吳美嬌，吳有雪，劉 程，田亞晨，方水琴，劉 箐,2*

1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，青島 266071

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種常見的食源性致病菌，革蘭氏陰性，呈多形態(tài)桿狀或稍彎曲弧狀，廣泛分布于蝦、貝類、魚類及海藻等海產(chǎn)品中，是全球海產(chǎn)品中引起食用者腹瀉的主要原因[1]。其耐熱性弱，在沸水中10 min即可被殺死[2, 3]。食用副溶血性弧菌污染的食物會引起急性病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便等癥狀[2, 4-5]。 因此，研制一種快速檢測海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測方法尤為重要。

目前檢測副溶血性弧菌的方法主要包括傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法等。微生物培養(yǎng)方法被認(rèn)為是檢測副溶血性弧菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，主要通過增菌、分離、生化鑒定等步驟進(jìn)行檢測。也有一些開發(fā)的顯色培養(yǎng)基可以直觀的鑒定出副溶血性弧菌，如科瑪嘉的副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基可將副溶血性弧菌和其它海產(chǎn)品中常見的弧菌從菌落顏色上明顯區(qū)分開來[6]。然而，該方法檢測周期長(3 d ～5 d)，工作量大，依賴于有經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)者，不適于快速檢測的需求。而以分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法為基礎(chǔ)的檢測方法可提供快速可靠的檢測結(jié)果，是近年來研究的主要方向。其中分子生物學(xué)檢測方法主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)、實(shí)時(shí)定量PCR[7]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[8]等。該類方法檢測靈敏度高，周期短，但需要專業(yè)的技術(shù)人員和儀器設(shè)備進(jìn)行復(fù)雜的操作程序，不能滿足方便、輕便的檢測需求。免疫學(xué)檢測方法中最常用的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[9]，該方法是基于抗原與抗體特異性結(jié)合的原理對靶標(biāo)進(jìn)行特異性檢測，但其靈敏度低，檢測時(shí)間長，達(dá)不到現(xiàn)場快速檢測的需求。同樣基于雙抗體夾心原理的免疫層析色譜條(Immunochromatographic strip，ICS)[10, 11]，可實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確、廉價(jià)、便攜的現(xiàn)場檢測，因此被廣泛應(yīng)用于食源性病原體的檢測[12-15]。

影響ICS檢測靈敏度的兩個(gè)主要因素是抗體質(zhì)量和抗體標(biāo)記物材料?？贵w質(zhì)量的好壞直接影響到其是否可用于研制ICS，及其特性。且抗體的純度、特異性、效價(jià)、血清交叉反應(yīng)與ICS的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性息息相關(guān)[16, 17]。目前，以副溶血性弧菌為免疫原制備單克隆抗體的報(bào)道主要是基于標(biāo)準(zhǔn)菌株的研究，并未見將野生型菌株作為免疫原的報(bào)道，其原因可能是標(biāo)準(zhǔn)菌株的源種、血清型等信息較全，易獲得針對特定靶標(biāo)的單克隆抗體；而野生型菌株是指從自然界中分離得到的沒有發(fā)生基因突變的原始菌株，更能代表微生物的原始狀態(tài)。因此以野生型菌株作為免疫原制備單克隆抗體可能會得到更高的菌株覆蓋率。另一個(gè)影響ICS檢測靈敏度的因素是抗體標(biāo)記物材料的制備和選擇，目前已有多種納米顆粒被用于標(biāo)記抗體，如膠體金(Colloidal gold，AuNP)[18]、膠體銀[19]、量子點(diǎn)、聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)材料[20]等。其中AuNP納米顆粒因其具有易與蛋白質(zhì)偶聯(lián)，顏色鮮明，且易制備等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于免疫層析試紙條檢測方法中[21]。當(dāng)AuNP量較少時(shí)會導(dǎo)致信號較低，使得顯色較淺而不能被肉眼看到，靈敏度較低[22]。為提高ICS檢測靈敏度，可通過改變AuNP的結(jié)構(gòu)和增大表面積來實(shí)現(xiàn)，如徐鵬等[23]使用多支納米顆粒作為抗體標(biāo)記物檢測赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)，使靈敏度提高了近30倍；羅云波等[24-26]使用納米星，由于其表面積增大，使得檢測農(nóng)藥殘留的靈敏度有了顯著提高。此外，還有帶刺納米顆粒[27]、類似海膽[28-30]等形狀多樣的AuNP，被用于提高試紙條的靈敏度。因此通過改變膠體金的形狀或粒徑大小是提高檢測靈敏度的有效途徑。

本研究中，以野生型副溶血性弧菌(編號：CPBC-vp-0003)為免疫原制備單克隆抗體，通過制備大粒徑的組合膠體金納米顆粒(Composited colloidal gold nanoparticles, CP-AuNP)為抗體標(biāo)記探針，研制了一種基于雙抗體夾心原理的CP-AuNP試紙條，用于檢測海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌。該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，可為副溶血性弧菌的檢測提供簡便、快速的可視化方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梅子魚、鮮蝦、蟶子、花蛤、白蛤，購于上海某市場。

副溶血性弧菌(野生菌株編號CPBC-vp-0001～0010，與上海海洋大學(xué)交換菌株；標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17802、ATCC 33847)，大腸埃希氏菌(ATCC 25922)，腸出血性大腸桿菌O157:H7(ATCC 43895、ATCC 43889)，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(ATCC 43251、ATCC 19115、ATCC 19114)，金黃色葡萄球菌(ATCC 29213、ATCC 27660)，福氏志賀氏菌(ATCC 12022)，鮑氏志賀氏菌(ATCC 9207)，鼠傷寒沙門氏菌(CICC 22956)，豬霍亂沙門氏菌(CICC 21493)，甲型副傷寒沙門氏菌(CMCC 50093)，腸炎沙門氏菌(ATCC 13076)；sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞為上海理工大學(xué)有害微生物危害及控制研究所保藏。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、3% 氯化鈉堿性蛋白胨水、腦心浸液瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氯金酸(HAuCl4)、牛血清白蛋白(BSA)、50×HAT培養(yǎng)基[次黃嘌呤(hypoxanthine)、氨基喋呤(aminopterin)、胸腺嘧啶核苷(thymidine)]、 50×HT培養(yǎng)基(次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷)購買于Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司。Taq DNA聚合酶、小鼠單克隆抗體亞型分類試劑盒購買于生工生物工程(上海)股份有限公司；雌性BALB/c小鼠，上海潔思潔實(shí)驗(yàn)動物有限公司。副溶血性弧菌特異性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；其余試劑購自國藥化學(xué)試劑有限公司(上海)和生物工程有限公司(上海)。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR熱循環(huán)儀，美國Applied Biosystems公司；凝膠成像儀，英國Syngene公司；NC膜、樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊，上海杰一生物科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海藍(lán)柏實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；磁力加熱攪拌器，鄭州紅巖儀器設(shè)備有限公司；SpectraMaxM2酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，Thermo公司，美國；pH計(jì)，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1副溶血性弧菌單克隆抗體和CP-AuNP 的制備

副溶血性弧菌單克隆抗體的制備：以野生型副溶血性弧菌免疫BALB/c小鼠，間接酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)篩選產(chǎn)抗體的雜交瘤細(xì)胞。獲得雜交瘤細(xì)胞系后，采用體內(nèi)誘生法[31]制備腹水，具體方法為：將液體石蠟按0.5 mL/只對小鼠進(jìn)行腹腔注射致敏，7 d后將雜交瘤細(xì)胞按106個(gè)/只腹腔注射已致敏小鼠，待小鼠腹腔膨大后無菌收集腹水，間接ELISA法測定腹水抗體效價(jià)，小鼠單克隆抗體亞型分類試劑盒鑒定抗體亞型。

CP-AuNP的制備：采用一步還原法制備AuNP顆粒[15, 32]，將制備的AuNP溶液作為金種子溶液，參照種子介導(dǎo)生長法[33]制備CP-AuNP(圖1)。具體方法和原理為：在0.01%的氯金酸溶液中加入2.7 mL的1% 檸檬酸三鈉，此時(shí)氯金酸溶液中的Au3+被還原為Au+。然后加入0.6 mL金種子溶液，使Au+粘附在AuNP上。再通過加入1 mL的0.3 mmol/L對苯二酚，將金種子表面的Au+還原為Au，使多個(gè)金種子組合在一起，形成形狀各異、表面積較大的CP-AuNP粒子。

圖1 CP-AuNP標(biāo)記抗體流程及雙抗體夾心試紙條設(shè)計(jì)原理

1.3.2CP-AuNP標(biāo)記抗體

影響CP-AuNP標(biāo)記抗體的因素主要有pH和抗體濃度。因此，分別對這兩個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化最佳pH時(shí)，首先在100 μL CP-AuNP溶液中加入不同體積(0 μL、0.3 μL、0.6 μL、0.9 μL、1.2 μL、1.5 μL、1.8 μL、2.1 μL)的0.2 mol/L K2CO3，以此調(diào)節(jié)溶液的pH；充分混勻后，加入過量抗體，震蕩使CP-AuNP探針與單克隆抗體充分結(jié)合。將2.5 μL上述復(fù)合物置于結(jié)合墊，37 ℃烘干。取100 μL新鮮培養(yǎng)副溶血性弧菌，上樣于試紙條，肉眼觀察試紙上的T線和C線的顏色。當(dāng)混合物的pH為抗體蛋白的等電點(diǎn)略偏堿性(即最適pH)時(shí)，抗體蛋白能與膠體金牢固結(jié)合[34]，因此T線和C線均顯示強(qiáng)顏色信號；pH不適宜時(shí)，T線和C線均不顯示或顯示較弱顏色信號。剩余的復(fù)合物溶液加入10 μL 10% 氯化鈉溶液，觀察溶液的顏色變化。選擇幾組顏色最深的置于離心管，1 000r/min離心10 min。將離心管傾斜、倒置，觀察樣品的復(fù)溶情況。復(fù)溶越好，pH越合適。

優(yōu)化最佳抗體用量時(shí)，在100 μL CP-AuNP溶液中加入上述優(yōu)化的最佳K2CO3添加量(最佳pH)，分別加入相同體積、不同濃度(0 μg/mL、3μg/mL、9 μg/mL、12 μg/mL、16 μg/mL、24 μg/mL、36 μg/mL、72 μg/mL、96 μg/mL)的單克隆抗體，震蕩使CP-AuNP探針與單克隆抗體充分結(jié)合。后續(xù)操作如pH優(yōu)化，結(jié)合復(fù)溶性及微孔的顏色、T線及C線顯色情況，確定最佳抗體使用量。

CP-AuNP標(biāo)記抗體的方法如下：將最優(yōu)濃度的單克隆抗體滴加(40 μL/min)到最佳pH條件下的CP-AuNP溶液中，4 ℃下攪拌30 min。然后加入1/10 CP-AuNP溶液體積的pH 7.8的磷酸緩沖(PB)溶液(含10% BSA、)，持續(xù)攪拌1 h。1 000r/min離心10 min，棄沉淀；上清再經(jīng)12 000 r/min離心10 min，去除上清液。沉淀重懸于1/10 CP-AuNP溶液的金標(biāo)抗體保存液中，4 ℃保存。

1.3.3CP-AuNP試紙條的制備和抗體最佳配對的優(yōu)化

CP-AuNP試紙條由NC膜、結(jié)合墊、樣品墊、吸水墊及PVC底板五部分組成[14, 35-36]。將制備的單克隆抗體和羊抗鼠IgG抗體(1.0 mg/mL)通過點(diǎn)樣儀以1.0 μL/cm的速度分別噴在NC膜的T線和C線處，置室溫過夜干燥。用CP-AuNP-Ab溶液浸泡處理過的結(jié)合墊，37 ℃干燥。待結(jié)合墊和NC膜干燥后，如圖1，進(jìn)行組裝。

抗體最佳配對的優(yōu)化：雙抗體夾心試紙條中包含了CP-AuNP結(jié)合的捕獲抗體和在NC膜上T線處的檢測抗體，這一對抗體均需能與靶標(biāo)結(jié)合，才能實(shí)現(xiàn)雙抗體夾心方法檢測靶標(biāo)的目的。因此，我們將制備的多株抗體按照兩兩組合的方式分別與CP-AuNP結(jié)合和直接噴在NC膜的T線位置，晾干后組裝試紙條。通過驗(yàn)證不同配對抗體試紙條的靈敏度和特異性情況，選擇最佳配對抗體。

1.3.4CP-AuNP試紙條的靈敏度和特異性驗(yàn)證

靈敏度驗(yàn)證：將新鮮培養(yǎng)的野生型副溶血性弧菌，用3%氯化鈉堿性蛋白胨水梯度稀釋成不同濃度，分別取100 μL，用CP-AuNP試紙條進(jìn)行測試，并用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

特異性驗(yàn)證：對實(shí)驗(yàn)室保藏的12株副溶血性弧菌(10株野生型菌株和2株標(biāo)準(zhǔn)菌株)和14株常見的其它食源性致病菌(見表1)驗(yàn)證CP-AuNP試紙條的特異性。

1.3.5CP-AuNP試紙條實(shí)際檢測海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌

對5種海產(chǎn)品(梅子魚、鮮蝦、蟶子、花蛤、白蛤)進(jìn)行副溶血性弧菌檢測。具體處理方法為：按國標(biāo)(GB4789.7-2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》)中的培養(yǎng)方法，每一種樣品稱取25 g培養(yǎng)于225 mL 3% 氯化鈉堿性蛋白胨水中，在37 ℃，150 r/min培養(yǎng)18 h后進(jìn)行試紙條檢測，同時(shí)進(jìn)行PCR驗(yàn)證(以tlh基因?yàn)榘袠?biāo)，參考文獻(xiàn)中報(bào)道的引物序列[37]：F：5’-AAAGCGGATTATGCAGAAGCAC-TG-3’， R：5’-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3’。反應(yīng)體系為：10 μL 2×Taq Master Mix，1 μL模板，7 μL 去離子水，正反引物各1 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min(30 個(gè)循環(huán))；72 ℃ 7 min。目標(biāo)片段大小為450 bp)。另外，對上述樣品檢測結(jié)果陰性的樣品進(jìn)行人為添加低濃度的野生型副溶血性弧菌，在37 ℃，150r/min培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h和7 h時(shí)取增菌液處理后進(jìn)行試紙條檢測。

表1 交叉反應(yīng)結(jié)果

2 結(jié)果與討論

2.1 副溶血性弧菌單克隆抗體性能

以野生型副溶血性弧菌為免疫原，最終獲得3株單克隆抗體: 1A、2E、4G。通過抗體亞型鑒定，1A為IgG1亞類，2E、4G為IgG3亞類?？贵w效價(jià)檢測結(jié)果： 1A (2.381 mg/mL)效價(jià)為1∶8 000, 2E (7.862 mg/mL)效價(jià)為1∶128 000, 4G (3.872 mg/mL)效價(jià)為1∶64 000。本實(shí)驗(yàn)也同時(shí)用副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 17802、ATCC 33847)作為免疫原，但未能獲得性能較好的抗體。

2.2 CP-AuNP納米顆粒的表征

金納米粒子的尺寸和形狀對試紙條的靈敏度和穩(wěn)定性非常重要。TEM結(jié)果顯示(圖2a和b)，合成的膠體金納米粒子(金種子)呈相對均勻的球體，而CP-AuNP為圓柱體；通過紫外吸收光譜檢測(圖2c)，金種子的最大吸收峰為526 nm，CP-AuNP吸收峰在523 nm～538 nm之間。與AuNP相比，CP-AuNP具納米顆粒的尺寸更大。更大的尺寸可能會降低抗體結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)，結(jié)合更多的抗體，從而提高檢測靈敏度。

(a) AuNPs的TEM圖，(b) CP-AuNPs的TEM圖，(c) AuNP和CP-AuNP的UV-Vis光譜圖。圖2 AuNPs與CP-AuNPs的表征

2.3 CP-AuNP標(biāo)記抗體條件優(yōu)化和最佳抗體配對情況

經(jīng)方法1.3.2的優(yōu)化，最終得到CP-AuNP標(biāo)記抗體的最佳pH為8.3(3 μL 0.2 M K2CO3/mL CP-AuNP溶液)、抗體的最佳濃度為45 μg/mL。通過方法1.3.3的優(yōu)化，得到最佳的檢測抗體為2E，最佳捕獲抗體為4G。

2.4 CP-AuNP試紙條的靈敏度、特異性和交叉反應(yīng)結(jié)果

2.4.1靈敏度

在本研究中，為了測試試紙條的靈敏度，采用不同濃度梯度的菌懸液(105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL和101CFU/mL)，以3%氯化鈉蛋白胨水培養(yǎng)基為空白對照，分別取100 μL上樣于試紙條。結(jié)果如圖3所示。該CP-AuNP試紙條檢測副溶血性弧菌的檢測限為4.77×103CFU/mL，高于傳統(tǒng)膠體金試紙條檢測限(105-7CFU/mL)[38]，表明CP-AuNP作為標(biāo)記探針可以提高檢測靈敏度。

圖3 靈敏度測定

2.4.2特異性和交叉反應(yīng)結(jié)果

由圖4顯示，本方法可以檢出實(shí)驗(yàn)室保藏的6株野生型菌株(共10株)，但未檢出副溶血型弧菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 17802和ATCC 33847)。可能原因是標(biāo)準(zhǔn)菌株在低溫冷凍保存過程中導(dǎo)致?lián)p傷，使其抗原表位結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而無法和抗體進(jìn)行結(jié)合；而且副溶血性弧菌受環(huán)境等因素的影響易發(fā)生突變，也是導(dǎo)致抗體和抗原不能結(jié)合的原因之一[39-41]。為了驗(yàn)證試紙條的交叉反應(yīng)情況，選擇了常見的14株病原微生物進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表1，表明該試紙條的特異性較強(qiáng)，與常見病原微生物無交叉反應(yīng)。

圖4 12株副溶血性弧菌CP-AuNP試紙條檢測結(jié)果(注:空白為3%氯化鈉堿性蛋白胨水)。

2.5 CP-AuNP試紙條在實(shí)際樣品檢測中的應(yīng)用

為考察海產(chǎn)品中副溶血性弧菌原始污染的情況，本實(shí)驗(yàn)對5種海產(chǎn)品(梅子魚、鮮蝦、蟶子、花蛤和白蛤)取樣25 g，按照國標(biāo)方法進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后對增菌液同時(shí)進(jìn)行CP-AuNP試紙條和PCR檢測。由圖5結(jié)果顯示，經(jīng)18 h增菌后，本方法在蟶子和花蛤樣品中檢出副溶血性弧菌，和PCR方法結(jié)果一致。說明本方法檢測準(zhǔn)確度高。梅子魚、鮮蝦和白蛤樣品經(jīng)過培養(yǎng)后沒有檢出副溶血性弧菌，表明這三種樣品沒有被污染副溶血性弧菌，結(jié)果也同PCR檢測結(jié)果一致。

圖5 試紙條在海產(chǎn)品中的應(yīng)用

另一方面，考慮到國標(biāo)方法中檢測周期長，不適用于快速監(jiān)測海產(chǎn)品污染狀況。因此，在上述增菌后沒有檢出的樣品中(梅子魚、鮮蝦和白蛤)通過人為添加低濃度(1 CFU/mL)的副溶血性弧菌，經(jīng)3%氯化鈉堿性蛋白胨水中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h和7 h時(shí)取增菌液經(jīng)行試紙條檢測。結(jié)果表明(圖6)，在增菌4 h后，均可在三種樣品中檢出副溶血性弧菌，相比于國標(biāo)方法，本方法大大縮短了檢測周期。

圖6 人工污染海產(chǎn)品試紙條檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本研究以野生型副溶血性弧菌為免疫原，共獲得3株單克隆抗體。并通過一步還原法和介導(dǎo)生長法制備了CP-AuNP標(biāo)記探針，優(yōu)化CP-AuNP標(biāo)記條件和試紙條最佳抗體配對組合后，并構(gòu)建了基于雙抗體夾心原理的CP-AuNP試紙條檢測海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的快速可視化方法。該方法，能檢出6株野生型副溶血性弧菌，檢出限為4.77×103CFU/mL，高于傳統(tǒng)膠體金試紙條檢測限(105-7CFU/mL)，與常見的食源性致病菌無交叉反應(yīng)。在實(shí)際樣品檢測中，對5種海產(chǎn)品直接增菌培養(yǎng)18 h后在蟶子和花蛤中檢出了副溶血性弧菌，表明這兩種海產(chǎn)品存在副溶血性弧菌污染風(fēng)險(xiǎn)，檢測結(jié)果與PCR結(jié)果一致；在未存在原始污染的其余三份樣品，通過人工污染，按國標(biāo)方法增菌培養(yǎng)4 h后即可檢出副溶血性弧菌，極大的縮短了檢測周期。表明該方法可應(yīng)用于海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測，是一種高靈敏度、高特異性、準(zhǔn)確、有效、快速可視化的診斷工具。