劉 芳，劉偉存，彭延波

1.唐山市豐潤區(qū)人民醫(yī)院,河北064000；2.唐山工人醫(yī)院；3.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院

抑郁癥作為一種情感障礙類精神疾病，生理、心理、社會(huì)環(huán)境等多種因素均可誘發(fā)，發(fā)病率逐年增高，治愈率低，復(fù)發(fā)率高，病人多伴有自殺傾向。據(jù)報(bào)道，全球范圍內(nèi)抑郁癥發(fā)病率約為3%，其中30%病人出現(xiàn)過自殺行為，約10%的病人自殺身亡[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，海馬結(jié)構(gòu)的異常和病變嚴(yán)重影響了抑郁癥的發(fā)展進(jìn)程。臨床觀察顯示，同正常人比較，抑郁癥病人的海馬體積較小，并且神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)萎縮、丟失；除此之外，在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元出現(xiàn)變性、凋亡和壞死的情況。因此，海馬區(qū)神經(jīng)元的異?？赡苁且钟舭Y形成、發(fā)展的重要病理學(xué)基礎(chǔ)。海馬在神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性、學(xué)習(xí)/記憶以及情感等高級認(rèn)知功能中發(fā)揮重要作用。法舒地爾是一種Rho 激酶（Rho kinase,ROCK）抑制劑，主要應(yīng)用于臨床研究。其主要作用有擴(kuò)張血管，抑制炎細(xì)胞的浸潤和炎性介質(zhì)的釋放，促進(jìn)一氧化氮的形成，抑制纖維化形成，改善組織重構(gòu)[3-5]。近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)，銀杏酮酯和法舒地爾聯(lián)合應(yīng)用，能夠有效緩解腦卒中后焦慮、抑郁障礙[6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示，法舒地爾能夠有效抑制慢性束縛應(yīng)激導(dǎo)致的抑郁樣行為，避免大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞樹突的減少。因此，本研究擬通過慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激（chronic unexpected mild stress，CUMS）法構(gòu)建大鼠抑郁模型，觀察其抑郁樣行為的表現(xiàn)和海馬區(qū)神經(jīng)組織學(xué)改變，并予以法舒地爾預(yù)處理，以研究海馬神經(jīng)組織學(xué)改變與抑郁樣行為的關(guān)系和法舒地爾拮抗抑郁的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物與主要儀器 5 周齡大鼠購于北京華阜康生物科技有限公司（SCXK 京2009?0004）的SPF 級雌性SD 大鼠30 只，體重140～160 g；規(guī)格為2 mL/30 mg 的鹽酸法舒地爾注射液（天津紅日藥業(yè)股份有限公司）；曠場反應(yīng)箱和數(shù)據(jù)自動(dòng)采集及處理系統(tǒng)（安來軟件科技有限公司）；Morris 水迷宮及視頻分析系統(tǒng)，購自北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司。鹽酸法舒地爾注射液（規(guī)格：2 mL，每支30 mg，天津紅日藥業(yè)股份有限公司）；曠場反應(yīng)箱和數(shù)據(jù)自動(dòng)采集及處理系統(tǒng)為安來軟件科技有限公司產(chǎn)品；Morris 水迷宮及視頻分析系統(tǒng)，購自北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 CUMS 動(dòng)物模型制備 5 周齡雌性SD 大鼠30 只適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為CUMS 模型組、法舒地爾干預(yù)組和對照組，每組10 只。CUMS 模型組：每天接受以下11 種應(yīng)激中的1 種刺激：潮濕墊料24 h；行為束縛24 h；鼠籠45°傾斜放置24 h；禁水或禁食24 h；4 ℃冰水或42 ℃熱水游泳5 min；電擊雙耳（0.8 mA）2 次，每次5 s；夾鼠尾持續(xù)1 min；晃動(dòng)鼠籠持續(xù)15 min；照明持續(xù)24 h。同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，共計(jì)2 輪22 d；并在CUMS 前4 d 開始，腹腔注射生理鹽水0.2 mL/d，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束（第22 天）。法舒地爾干預(yù)組：在CUMS 前4 d開始，每天腹腔注射法舒地爾0.2 mL（30 mg/kg），持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束（第22 天）。對照組：每天抓取1 次處理，在CUMS 前4 d 開始，腹腔注射生理鹽水0.2 mL/d，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束（第22 天）。

1.3 效果觀察

1.3.1 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 各組大鼠實(shí)行禁食和禁水24 h，所有大鼠均單獨(dú)飼養(yǎng)，每籠放置同樣的飲水瓶2 個(gè)，一個(gè)瓶中盛濃度為1%蔗糖水，另一個(gè)盛純凈水，每瓶200 mL，檢測1 h 內(nèi)糖水/純凈水消耗。

1.3.2 曠場試驗(yàn) 曠場試驗(yàn)分析系統(tǒng)主要是通過觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新異環(huán)境中的自主行為，進(jìn)而探究動(dòng)物的行為與緊張度。所有大鼠均先安置在曠場中心部位，以便進(jìn)一步觀察記錄大鼠的行進(jìn)距離（m）、中央格活動(dòng)時(shí)間（s）、站立次數(shù)和修飾行為（次數(shù)）。

1.3.3 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris 水迷宮是一個(gè)規(guī)格為170 cm×50 cm 的圓形水池，其壁內(nèi)為黑色，內(nèi)設(shè)直徑12 cm，高29 cm 的安全島，圓形水池周圍環(huán)繞2 m的遮光布簾。每次實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)環(huán)境2 h，將安全島加水至線上10 cm，并隨機(jī)放置于水迷宮中4 個(gè)象限中的任何一個(gè)，溫度控制在22～25 ℃。每日固定時(shí)間、每只大鼠從不同象限進(jìn)行游泳訓(xùn)練，120 s 內(nèi)沒有找到安全島，將其放在平臺(tái)上停留10 s，然后進(jìn)行下次訓(xùn)練，連續(xù)訓(xùn)練4 d，以大鼠均能夠在大致相同時(shí)間內(nèi)找到安全島視為訓(xùn)練成功。在造模前后連續(xù)測試3 d，每天測試6 次，記錄其下水后找到平臺(tái)的時(shí)間（s），即逃避潛伏期，取3 d 的測試成績作為其空間記憶成績。并記錄大鼠在水迷宮中行走總路程。

1.3.4 海馬區(qū)神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，通過腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，剪開腹部，暴露心臟。通過將加滿生理鹽水的灌注針自左心室插入主動(dòng)脈，同時(shí)剪開右心耳，進(jìn)行左心體循環(huán)灌注，在灌注150 mL生理鹽水的基礎(chǔ)上，再向其中灌注4%多聚甲醛150 mL進(jìn)行內(nèi)固定。冠狀面取材，將小腦切下，自視交叉后間隔1 mm 連續(xù)取材，固定于4%多聚甲醛中。常規(guī)石蠟包埋，8 μm 連續(xù)切片。HE 染色，中性樹膠封片，光鏡觀察海馬組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。3 組間采用單因素方差分析，LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 法舒地爾對CUMS 大鼠糖水偏好行為的影響 CUMS 后，CUMS 模型組大鼠的糖水消耗量、糖水偏好率均低于對照組（P＜0.05），而法舒地爾干預(yù)組大鼠的糖水消耗量、糖水偏好率均高于CUMS 模型組（P＜0.05），見表1。

表1 CUMS 應(yīng)激前后3 組大鼠純凈水消耗量、糖水消耗量、糖水偏好率比較

2.2 法舒地爾對CUMS 大鼠曠場試驗(yàn)行為的影響 CUMS 前，對3 組大鼠進(jìn)行曠場試驗(yàn)基線水平測定，各組大鼠在行進(jìn)距離、中央格活動(dòng)時(shí)間、站立次數(shù)和修飾行為比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CUMS 后，CUMS 組大鼠的行進(jìn)距離、中央格活動(dòng)時(shí)間、站立次數(shù)、修飾行為均低于對照組（P＜0.05），法舒地爾干預(yù)組大鼠的行進(jìn)距離、中央格活動(dòng)時(shí)間、站立次數(shù)、修飾行為均高于CUMS 組（P＜0.05）。見表2。

表2 CUMS 前后大鼠曠場試驗(yàn)結(jié)果

2.3 法舒地爾對CUMS 大鼠水迷宮行為的影響 水迷宮結(jié)果顯示，CUMS 前3 組逃避潛伏期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CUMS 后，CUMS 模型組大鼠的逃避潛伏期較對照組延長（P＜0.05），而法舒地爾干預(yù)組的逃避潛伏期較CUMS 模型組縮短（P＜0.05），與對照組接近。見表3。圖1 示法舒地爾對大鼠水迷宮中行走總路程的影響，與對照組比較，CUMS模型組大鼠的平均行走總路程明顯延長（P＜0.05），而法舒地爾干預(yù)組大鼠的平均行走總路程與對照組相似，較CUMS 模型組明顯縮短（P＜0.05）。

表3 法舒地爾對CUMS 大鼠水迷宮逃避潛伏期的影響 單位：s

2.4 法舒地爾對CUMS 模型海馬區(qū)神經(jīng)形態(tài)學(xué)的影響 如圖2 所示，對照組海馬區(qū)域細(xì)胞排列整齊，密度較大，錐體細(xì)胞層數(shù)較多，胞體豐滿含較多突起。CUMS 組細(xì)胞排列不齊、疏松，錐體細(xì)胞層數(shù)變少，細(xì)胞收縮，突起減少。法舒地爾干預(yù)組海馬區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞較CUMS 組有所改善。

圖1 法舒地爾對大鼠水迷宮中行走總路程的影響

圖2 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)形態(tài)學(xué)變化（HE 染色）

3 討論

大鼠抑郁模型的造模方法主要包括環(huán)境刺激（CUMS、懸尾試驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳等）、社會(huì)刺激（母仔分離、孤養(yǎng)模型）、藥物誘導(dǎo)（地塞米松、糖皮質(zhì)激素、利血平、精神興奮劑戒斷模型、育亨賓、5-羥色胺酸和苯丙胺等）、手術(shù)制備（嗅球切除、脊髓橫斷、腦卒中后抑郁模型）、產(chǎn)后抑郁模型等。其中藥物誘導(dǎo)、手術(shù)制備、產(chǎn)后抑郁屬于有明顯的誘導(dǎo)因素，其抑郁形成機(jī)制較為簡單，適合進(jìn)行抗抑郁藥物的篩選，或?qū)儆谔囟ǖ囊钟裟Ｐ?。然而，抑郁與應(yīng)激關(guān)系密切，CUMS 因能夠模仿人類抑郁行為而被廣泛應(yīng)用。模型中的應(yīng)激因子多具有不可預(yù)見性和多變性，同時(shí)沒有一種應(yīng)激條件是抑郁行為的決定因素，在刺激因素、發(fā)生機(jī)制和抑郁樣表現(xiàn)方面，與人類實(shí)際生活中的長期低水平慢性應(yīng)激事件較為相符[7-9]。本研究采用了CUMS 大鼠抑郁模型，結(jié)果顯示，采用CUMS 的20 只大鼠無死亡，經(jīng)糖水消耗實(shí)驗(yàn)、曠場試驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)表明，均伴有不同程度的抑郁樣行為，證明大鼠造模成功。本研究觀察到，CUMS 模型組大鼠糖水消耗量顯著減少，提示對獎(jiǎng)賞反應(yīng)性下降，快感缺失；曠場試驗(yàn)中CUMS 大鼠的行進(jìn)距離、中央格活動(dòng)時(shí)間、站立次數(shù)和修飾行為均較對照組明顯減少，這些低探索行為反映了大鼠的抑郁情緒[10-13]。海 馬 結(jié) 構(gòu) 包 括 海 馬 回（CA1、CA2、CA3 和CA4，主要由錐體神經(jīng)元）、齒狀回（顆粒神經(jīng)元）、腦小角等部位組成，位于內(nèi)側(cè)額葉的皮質(zhì)表層底部，是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，在神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性、學(xué)習(xí)/記憶以及情感等高級認(rèn)知功能方面起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。臨床研究顯示，抑郁病人的杏仁核、海馬體積較正常人小，同時(shí)病程與海馬體積呈負(fù)相關(guān)[14]。重度抑郁癥病人海馬齒狀回神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)數(shù)目減少，增殖性指標(biāo)Ki-67 陽性數(shù)目減少，提示伴有神經(jīng)細(xì)胞的增殖受限[15]。提示抑郁癥發(fā)生與海馬神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)受損、數(shù)目減少、再生障礙關(guān)系密切。本研究結(jié)果表明，CUMS 模型組大鼠逃避潛伏期延長，學(xué)習(xí)記憶能力下降，提示可能與海馬結(jié)構(gòu)異常有關(guān)。本研究結(jié)果也顯示，對照組海馬區(qū)域細(xì)胞排列整齊，密度較大，錐體細(xì)胞層數(shù)較多，胞體豐滿含較多突起。而CUMS 模型組細(xì)胞排列不齊、疏松，錐體細(xì)胞層數(shù)變少，細(xì)胞收縮，突起減少。說明CUMS 所導(dǎo)致的海馬神經(jīng)結(jié)構(gòu)異?？赡苁瞧湟钟魳有袨榈闹匾±韺W(xué)基礎(chǔ)之一。

4 小結(jié)

CUMS 大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，表現(xiàn)在糖水消耗量減少,行進(jìn)距離、中央格活動(dòng)時(shí)間、站立次數(shù)和修飾行為均較對照組明顯減少，逃避潛伏期延長，學(xué)習(xí)記憶能力下降。CUMS 大鼠海馬區(qū)細(xì)胞發(fā)生病理改變，給予CUMS 大鼠法舒地爾處理，能夠改善海馬區(qū)細(xì)胞發(fā)生病理改變，減輕CUMS 大鼠的抑郁樣行為。