鄭俊青，黎瑞源，鄭 冉，呂 丹，陳其皎，石桃雄，*，陳慶富

(貴州師范大學 a. 蕎麥產(chǎn)業(yè)技術研究中心；b. 生命科學學院；c. 貴州省信息與計算科學重點實驗室，貴州 貴陽 550001)

苦蕎屬于蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(FagopyrumMill)植物，又名韃靼蕎麥(tartary buckwheat)，其種植區(qū)域在我國主要分布在云南、四川、貴州、陜西、山西、甘肅和寧夏，我國的種植面積和產(chǎn)量均居世界第一[1]?？嗍w作為自然界藥食兩用的作物，集生物類黃酮、微量元素和礦物質、淀粉、維生素、纖維素、脂肪和蛋白質于一身[2]?？嗍w種子中的蛋白質含量是評價其營養(yǎng)品質的重要指標[3]?？嗍w種子蛋白質是苦蕎籽粒中主要的生物活性物質，具有抗菌、抗腫瘤、降血壓、抑制絲氨酸蛋白酶等生理活性，是一種理想的健康食品原料[4]。研究資料表明，苦蕎和甜蕎種子蛋白中含有的人體必需氨基酸齊全，且配比合理，是一種全價蛋白，具有較高的營養(yǎng)價值[5-6]。

種子成熟過程中合成并貯存大量的貯藏蛋白質，一般占種子總蛋白含量的80%左右[7]。Osborne[8]提取出種子貯藏蛋白質，并按照溶解性的不同將其分為清蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)、醇溶蛋白(gliadin)和谷蛋白(gluten)4類。蕎麥蛋白組分含量表現(xiàn)為較高含量的清蛋白和谷蛋白，較低含量的球蛋白和醇溶蛋白[9-11]，不同于谷類作物小麥、水稻和玉米的蛋白組分含量(醇溶蛋白和谷蛋白含量高于清蛋白和球蛋白含量)[12-18]，與豆類作物蠶豆、綠豆蛋白組分含量(清蛋白含量較高)相近[19-22]。在食品加工方面，清蛋白和球蛋白可溶性強，富含賴氨酸，營養(yǎng)價值比較高，主要影響籽粒的營養(yǎng)品質，對加工品質的影響甚微[23-25]；醇溶蛋白主要影響面團的黏著性、延伸性[26]，影響蕎麥的加工品質；谷蛋白主要決定面團的彈性[27]，對蕎麥加工品質起決定性作用。與小麥和玉米等作物相比，苦蕎的醇溶蛋白含量低，在制作發(fā)酵類主食時，不利于饅頭或其他類面筋的形成[2]。郭榮榮[28]研究表明，甜蕎谷蛋白對火腿腸的色澤具有顯著影響，清蛋白影響火腿腸的凝膠強度，添加清蛋白和谷蛋白可以改善火腿腸的彈性和內(nèi)聚性。在醫(yī)療保健方面，小麥、大麥等谷物中的醇溶蛋白是誘發(fā)乳糜瀉腸道疾病的主要原因，蕎麥的醇溶蛋白含量低，致病性低，是腹腔患者可以信賴和推崇的安全食物[29-31]。張超等[32]研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎球蛋白抗疲勞效果顯著。左光明等[33]的研究表明，苦蕎清蛋白降血脂和體內(nèi)抗氧化功能較強。

苦蕎粒形包括粒長、粒寬和長寬比等性狀，是苦蕎(米)外觀品質性狀的重要表現(xiàn)形式，同時也是決定粒重進而影響苦蕎產(chǎn)量的重要因素。目前關于苦蕎蛋白組分含量與粒重和籽粒性狀相關性的研究報道較少。朱新產(chǎn)等[34]研究3個甜蕎品種和3個苦蕎品種發(fā)現(xiàn)，大粒蕎麥(千粒重30～35 g)粗蛋白含量顯著高于小粒蕎麥(千粒重25～30 g)，說明千粒重影響營養(yǎng)品質。本研究以晉蕎麥2號與小米蕎雜交衍生獲得的苦蕎重組自交系(XJ-RILs)群體為試驗材料，調(diào)查了該群體220個株系的粒形性狀和蛋白組分含量的遺傳變異，分析了籽粒性狀和蛋白組分含量的相關性，篩選出各蛋白組分含量和總蛋白含量極端株系，為不同食品和保健品的加工需求提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以小米蕎為母本，晉蕎麥2號為父本，雜交衍生的重組自交系(XJ-RILs)群體220份F7:8株系為試驗材料。小米蕎是云南地方品種，薄殼，易脫殼，晚熟，適應性差，產(chǎn)量低；晉蕎麥2號是山西省選育的高產(chǎn)優(yōu)質品種，厚殼、不易脫殼，早熟，適應性強，產(chǎn)量高[35]。

1.2 田間種植

試驗于2018年8月在貴州省貴陽市百宜鎮(zhèn)試驗基地進行，采用完全隨機區(qū)組設計，包含3次重復，小區(qū)面積為2 m2，3行區(qū)種植，常規(guī)田間管理。

1.3 粒重和粒形測定

千粒重、粒長、粒寬和長寬比用SC-A型考種分析測定儀(杭州萬深檢測科技有限公司)進行測定。

1.4 蛋白提取

蕎麥種子蛋白組分的提取采用順序提取法。稱取蕎麥粉末0.500 g置于5 mL離心管中，先用0.01 mol·L-1Tris-HCl溶液(pH=7.5)提取清蛋白，再用0.01 mol·L-1Tris-HCl(pH=7.5)和0.5 mol·L-1NaCl混合溶液提取球蛋白；重新稱取蕎麥粉末0.500 g置于5 mL離心管中，先用60%正丙醇溶液提取醇溶蛋白，再用0.5%酒石酸鈉、0.24%硫酸銅、1.68%氫氧化鉀和50%正丙醇混合溶液提取谷蛋白。具體的提取步驟參考張啟迪等[36]的方法。

1.5 清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和總蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍G-250染色法測定苦蕎種子中各蛋白組分含量?？偟鞍缀拷茷?種蛋白組分含量之和。

1.6 數(shù)據(jù)處理

苦蕎XJ-RILs群體各性狀的平均值、最大值、最小值、峰度、偏度、變異系數(shù)等描述統(tǒng)計量采用Excel 2016進行分析，用SPSS 24.0進行親本間各性狀的方差分析、XJ-RILs群體各性狀的簡單相關性分析、類群間的方差分析(F檢驗)、多重比較(Duncan法)。分別用R3.2.2統(tǒng)計軟件(https://www.R-project.org/)的scale、dist和hclust函數(shù)完成群體各性狀的標準化和中心化、基于歐氏距離的相似性矩陣構建和基于離差平方和法(Ward)的聚類分析。

2 結果與分析

2.1 苦蕎XJ-RILs群體粒形與蛋白組分含量變異

親本間各調(diào)查性狀的方差分析(表1)表明，父本晉蕎麥2號千粒重、粒長、粒寬、長寬比、清蛋白、球蛋白、谷蛋白和總蛋白含量均顯著(P<0.05)高于母本小米蕎；雙親間醇溶蛋白含量無顯著性差異(P>0.05)。雙親蛋白組分含量高低清蛋白>谷蛋白>球蛋白>醇溶蛋白。

苦蕎XJ-RILs群體粒形性狀中，千粒重變幅為11.88～26.73 g，平均值為18.17 g；粒長變幅為4.05～5.73 mm，平均值為4.87 mm；粒寬變幅為2.78～3.64 mm，平均值為3.14 mm；長寬比變幅為1.27～1.90，平均值為1.57。千粒重的變異系數(shù)最大，為17.13%；其次是長寬比和粒長，分別為10.62%和9.03%；粒寬的變異系數(shù)最小，為5.79%。

苦蕎XJ-RILs群體蛋白組分中，總蛋白含量變幅為44.61～114.20 mg·g-1，平均值為75.90 mg·g-1；清蛋白含量變幅為10.29～56.39 mg·g-1，平均值為34.10 mg·g-1；球蛋白含量變幅為5.68～13.48 mg·g-1，平均值為10.84 mg·g-1；醇溶蛋白含量變幅為2.51～7.42 mg·g-1，平均值為4.95 mg·g-1；谷蛋白含量變幅為7.83～47.20 mg·g-1，平均值為26.01 mg·g-1。谷蛋白含量變異系數(shù)最大，為29.97%；其次是清蛋白含量和醇溶蛋白含量，分別為24.03%和20.15%；再次是球蛋白含量，為16.07%；總蛋白含量變異系數(shù)最小，為15.30%。

粒長和長寬比的峰度絕對值均大于1，呈現(xiàn)近似的正態(tài)分布；其他7個性狀的偏度和峰度絕對值均小于1，符合正態(tài)分布。各性狀均存在明顯的雙向超親分離現(xiàn)象(圖1，表1)。

2.2 苦蕎XJ-RILs群體種子蛋白組分含量的基因型差異

苦蕎XJ-RILs群體種子蛋白組分含量存在明顯基因型差異，按照種子蛋白組分含量高低順序分為5種類型(表2)。其中，有160個株系(72.73%)和親本一致，各蛋白組分含量高低為清蛋白含量>谷蛋白含量>球蛋白含量>醇溶蛋白含量，谷蛋白含量的變異系數(shù)最大(27.65%)，總蛋白含量的變異系數(shù)最小(14.94%)；53個株系(24.09%)的谷蛋白含量>清蛋白含量>球蛋白含量>醇溶蛋白含量，其中醇溶蛋白含量的變異系數(shù)最大(23.03%)，總蛋白含量的變異系數(shù)最小(14.10%)；4個株系(1.82%)的清蛋白含量>球蛋白含量>谷蛋白含量>醇溶蛋白含量；2個株系的谷蛋白含量>清蛋白含量>醇溶蛋白含量>球蛋白含量；還有1個株系的清蛋白含量>谷蛋白含量>醇溶蛋白含量>球蛋白含量。

表1 苦蕎XJ-RILs群體粒重、粒形與蛋白組分含量變異

2.3 苦蕎XJ-RILs群體粒形與蛋白組分含量簡單相關性分析

各性狀的簡單相關性分析表明(表3)，千粒重與粒長、粒寬，以及球蛋白、谷蛋白和總蛋白含量呈極顯著(P<0.01)正相關，與清蛋白呈顯著(P<0.05)正相關，與醇溶蛋白呈極顯著(P<0.01)負相關；粒長與長寬比、谷蛋白含量呈極顯著(P<0.01)正相關，與總蛋白含量呈顯著(P<0.05)正相關，與醇溶蛋白含量呈極顯著(P<0.01)負相關；粒寬與球蛋白、總蛋白含量呈極顯著(P<0.01)正相關，與長寬比呈極顯著(P<0.01)負相關；長寬比與醇溶蛋白含量呈極顯著(P<0.01)負相關，與谷蛋白呈顯著(P<0.05)正相關。清蛋白、球蛋白和谷蛋白均與總蛋白呈極顯著(P<0.01)正相關；谷蛋白與球蛋白呈顯著(P<0.05)正相關，與醇溶蛋白呈顯著(P<0.05)負相關。

2.4 苦蕎XJ-RILs群體粒形與蛋白組分含量聚類分析

基于調(diào)查性狀的表型值對苦蕎XJ-RILs群體進行聚類分析。結果顯示，在歐氏距離為12.10～13.50處，可將220個株系劃分為12個類群(圖2)。類群間各性狀的方差分析(表4)表明，C7、C8、C10、C11和C12類群的千粒重顯著(P<0.05)高于其他7個類群，均值分別為19.83、20.90、21.11、20.81、20.01 g；C9、C11和C12類群的粒長顯著(P<0.05)高于其他9個類群，均值分別為5.36、5.42、5.39 mm；C8類群的粒寬顯著(P<0.05)高于其他11個類群，均值為3.45 mm；C4、C9、C11和C12類群的長寬比顯著(P<0.05)高于其他8個類群，均值為1.72、1.75、1.75和1.75；C7和C9類群的清蛋白含量顯著(P<0.05)高于其他10個類群，均值分別為45.70 mg·g-1和42.59 mg·g-1；C3、C8、C10和C11類群的球蛋白含量顯著(P<0.05)高于其他8個類群，均值分別為11.71、11.81、11.58、12.08 mg·g-1；C2、C3、C5、C6、C8和C11類群的醇溶蛋白含量顯著(P<0.05)高于其他6個類群，均值分別為5.86、5.31、5.76、5.46、5.42、5.74 mg·g-1；C6和C10類群的谷蛋白含量顯著(P<0.05)高于其他10個類群，均值分別為35.11 mg·g-1和37.10 mg·g-1；C6、C9和C10類群的總蛋白含量顯著(P<0.05)高于其他9個類群，均值分別為88.87、89.31、85.74 mg·g-1。

白色箭頭代表小米蕎；黑色箭頭代表晉蕎麥2號。White arrows indicated the value of Xiaomiqiao; Dark arrows indicated the value of Jinqiaomai 2.圖1 苦蕎XJ-RILs群體粒重、粒形與蛋白組分含量頻率分布Fig.1 Frequency distribution of grain weight， grain shape and protein content and component in the XJ-RILs population of tartary buckwheat

表2 苦蕎XJ-RILs群體蛋白組分含量差異

表3 苦蕎XJ-RILs群體粒重、粒形與蛋白組分含量簡單相關系數(shù)

C9類群的28個株系的長寬比和總蛋白含量最高，均值分別為1.75和89.31 mg·g-1，粒長和清蛋白含量均較高，均值分別為5.36 mm和42.59 mg·g-1；C10類群的13個株系千粒重和谷蛋白含量最高，均值分別為21.11 g和37.10 mg·g-1，球蛋白和總蛋白含量較高，均值分別為11.58 mg·g-1和85.74 mg·g-1；C11類群的10個株系粒長、長寬比和球蛋白含量最高，均值分別為5.42 mm、1.75和12.08 mg·g-1，千粒重和醇溶蛋白含量均較高，均值分別為20.81 g和5.74 mg·g-1。

3 結論與討論

遺傳參數(shù)中的變異系數(shù)可在一定程度上反映性狀的多樣性，變異系數(shù)越大，多樣性程度越高。一般情況下，變異系數(shù)大于10%，說明該性狀遺傳多樣性豐富[37]。本文苦蕎XJ-RILs群體千粒重的變異系數(shù)最大(17.13%)，接近該群體F5家系[38]和F6家系[39]的千粒重變異系數(shù)(分別為15.18%和15.90%)，高于翅米蕎×野苦蕎RILs群體百粒重變異系數(shù)(9.06%)[40]和苦蕎種質資源百粒重變異系數(shù)(13.67%)[41]，說明該群體千粒重變異較為豐富；長寬比變異系數(shù)次之，為10.62%，這與苦蕎種質資源長寬比變異系數(shù)(11.42%)[41]相近，低于翅米蕎×野苦蕎RILs群體長寬比的變異系數(shù)15.24%[40]?？嗍wXJ-RILs群體蛋白組分中，谷蛋白含量的變異系數(shù)最大，其次分別為清蛋白、醇溶蛋白和球蛋白，總蛋白變異系數(shù)最小，各蛋白組分均具有豐富的遺傳多樣性，有利于苦蕎不同蛋白組分含量株系的選育。除粒長和長寬比外，千粒重、粒寬和各蛋白組分含量均呈近似的正態(tài)分布，說明千粒重、粒寬和蛋白組分含量為多基因控制的數(shù)量性狀，而粒長、長寬比呈雙峰分布，說明可能存在控制該性狀的主效基因。

圖2 苦蕎XJ-RILs群體粒重、粒形與蛋白含量及其組分的聚類圖Fig.2 Dendrogram of XJ-RILs population in tartary buckwheat based grain weight， grain shape and protein content and components

表4 苦蕎XJ-RILs群體12個類群間粒重、粒形與蛋白組分含量的差異分析

續(xù)表4 Continued Table 4

苦蕎XJ-RILs群體蛋白組分含量的特點為較高含量的清蛋白和谷蛋白，較低含量的球蛋白和醇溶蛋白。220個株系中，有160個株系(72.73%)的蛋白組分含量為清蛋白>谷蛋白>球蛋白>醇溶蛋白，這與劉擁海等[3]研究的5個苦蕎品種結果一致。有2個株系的蛋白組分含量為谷蛋白>清蛋白>醇溶蛋白>球蛋白，這與汪燕等[10]研究的20個苦蕎品種結果一致。有1個株系的蛋白組分含量為清蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白>球蛋白，這與郭曉娜等[11]研究的苦蕎結果一致，表明該群體蛋白組分含量存在豐富的基因型差異，有利于優(yōu)異株系的篩選。

苦蕎XJ-RILs群體粒重與粒形性狀的相關性分析表明，千粒重與粒長呈極顯著正相關(r=0.567)，這與李春花等[42]對苦蕎的研究結果一致，也與水稻[43-45]和大麥[46]中的研究結果一致；千粒重與粒寬呈極顯著正相關(r=0.709)，表明粒寬對千粒重的影響更顯著。千粒重與球蛋白、谷蛋白、總蛋白呈極顯著正相關，與清蛋白呈顯著正相關，與醇溶蛋白呈極顯著負相關；粒長與谷蛋白呈極顯著正相關，與總蛋白呈顯著正相關，與醇溶蛋白呈極顯著負相關；粒寬與球蛋白、總蛋白呈極顯著正相關；長寬比與醇溶蛋白呈極顯著負相關，與谷蛋白呈顯著正相關。

基于苦蕎XJ-RILs群體調(diào)查性狀的表型值，將220個株系聚為12個類群，為了篩選得到粒形和蛋白組分極端株系和綜合性狀良好的株系，對類群間各性狀進行方差分析。結果表明，C7類群的12個株系和C9類群的28個株系是清蛋白極高端類群；C11類群的10個株系是球蛋白含量極高端類群。籽粒清蛋白和球蛋白含量極高端類群可為高營養(yǎng)品質蕎麥食品的加工和抗疲勞、降血脂、抗氧化保健品的加工提供重要材料。C2類群的12個株系、C5類群的10個株系和C11類群的10個株系是醇溶蛋白極高端類群；C12類群的28個株系是醇溶蛋白含量極低端類群。C6類群的17個株系和C10類群的13個株系是谷蛋白含量極高端類群；C5類群的10個株系是谷蛋白含量極低端類群。籽粒醇溶蛋白和谷蛋白極高端類群適合加工為蕎麥面條、饅頭和面包等，極低端類群可以作為腹腔疾病患者的安全食物。C6類群的17個株系和C9類群的28個株系是總蛋白含量極高端類群。C9類群的28個株系粒長、長寬比、清蛋白和總蛋白含量均較高；C10類群的13個株系千粒重、球蛋白、谷蛋白和總蛋白含量較高；C11類群的10個株系千粒重、粒長、長寬比、球蛋白和醇溶蛋白含量均較高，可作為千粒重、粒長、長寬比、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和總蛋白含量綜合性狀優(yōu)良株系，可為不同食品、保健品的加工需求提供材料。