呂 晨，張曉虎，張艷娜

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

0 引言

南五味子即木蘭科植物華中五味子(SchisandrasphenantheraRehd et Wils)，是一種益氣安神、斂肺生津的藥食兩用中藥材[1]。研究發(fā)現(xiàn)五味子中的木脂素、多酚、揮發(fā)油、多糖、黃酮等多種活性物質(zhì)均具有抑菌抗氧化及保鮮作用[2～7]。木脂素類化合物作為南五味子功效成分之一，已鑒定分離出五味子甲素、五味子酯甲、五味子醇甲、五味子乙素、五味子醇乙等150多種單體物質(zhì)，具有保肝護(hù)肝、延緩骨質(zhì)疏松、改善記憶力、降血脂等藥理作用[8～10]。

已有文獻(xiàn)表明木脂素具有抑菌保鮮作用[11]，而作為木脂素單體化合物之一的五味子酯甲，具有抗疲勞[12]、抗氧化[13]等作用，卻少有抑菌及保鮮作用研究報道。因此，筆者擬對商洛南五味子酯甲的提取、抑菌及復(fù)配保鮮液在番茄保鮮應(yīng)用予以研究，以期為南五味子酯甲抑菌及應(yīng)用于果蔬保鮮提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 主要有:

材料：南五味子果實(2019年8月購于商洛市商州區(qū)福鑫康藥業(yè))；當(dāng)日產(chǎn)新鮮番茄(購于商洛市商州區(qū)蔬菜市場)。

試劑：無水乙醇(分析純)、甲醇(色譜純)、生理鹽水、五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)品(購于江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司)、蒸餾水、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、殼聚糖、植酸、氯化鈣。

菌種：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌(購于北京華工科創(chuàng)生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2 主要儀器 SI-234型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SHP-80型生化培養(yǎng)箱，上海培因?qū)嶒瀮x器有限公司；FW-135型中草藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀器，島津(中國)有限公司；DHG9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 南五味子酯甲提取與測定 主要有:

(1)材料預(yù)處理。南五味子果實經(jīng)60℃恒溫干燥4h至恒重后用中草藥粉碎機(jī)粉碎過60目篩，置于干燥廣口瓶備用。

(2)五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。色譜條件：WondaSil-C18分析柱(250 mm×4.6 mm)、柱溫40℃、流動相：甲醇和水(75∶25)、波長254 nm、進(jìn)樣量10μL、流速1.0 mL·min-1。

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：用甲醇溶解精密稱取的10.0 mg五味子酯甲標(biāo)品于10 mL容量瓶定容并搖勻，得到1.0 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液備用。精密吸取五味子酯甲儲備液并用甲醇將其配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg·mL-1等5個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以甲醇為空白，采用高效液相色譜法制備五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。以五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，回歸方程為：Y = 117101X - 763.53，R2= 0.9997。

圖1 五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)曲線

(3)南五味子酯甲提取及測定。稱取0.5 g南五味子果實粉末于100 mL具塞管，在250 W、40 kHz超聲條件下，用不同乙醇濃度、液料比、超聲提取時間和超聲溫度提取完成后抽濾，所得濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過即得南五味子酯甲供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μL，檢測色譜峰面積后計算提取率[15]。

(4)單因素實驗。分別考察乙醇濃度(55%、65%、75%、85%、95%)、液料比(60、80、100、120、140 mL·g-1)、超聲提取時間(20、30、40、50、60 min)及超聲溫度(35、45、55、65、75℃)4個因素對南五味子酯甲提取率的影響。

(5)響應(yīng)面實驗設(shè)計。在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，以南五味子酯甲提取率為考察目標(biāo)，利用Design Expert8.0.6軟件對提取率影響較顯著因素進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面設(shè)計實驗，得出最佳優(yōu)化提取工藝參數(shù)，并進(jìn)行驗證實驗測評最佳提取工藝參數(shù)可靠性[16]。

1.2.2 抑菌性實驗 主要有:

(1)菌懸液的制備。將活化后的菌株用生理鹽水配制成1×108CFU·mL-1菌懸液，振蕩混勻備用。

(2)抑菌能力測試。采用濾紙擴(kuò)散法測定不同濃度南五味子酯甲對三種常見致病菌的抑菌能力，通過抑菌圈直徑判定抑菌能力強(qiáng)弱。將直徑6 mm濾紙片干熱(121℃，30 min)滅菌后冷卻備用。制備5個濃度梯度的南五味子酯甲(5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg·mL-1)溶液，將2mL菌懸液均勻涂布于平面固體培養(yǎng)基，并將備用濾紙片浸漬于不同濃度南五味子酯甲溶液中，用鑷子夾起1 min后輕貼于培養(yǎng)基表面，以浸漬無菌水的紙片為空白，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中12～48 h后觀察，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，3次平行試驗后取平均值[17,18]。

1.2.3 南五味子酯甲對番茄保鮮效果試驗 不同含量南五味子酯甲與殼聚糖、植酸、氯化鈣復(fù)配成表1配方進(jìn)行番茄保鮮實驗[19～21]。

表1 不同含量配方 (%)

選取市售無蟲害損壞、果型完整飽滿、大小均勻的當(dāng)日產(chǎn)新鮮番茄，用蒸餾水清洗果皮表面污物雜質(zhì)后分4組，浸泡在不同配方保鮮液中10 min后取出晾干，蒸餾水清洗組為空白對照，用保鮮膜密封(15℃、RH65%)存放，每3 d測定相關(guān)指標(biāo)[22]，3次平行實驗取平均值。相關(guān)考察指標(biāo)如下：

失重率(%)=(初始質(zhì)量-當(dāng)前質(zhì)量)/初始質(zhì)量×100%

可溶性固形物含量：手持糖量計法[22]。

VC含量：2,6-二氯靛酚法[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 南五味子酯甲提取結(jié)果分析

2.1.1 單因素實驗結(jié)果與分析 由圖2～圖5可知，4個單因素對南五味子酯甲提取率的影響皆呈先上升后降低的趨勢，在乙醇濃度75%、液料比100 mL·g-1、超聲溫度55℃、超聲提取時間50 min時提取率最高，且乙醇濃度、液料比、超聲溫度的影響較顯著。

圖2 乙醇濃度對南五味子酯甲提取率影響

圖3 液料比對南五味子酯甲提取率影響

圖4 超聲溫度對南五味子酯甲提取率影響

圖5 超聲提取時間對南五味子酯甲提取率影響

2.1.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析 主要有:

(1)響應(yīng)面實驗方案及數(shù)據(jù)分析。響應(yīng)面實驗方案與結(jié)果見表2。

用軟件分析數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析所得方程如下：

Y=0.24+0.011A+0.023B+0.014C+0.0065AB+0.00625AC+0.014BC-0.032A2-0.048B2-0.051C2

回歸模型方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面實驗方案與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

表3中相關(guān)系數(shù)R2、校正系數(shù)Adj R2及變異系數(shù)C.V.%可反應(yīng)回歸方程的可信度。其中Adj R2=0.9986，表明該回歸模型可以解釋99.86%的響應(yīng)值變化；變異系數(shù)C.V.%=0.97%，說明該實驗所得數(shù)據(jù)具有較高穩(wěn)定性。因此，可通過該方程優(yōu)化南五味子果實中五味子酯甲提取工藝。

回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表4。

表4 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果

表4可知，實驗所得回歸模型系數(shù)具有高度顯著性。表中一次項A、B、C、二次項A2、B2、C2及交互項BC的P值均小于0.0001，說明其對南五味子酯甲提取率的影響極顯著，而交互項AB、AC的P值皆小于0.05，表明其交互作用對南五味子酯甲提取率的影響顯著。由于模型P失擬項=0.8395 > 0.05，不顯著，表明擬合的回歸方程符合實際情況，能較好地反映真實的實驗值。因此，該模型可用于對南五味子酯甲提取率的分析和預(yù)測。

(2)響應(yīng)面分析。圖6中，乙醇濃度與液料比之間交互作用影響顯著。當(dāng)乙醇濃度一定，液料比達(dá)到100 mL·g-1時提取率最大；當(dāng)液料比一定，乙醇濃度為74%～76%時提取率最大。

圖7中，乙醇濃度與超聲溫度之間交互作用影響顯著。當(dāng)乙醇濃度一定，超聲溫度為54～56℃時提取率達(dá)到最大；當(dāng)超聲溫度一定，乙醇濃度為74%～76%時，提取率達(dá)到最大。

(a)等高線 (b)響應(yīng)曲面

(a)等高線 (b)響應(yīng)曲面圖7 乙醇濃度和超聲溫度對南五味子酯甲提取率的影響

(a)等高線 (b)響應(yīng)曲面圖8 液料比和超聲溫度對南五味子酯甲提取率的影響

圖8中，超聲溫度與液料比之間交互作用影響顯著。當(dāng)液料比一定，液料比達(dá)到54～56℃時提取率達(dá)到最大；當(dāng)超聲溫度一定，當(dāng)液料比為100 mL·g-1時，提取率達(dá)到最大。

綜上分析及模型預(yù)測得出在乙醇濃度76.07%、液料比102.62 mL·g-1、超聲溫度56.05℃的最佳提取工藝條件下，南五味子酯甲提取率的預(yù)測值為0.263%，為便于試驗操作，將最終條件確定為乙醇濃度75%、液料比100 mL·g-1、超聲溫度55℃，在此條件下進(jìn)行三次平行試驗得出提取率為0.273%，與預(yù)測值相差3.8%。

2.2 抑菌實驗結(jié)果分析

南五味子酯甲抑菌效果見表5。

表5 南五味子酯甲抑菌效果

由表5可知，南五味子酯甲對三種致病菌皆有抑菌效果，且抑菌效果隨著濃度的增大而增強(qiáng)，其抑菌效果順序為：枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>沙門氏菌。

2.3 番茄保鮮實驗結(jié)果與分析

2.3.1 失重率變化趨勢分析 由圖9可知，對照組和實驗組番茄失重率隨儲藏天數(shù)延長都呈不斷增大的趨勢，且在第9天后失重率出現(xiàn)明顯增加，表明番茄在儲存期間會因失水及營養(yǎng)成分流失出現(xiàn)減重現(xiàn)象，且時間越長減重程度越大?？瞻滋幚淼膶φ战M失重率變化最大，在第9～15天時變化最明顯，第15d時達(dá)到了3.17%，實驗組失重率出現(xiàn)緩慢增大的過程，其中T3組配方對番茄失重率的延緩效果最佳，到第15天時其失重率只有0.84%。

圖9 失重率變化趨勢

2.3.2 可溶性固形物變化趨勢分析 由圖10可知，對照組和實驗組中番茄可溶性固形物含量隨儲藏天數(shù)延長呈先減少后增大的趨勢，其轉(zhuǎn)折趨勢與番茄后熟導(dǎo)致可溶性糖、酸等營養(yǎng)成分含量增加有關(guān)。空白處理的對照組可溶性固形物含量變化最大，在第12～15天時變化最明顯，實驗組在儲藏后期可溶性固形物含量都低于初始含量，其中T3組配方抑制含量增加的能力最佳，到第15d時其含量只有6.98%。

圖10 可溶性固形物變化趨勢

2.3.3 VC含量變化趨勢分析 由圖11可知，對照組和實驗組中番茄Vc含量隨儲藏天數(shù)延長呈下降趨勢，表明Vc在儲存期間會因易光解、易氧化等性質(zhì)出現(xiàn)分解和流失，從而導(dǎo)致其含量下降。空白處理的對照組番茄Vc含量變化最大，實驗組Vc含量都呈緩慢下降趨勢，這在一定程度上表明三組配方都能有效減少Vc流失，T3組配方對Vc含量減少的延緩效果最佳，15 d時其含量為14.64 mg·100g-1。

圖11 VC含量變化趨勢

綜上得知番茄儲藏時間隨著配方中南五味子酯甲含量的增加而延長了6～9d，反映其保鮮效果的3個參考指標(biāo)中失重率和Vc含量下降趨勢變緩，可溶性固形物含量增加趨勢變緩，且三組配方中南五味子酯甲2%、殼聚糖2%、植酸0.1%、氯化鈣0.5%含量的復(fù)配保鮮液保鮮效果最好。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

(1)乙醇濃度、液料比、超聲溫度3個單因素對提取率有較顯著的影響，而超聲提取時間的影響較?。辉谝毫媳?00 mL·g-1、超聲溫度55℃、乙醇濃度75%浸提50 min的最優(yōu)提取條件下，南五味子酯甲提取率為0.263%。

(2)抑菌效果：枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>沙門氏菌；抑菌效果隨著南五味子酯甲濃度的增大而增強(qiáng)，25.00 mg·mL-1溶液對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為18.3 mm。

(3)不同含量南五味子酯甲復(fù)配保鮮液處理番茄，其儲藏時間延長了6～9 d，南五味子酯甲2%、殼聚糖2%、植酸0.1%、氯化鈣0.5%含量的復(fù)配保鮮液在加速儲藏期間對番茄失重率等相關(guān)指標(biāo)的變化具有明顯抑制作用。

3.2 討論

(1)研究采用超聲輔助乙醇浸提南五味子酯甲，具有耗能低、可操作性強(qiáng)、能重復(fù)回收溶劑、節(jié)約成本等優(yōu)勢，適用于工業(yè)化大批量生產(chǎn)。實驗所得南五味子酯甲提取率略低于祁星星的實驗得率[14]，其原因一是不同產(chǎn)地南五味子果實中南五味子酯甲含量存在差異；二是南五味子酯甲在乙醇中溶解度低于甲醇，致使提取率降低；三是提取實驗升溫造成乙醇揮發(fā)，使得乙醇濃度降低影響提取率。

(2)南五味子酯甲提取液對革蘭氏陽性菌的抑菌效果強(qiáng)于革蘭氏陰性菌，此實驗結(jié)果為南五味子木脂素單體成分對常見食品腐敗菌的抑菌作用提供了理論依據(jù)，但還有必要深入探討其抑制機(jī)理和量效關(guān)系。

(3)番茄保鮮實驗驗證了南五味子酯甲在與殼聚糖、植酸、氯化鈣復(fù)配制成保鮮液后，具有延長常見易腐敗果蔬儲存時間的作用，能夠作為生產(chǎn)實踐中將南五味子酯甲用于果蔬類貯藏保鮮的技術(shù)參考。