陶林林，李國臻，楊志偉，耿亞松，戴芳芳，郭鈺英，霍志欣，鄭波

隨著輔助生殖技術的不斷發(fā)展，如何提高妊娠率、降低多胎率是生殖工作者一直在研究的問題。影響輔助生殖技術妊娠率的因素有很多，包括卵子質量、精子質量、促排卵方案及胚胎培養(yǎng)環(huán)境等，其中精液質量的好壞直接影響臨床妊娠結局[1]，影響精液質量的因素有很多，如年齡、取精環(huán)境、季節(jié)、禁欲天數(shù)等[2-3]。關于禁欲天數(shù)對于精液質量及宮腔內人工授精(intrauterine insemination，IUI)妊娠結局的影響，國內外均有大量的研究，但禁欲天數(shù)對于體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)的影響等鮮有報道，本研究將禁欲天數(shù)分為兩組，比較不同禁欲天數(shù)對體外受精/卵胞漿內單精子注射-胚胎移植(in vitro fertilization,IVF/intro cytoplasmic sperm injection-embryo transfer ，ICSI-ET)胚胎發(fā)育及妊娠結局的影響，旨在探討禁欲天數(shù)與IVF/ICSI-ET妊娠結局之間的關系，為臨床應用提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析在邢臺不孕不育?？漆t(yī)院生殖中心2017年1月至2019年12月行IVF或ICSI治療的患者，共2 167個周期，包括1 699個IVF周期(A組)和468個ICSI周期(B組)。分別根據(jù)男方禁欲天數(shù)的不同各分為兩個亞組：A1組，IVF禁欲天數(shù)1～3 d，共806個周期；A2組，IVF禁欲天數(shù)4～7 d，共893個周期；B1組，ICSI禁欲天數(shù)1～3 d，共217個周期；B2組，ICSI禁欲天數(shù)4～7 d，共251個周期，分析不同禁欲天數(shù)對IVF和ICSI胚胎發(fā)育和妊娠結局的影響。

納入標準:① 女方年齡<40歲；② 獲卵數(shù)≥6枚；③ 促排卵方案為長方案。排除標準：① 經皮附睪精子抽吸術及睪丸精子抽吸術助孕患者；② 患有精神疾患等禁忌證及女方縱隔子宮、雙子宮等子宮畸形、子宮肌瘤、子宮息肉、輸卵管積水、盆腔炎癥、內膜異常等疾病；③ 解凍精子助孕的患者；④ 復發(fā)性流產，既往有不良孕產史。本研究符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 卵母細胞獲取

應用常規(guī)長方案促排卵，B超監(jiān)測卵泡發(fā)育，待1/3卵泡直徑≥18 mm時，當晚肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG，珠海麗珠制藥)5 000～10 000 U，36.5 h左右行超聲引導下卵泡穿刺取卵術，卵丘卵母細胞取出后洗滌2～3遍立即放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 精液獲取及受精

取卵當日手淫取精獲取精液，詢問患者禁欲天數(shù)并記錄，所有精液經密度梯度離心處理洗滌后留取高活率的精子沉淀物及其約0.3～0.5 mL的上清液，放置培養(yǎng)箱備用，精液處理前后觀察精液參數(shù)，精液量、精子密度、精子活率、前向運動精子百分比等，根據(jù)患者病情行常規(guī)IVF或ICSI方式授精。

1.4 胚胎培養(yǎng)

受精后17～20 h后倒置顯微鏡下觀察受精情況，并記錄原核(pronucleus,PN)數(shù)目：2PN為正常受精；受精后D2和D3評估卵裂期胚胎形態(tài)，記錄胚胎細胞數(shù)、碎片比例、細胞大小是否均勻，根據(jù)患者及胚胎情況于受精后第3 d、第4 d或第5 d選擇1～2枚質量較好的胚胎移植，出現(xiàn)孕酮高、過度刺激、內膜厚度異常及無可用胚胎的患者則取消移植，行胚胎冷凍。移植后2周測血hCG，移植后28 d B超監(jiān)測觀察妊娠情況，見孕囊確定臨床妊娠，記錄妊娠囊個數(shù)。

1.5 胚胎形態(tài)學評分

在受精后第2 d和第3 d，采用Gardner評分方法對胚胎進行評分。

可用卵裂胚評分：細胞數(shù)≥6枚，胚胎級別為3級及以上，無多核證據(jù)。

第4 d可用胚胎評分：胚胎發(fā)育速度為部分融合及以上。

可用囊胚評分：囊胚至少發(fā)育到囊胚完全擴張充滿整個胚胎。內細胞團：形態(tài)規(guī)則，直徑在60 μm以上，細胞大小均勻。融合或形態(tài)不規(guī)則，直徑在60 μm以上，細胞大小不勻，有相當一部分沒有融合。滋養(yǎng)細胞層：沿囊胚“赤道面”分布可看到少量或大量卵裂球，大小均勻或不均勻，囊胚底面的細胞形態(tài)清晰或難以辨認，滋養(yǎng)細胞與透明帶之間有或無碎片殘留。

1.6 評價指標

2 PN可用胚率=2 PN可用胚數(shù)/2 PN卵裂數(shù)；可用胚胎率=可用胚胎數(shù)/卵裂數(shù)；可用囊胚形成率=可用囊胚數(shù)/養(yǎng)囊胚數(shù)；妊娠率=妊娠患者數(shù)/移植患者數(shù)；種植率=種植胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 兩組男方精液參數(shù)分析

男方精液參數(shù)分析包含IVF和ICSI的患者，禁欲4～7 d組男方精液量顯著高于禁欲1～3 d組(P<0.001)，兩組精液DFI無顯著差異，兩組偶見活動精子及無法統(tǒng)計精液參數(shù)的患者占比無統(tǒng)計學差異，排除這部分患者，對兩組剩余患者進行精液參數(shù)對比分析。禁欲4～7 d組和禁欲1～3 d組精液處理前密度、活率均無統(tǒng)計學差異，禁欲1～3 d組處理前前向運動精子率顯著高于禁欲4～7 d組(P<0.05)，禁欲4～7 d組的前向運動精子總數(shù)顯著高于禁欲1～3 d組(P<0.05)。精液處理后兩組密度、活率、前向運動精子率及前向運動精子總數(shù)均無統(tǒng)計學差異。處理后精液活率及前向運動精子率等均遠遠優(yōu)于精液處理前，詳見表1。

2.2 體外受精和卵胞漿內單精子注射兩亞組患者基本資料

IVF和ICSI兩個亞組患者的女方年齡、男方年齡、不孕年限、不孕類型、不孕因素占比、基礎激素值包括促卵泡生成素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)，黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、hCG日激素值包括LH，雌二醇(estrogen，E2)，孕酮(progesterone，P)、體質量指數(shù)(body mass index，BMI)等比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，詳見表2、表3。

2.3 體外受精和卵胞漿內單精子注射兩亞組患者的胚胎情況及妊娠結局比較

IVF和ICSI周期兩亞組的2 PN受精率、2 PN卵裂率、可用胚胎率、可用囊胚形成率、不同移植天數(shù)周期占比、移植胚胎數(shù)目及內膜厚度等均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，A2組妊娠率及種植率均顯著高于A1組(P<0.05)，B1組和B2組的妊娠率及種植率無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，B2組有高于B1組的趨勢，詳見表4、表5。

表1 兩組男方精液參數(shù)分析

表2 IVF兩亞組患者基本資料比較

表3 ICSI兩亞組患者基本資料比較

表4 IVF兩亞組患者胚胎情況及妊娠結局比較

表5 ICSI兩亞組患者胚胎情況及妊娠結局比較

3 討論

禁欲時間對精液質量的影響國內外研究較多，對于精液中精液參數(shù)，目前大部分研究者認為隨著禁欲時間的延長，精液量、精子密度和精子總數(shù)增加，但精子活率下降[4-5]。但最佳的禁欲時間尚沒有明確結論。賈紅軍等[1]研究表明禁欲時間2～≤7 d的精子濃度和活力比禁欲時間<2 d、>7 d顯著升高，禁欲時間4～<6 d時前向運動精子百分比最高，而在禁欲6～≤7 d時，前向運動精子總數(shù)達到最高。劉彩霞等[6]根據(jù)禁欲天數(shù)將研究對象分為1、2、3、4、5、6、7 d七個組，比較各組精液參數(shù)及IUI妊娠率，結果是禁欲時間越長，精子活動率及前向運動精子越低，而精子量、精子密度及前向運動精子總數(shù)等數(shù)值越高。本研究與此相似，禁欲天數(shù)1～3 d前向運動精子率顯著高于禁欲天數(shù)4～7 d，禁欲4～7 d組精液量及前向運動精子總數(shù)均顯著高于禁欲天數(shù)1～3 d組，兩組精子密度及活率等均無顯著差異。精液經過密度梯度離心+上游法洗精后，提高了精液密度、活率及前向運動精子等，兩組之間均無顯著差異，即兩組在受精前的精液參數(shù)是一致的，精液參數(shù)并不是影響妊娠結局的影響因素。

禁欲時間對精液參數(shù)的影響有了一定的共識，研究表明禁欲較長時間(>7 d)的精子濃度和活力顯著降低[1]，原因可能是睪丸及附睪中的精子保存時間較長后會對精子質量產生影響，精子形態(tài)異常、精子功能受損等，進而影響胚胎發(fā)育甚至不能成功妊娠。禁欲時間較長的附睪中的部分精子已經失去受精能力，后來睪丸形成而補給的是有受精能力的，這可能是隨著禁欲時間的延長，精液量、精子密度和精子總數(shù)增加，但精子活率下降的原因。因此不建議行IVF-ET胚胎移植的男方患者禁欲天數(shù)超過7 d，第五版《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》[7]推薦精液常規(guī)檢查的禁欲天數(shù)為2～7 d，本研究患者禁欲天數(shù)均<8 d，有部分患者忘記了醫(yī)囑而在助孕前1 d同房。

精液參數(shù)會隨著禁欲天數(shù)改變而有所改變，精子質量會隨著禁欲天數(shù)改變有怎樣的改變以及是否會對輔助生殖技術妊娠結局有一定的影響，是輔助生殖臨床專家應該重視的問題。目前7 d內禁欲天數(shù)對IUI及IVF妊娠結局影響的相關研究并不多，有報道禁欲時間越長，精子DNA碎片指數(shù)越高[8-10]，但目前禁欲時間對DNA碎片的影響尚無定論，有研究表明禁欲天數(shù)1 d和2 d的精子DNA碎片最低，與對照組有顯著差異[11]，可能是因為精子長時間暴露于精漿氧化應激微環(huán)境中，損傷了精子DNA。但并沒有直接證據(jù)證明DNA碎片率與妊娠結局及活產率有關，體外受精過程中無論IVF或ICSI，均對精子有選擇的過程，可能會弱化DNA碎片對妊娠結局的影響。梁曉東等[12]研究表明在排除女方基礎條件影響的前提下，精液DNA完整性對第1個完整周期的妊娠率及活產率無明顯影響，其累積活產率也比較相近，可能與DNA完整性來源于未經處理的精液以及移植前胚胎經過挑選有關。本研究兩組精液DNA碎片無顯著差異，禁欲天數(shù)對本研究人群精液DNA碎片無影響，因此兩組妊娠結局的比較不受DNA碎片的影響。輔助生殖專家研究禁欲天數(shù)對于妊娠結局的影響結果不一，Borges E等[13]研究了818例IVF周期，發(fā)現(xiàn)與射精禁欲>4 d組比較，射精禁欲≤4 d組不會降低精子DNA碎裂指數(shù)，能夠提高受精率，第3 d可用胚胎率、囊胚形成率、種植率和妊娠率。與禁欲時間2～4 d相比，禁欲1 d的種植率顯著增高，妊娠率有增高的趨勢。何連利等[14]的研究中，IVF受精患者禁欲天數(shù)4～7 d組妊娠率(47.5%)與禁欲天數(shù)2～3 d組(37.5%)比較，差異無統(tǒng)計學意義，但從數(shù)據(jù)來說禁欲天數(shù)4～7 d組有增高的趨勢。本研究與其研究結果相似，禁欲天數(shù)1～3 d與禁欲天數(shù)4～7 d比較，受精率、卵裂率、可用胚胎率及囊胚形成率等均無顯著差異，IVF周期禁欲天數(shù)4～7 d妊娠率和種植率顯著高于禁欲天數(shù)1～3 d，ICSI周期兩組之間無顯著差異，但禁欲天數(shù)4～7 d妊娠率與種植率有增高的趨勢。ICSI周期無差異的原因可能與ICSI受精繞過了自然選擇的過程，減弱了禁欲天數(shù)對妊娠結局的影響。本研究中兩亞組精液參數(shù)及DNA碎片均無顯著性差異，表明妊娠結局的比較不受精液參數(shù)和DNA碎片的影響。劉睿智等[15]研究表明禁欲天數(shù)1～5 d時，頂體酶活性是穩(wěn)定的，而禁欲10 d時頂體酶活性明顯下降，與禁欲1 d時頂體酶活性比較差異有統(tǒng)計學意義，因此本研究兩組頂體酶活性是無差異的。禁欲天數(shù)4～7 d妊娠結局較好的原因可能與精子核蛋白轉型有關，核蛋白轉型障礙可影響精子核染色質的正常凝聚和穩(wěn)定性，核染色質易受損傷影響妊娠結局。在核蛋白組型轉換半定量值正常患者中，禁欲時間<3 d對精子核蛋白組型轉換半定量值有影響[16]，會影響患者后期妊娠結局，因此建議輔助生殖技術禁欲天數(shù)選擇>3～7 d。但本研究中禁欲天數(shù)4～7 d妊娠結局較好的確切機理尚不明確。

綜上所述，在IVF-ET胚胎移植技術中，男方禁欲天數(shù)在4～7 d能夠顯著提高IVF妊娠率及種植率，ICSI有增高的趨勢，但本研究樣本量較少，且導致該原因的內在機理尚不明確，仍需要大樣本量隨機對照及分子機理研究進行深入分析，本文旨在提醒臨床專家禁欲天數(shù)對妊娠結局是有一定影響的，各中心可根據(jù)本身的數(shù)據(jù)結合理論選擇合適的禁欲天數(shù)，以期改善妊娠結局。