂、蛋白胨，由北京奧博星生物有限技術公司提供；高效液相用蒸餾水，由廣州屈臣氏食品飲料有限公司提供；提取烏拉草用蒸餾水，自制。

1.2 試樣的制備

1.2.1 烏拉草提取液的制備

將烏拉草秸稈剪成長約為1 cm的碎纖維，放入裝有30 mL溶劑的圓底燒杯中，連接冷凝管和橡膠管，整個裝置于電熱套中加熱。在中檔溫度下回流提取1.5 h，提取2次后合并濃縮至30 mL。濃縮條件為30 r/min、60 ℃。其中提取試劑是乙醇和水的混合溶液，體積比分別為3∶1、2∶2、1∶3、0∶4，提取的提取液依次編號分別為a、b、c、d。

1.2.2 木犀草素標準溶液的配制

使用30 mL乙醇溶液配制質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的木犀草素溶液，搖勻。采用移液槍分別量取上述溶液0.05、0.1、0.5、1、2 mL置于25 mL容量瓶中，加入乙醇溶解至定容刻度線，再次搖勻備用。這5種標準溶液的木犀草素質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、4.0、8.0、16.0 μg/mL。將標準品溶液用帶有濾頭的注射器分別注入比色皿中，待用。

1.2.3 磷酸溶液的配制

用量筒量取467 mL屈臣氏純凈水置于廣口瓶中，加入1 mL磷酸配制成質(zhì)量分數(shù)為0.4%的磷酸溶液。

1.2.4 培養(yǎng)基的制備

配制5個培養(yǎng)基，配方如表1所示。首先，取1～5號錐形瓶依次加入200 mL固體培養(yǎng)基A、B、C、D、E，6號和7號錐形瓶均加入20 mL液體培養(yǎng)基E，8號錐形瓶為50 mL蒸餾水。將所有錐形瓶、培養(yǎng)皿、吸頭、離心管等工具放入高壓滅菌鍋內(nèi)進行滅菌。然后，在6號錐形瓶接種大腸桿菌，7號錐形瓶接種金黃色葡萄球菌，均于120 r/min、37 ℃條件下的搖床中培養(yǎng)20 h，制備2種適宜濃度的菌懸液。將菌懸液稀釋到合適濃度，分別稀釋107、108、109倍3個梯度，經(jīng)實驗證明，稀釋108倍最為合適。然后將培養(yǎng)基A、B、C、D倒入平板，依次編號分別為A1、A2、A3，B1、B2、B3，C1、C2、C3，D1、D2、D3，此為實驗組；培養(yǎng)基E倒入的平板編號依次為E1、E2、E3，此為空白對照組。每個實驗樣品具有3個平行試樣。將適宜濃度的0.1 mL菌懸液用三角玻璃棒均勻涂抹于培養(yǎng)皿樣品上。所有樣品倒放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

表1 培養(yǎng)基配制方法

1.3 測試方法

采用6175-3C型pH計(天津億諾科學儀器有限公司)測定4種提取液的pH值。將pH電極放于溶液中，待示數(shù)穩(wěn)定后記錄。每種試樣測量5次，取平均值。

采用METTER TOLEDO型電導率儀(Five Eosy有限公司)對4種提取液的電導率進行測試。取下電導儀探頭將其浸入溶液中，待示數(shù)穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù)。每種試樣測量5次，取平均值。

在使用Thermo Scentific型紫外分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)測試中，通過全波長掃描確定木犀草素紫外分光光度計測試波長。在特定波長下，檢測木犀草素標準溶液的吸光度。

在使用SHIMADZU LC-15C型高效液相色譜儀(俊齊儀器設備有限公司)測試中，精密吸取樣品注入液相色譜儀，進樣分析記錄峰面積。色譜柱為C18，250 mm，5 μm;流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液(體積比為56∶44);檢測波長直接使用紫外分光光度計法測得的波長350 nm;流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。配制體積比為1∶1的甲醇和水的混合溶液，超聲30 min用以洗脫高效液相色譜儀。

用CC-570 SUNTex型菌落計數(shù)儀(上海闊思電子有限公司)觀測樣品中細菌的分布，并測試各樣品的菌落數(shù)，按下式計算抑菌率：

式中：Y為試樣的抑菌率，%；Wt為對照樣活菌濃度的平均值；Qt為試樣活菌濃度的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將紫外分光光度法與高效液相色譜法測試的結果分別在Origin中擬合。在紫外分光光度法測試結果中，根據(jù)擬合的標準曲線方程測試實驗樣品的吸光度值，計算提取液中木犀草素含量。在高效液相色譜法測試中，根據(jù)不同提取液樣品高效液相色譜圖中木犀草素特征峰面積和相應的標準曲線，計算出各提取液中木犀草素質(zhì)量濃度。在抗菌測試中，使用菌落計數(shù)器計算平板菌落濃度。

2 結果與討論

2.1 導電率和pH值測試結果分析

4種提取液因溶劑不同，從烏拉草秸稈中提取出的物質(zhì)也不盡相同，提取液性能有所差異，其pH值和電導率測試結果如表2所示。可以看出，隨著提取溶劑中水的比例的增加，提取液的電導率逐漸增大，最大為546 μS/cm，pH值逐漸減小且都呈現(xiàn)酸性。

表2 不同提取液的pH值和電導率測試結果

圖1示出各提取液的表觀顏色。由于木犀草素中具有酚羥基，所以其水溶液呈弱酸性[15]。由表2可知，提取液pH值均小于7，則提取的物質(zhì)主要呈酸性，說明溶液中可能存在木犀草素。木犀草素標準品的水溶液呈淡淡的亮黃色，但圖1提取液中顯示出不同的顏色，是因為液體中除木犀草素存在外，還溶解有其他化學物質(zhì)。

圖1 提取液的表觀顏色圖

2.2 紫外分光光度法測試結果分析

以乙醇為空白對照樣，木犀草素標準品為實驗樣，在波長為190～600 nm區(qū)間內(nèi)利用紫外分光光度計掃描。掃描結果表明，在350 nm波長處的吸收峰最強，所以本文將350 nm作為檢測波長對提取液中木犀草素進行檢測。

在波長為350 nm下測試木犀草素標準溶液的紫外光吸光度，并根據(jù)測試結果繪制木犀草素標準品紫外分光測試標準曲線，如圖2所示。標準曲線方程為

Y1=0.044 94X1+0.061 96

圖2 木犀草素標準溶液紫外分光測試曲線

采用紫外分光光度法測試不同溶劑提取液中木犀草素的質(zhì)量濃度，計算結果如表3所示。表中顯示，隨著提取溶劑中水的比例的增加，木犀草素的質(zhì)量濃度在逐漸減少。其中提取液a中檢測的木犀草素的質(zhì)量濃度最高，提取液b、c、d中木犀草素質(zhì)量濃度相近，三者差值僅在0.3 μg/mL內(nèi)。由表3還可以看出，醇水比超過50%后，提取液中木犀草素的質(zhì)量濃度陡然上升，從1.36 μg/mL突增到29.22 μg/mL。

表3 采用紫外分光光度法測得的不同溶劑提取液中木犀草素的質(zhì)量濃度

相對于水分子，有機溶劑無水乙醇的分子質(zhì)量大，極性更強，易提取烏拉草秸稈中物質(zhì)。同時木犀草素溶于乙醇，微溶于水[16]，所以隨著乙醇比例的增加，所測物質(zhì)提取量也隨之增大。

2.3 高效液相色譜法測試結果分析

圖3示出木犀草素標準溶液高效液相色譜圖?？芍?，在350 nm波長條件下，色譜圖具有唯一的特征峰，出峰時間在6.4 min左右。隨抗菌物質(zhì)質(zhì)量濃度的增大，色譜圖中特征峰的峰值及峰面積相應增大。由此對應關系繪制出木犀草素標準曲線，如圖4所示。擬合的此標準曲線方程為

Y2=99 233X2+35 626

圖3 木犀草素標準溶液高效液相色譜圖

圖4 木犀草素標準溶液高效液相色譜標準曲線

圖5示出不同提取液的高效液相色譜圖。色譜圖中不同時間出現(xiàn)的特征峰代表不同的物質(zhì)，峰值的高低及面積代表物質(zhì)的濃度[17]。根據(jù)圖3標準色譜圖可知，在6.4 min左右出現(xiàn)的峰為木犀草素的特征峰。在圖5提取液樣品高效液相色譜圖中雖然存在多個特征峰，但在固定時間6.4 min左右均有高低不同的峰出現(xiàn)，由此可以確定4種提取液中都含有木犀草素。不同提取液的色譜圖中木犀草素特征峰的峰值及峰面積不同，說明各提取液中木犀草素含量有所差異。

圖5 不同提取液樣品高效液相色譜圖

木犀草素質(zhì)量濃度計算結果如表4所示?？芍?，隨著提取液中水的比例的增大，木犀草素特征峰面積逐漸減小，即木犀草素質(zhì)量濃度逐漸減小。其中提取液a中木犀草素質(zhì)量濃度遠大于提取液b、c、d，且提取液b、c、d中木犀草素質(zhì)量濃度相近。

表4 高效液相色譜法得到的不同提取液中木犀草素的質(zhì)量濃度

2.4 抗菌性能測試結果與分析

2.4.1 對大腸桿菌的抗菌測試結果分析

圖6示出對照樣和4種提取液對大腸桿菌的抗菌效果圖，抑菌率結果如表5所示。圖6(e)對照樣中細菌菌落大小合適，細菌菌落沒有連片，散落均勻，可肉眼清晰分辨，易于計數(shù)，得出的數(shù)據(jù)較準確。圖6(a)～(d)實驗樣中的菌落數(shù)量明顯減少，且隨著提取溶劑中水比例的增加，抗菌效果有所減弱，但最低抑菌率高達75.5%。

圖6 不同醇水比烏拉草提取液對大腸桿菌的抗菌效果圖

表5 烏拉草提取液對大腸桿菌的抑菌率

根據(jù)GB/T 20944.3—2008《紡織品 抗菌性能的評價 第3部分:振蕩法》規(guī)定，只要樣品對大腸桿菌的抑菌率≥70%，即能表明該樣品具有抗菌性。觀察發(fā)現(xiàn)，不同溶劑的烏拉草提取液抑菌率均大于70%，滿足要求?？梢?，4種烏拉草提取液對大腸桿菌都具有良好的抗菌性，其中提取液a的抗菌性能最好，提取液b、c、d的抗菌性相近。結合木犀草素質(zhì)量濃度測試結果可知，木犀草素質(zhì)量濃度與對大腸桿菌的抗菌性均成正相關。

2.4.2 對金黃色葡萄球菌的抗菌測試結果分析

圖7示出對照樣和4種提取液對金黃色葡萄球菌的抗菌效果圖，計算的抑菌率如表6所示。圖7(e)中對照樣的細菌菌落大小合適，易于計數(shù)，得出的數(shù)據(jù)較準確。圖7(a)～(d)試驗樣中的菌落數(shù)明顯減少。隨著提取溶劑中水的比例的增加，抗菌效果有減弱的趨勢，其中具有最小抑菌率的提取液其抑菌率為74.6%，說明整體抗菌效果良好。

圖7 不同醇水比烏拉草提取液對金黃色葡萄球菌抗菌效果圖

由表6可知，4種烏拉草提取液對金黃色葡萄球菌都具有良好的抗菌性，其中提取液a的抗菌性能最好，提取液b、c、d的抗菌性相近，抗菌性能與所測的木犀草素含量呈正相關。

表6 烏拉草提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌率

3 結 論

本文以烏拉草秸稈為原料制備提取液，測定其基本性能，使用紫外分光光度法和高效液相色譜法測試提取液中木犀草素含量，并對其抑菌活性進行測試，得到以下主要結論。

1)隨著提取溶劑中水的比例的增加，提取液的電導率逐漸增大，pH值逐漸減小且都呈現(xiàn)酸性。

2)使用紫外分光光度法和高效液相色譜法2種方法對4種提取液進行測試，得出的木犀草素質(zhì)量濃度變化趨勢一致。隨著提取溶劑中水的比例的增大，木犀草素的質(zhì)量濃度逐漸減少。前者測試的目標物質(zhì)質(zhì)量濃度數(shù)值低于后者測試結果。

3)4種提取液對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均具有良好的抗菌性，且木犀草素質(zhì)量濃度與抗菌性能呈正相關。因其優(yōu)異的抗菌性能，提取液可做成微膠囊應用到織物整理或溶進紡絲液中，具有較好的應用前景。