劉庚玫，張曉虎，張峻偉

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

0 引言

南五味子為五味子科(Schisandraceae)南五味子屬(KadsuraKaempf.exJuss.)南五味子(KadsuralongipedunculataFinetetGagnep.)植物的果實(shí)?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明南五味子中含有機(jī)酸、木脂素、倍半萜及多糖等多種成分，其中南五味子醇甲、南五味子甲素、南五味子酯甲等木脂素類化合物為其主要活性成分,具有抗氧化、抗炎抗菌、舒張血管、保肝強(qiáng)脾等藥理作用[1～6]。

南五味子提取物可誘導(dǎo)果蔬本身防御性酶活力的增強(qiáng)，提高抗病性，有效減緩果蔬采后腐壞，具有食品防腐及果蔬保鮮的良好應(yīng)用前景[7,8]。馬永全等[9]測(cè)定五味子提取物的抑菌活性及清除1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH)、羥自由基(OH)、超氧陰離子(O2-)的能力，研究表明五味子提取物具有明顯的抑菌及抗氧化作用。李洪洋[10]對(duì)五味子醇甲的抑菌性進(jìn)行研究，結(jié)果表明五味子醇甲對(duì)大腸桿菌、黑曲霉、啤酒酵母具有顯著的抑菌活性。林雄平等[11]對(duì)南五味子根黃酮提取物的抗菌抗氧化活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉、啤酒酵母均有一定程度的抑菌效果。

研究選取商洛南五味子作為對(duì)象，采用微波輔助乙醇浸提法提取南五味子醇甲，以其為指標(biāo)采用響應(yīng)面法通過高效液相色譜法對(duì)南五味子醇甲的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。研究南五味子醇甲對(duì)三種常見菌抑菌效果，并將南五味子醇甲與普魯蘭多糖、丙三醇、油酸進(jìn)行復(fù)配，將配制的復(fù)合防腐保鮮液用于雞蛋保鮮，為南五味子醇甲應(yīng)用于蛋類保鮮的研究提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 材料：南五味子干燥果實(shí)(購于商洛市商州區(qū)福鑫康藥業(yè))、當(dāng)日產(chǎn)新鮮雞蛋(購于商州區(qū)沙河子鎮(zhèn)養(yǎng)雞場(chǎng))、一次性泡沫包裝盒(購于商州區(qū)家佳惠超市)。

試劑：五味子醇甲標(biāo)品(分析純，購于江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司)，無水乙醇(分析純)，瓊脂，95%乙醇(分析純)，甲醇(分析純)，蒸餾水，胰蛋白胨，普魯蘭多糖，丙三醇，油酸，磷酸(分析純)。

菌種：大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌(購自西安市長安區(qū)瑞昇化玻儀器供應(yīng)站)。

1.1.2 主要儀器 JP-500C型高速多功能粉碎機(jī)，永康市久品工貿(mào)有限公司；DHG9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀器，日本島津有限公司；LRH-70F型生化培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；pHS-25型數(shù)顯pH測(cè)試儀，上海始恒儀器有限公司。

色譜條件：色譜柱：ODS-3(C18)(4.6 mm×150 mm，5 μm)；以甲醇-0.05%磷酸溶液(60∶40)為流動(dòng)相；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長為 250 nm[12]；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL[13]。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗(yàn)材料預(yù)處理 將南五味子干燥果實(shí)放入高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，置于干燥的廣口瓶中，密封備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 稱取5mg五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇溶解搖勻并定容于10 mL潔凈容量瓶中，取上述溶液2、4、6、8、10 mL分別置于潔凈試管中，各個(gè)試管用甲醇定容至10 mL。加甲醇稀釋至10 mL刻度線，按1.1.1色譜條件，分別重復(fù)進(jìn)樣3次，測(cè)定并記錄峰面積。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，回歸方程為：y=7E+06x+71418，R2=0.9983。

1.2.3 南五味子醇甲的提取 準(zhǔn)確稱取5 g南五味子粉末，放入100 mL燒杯中，加入一定濃度和比例的乙醇，浸泡5 min，攪拌均勻，然后置于微波爐提取一定時(shí)間，將提取液倒入100 mL容量瓶，用蒸餾水定容，待測(cè)[14]。

1.2.4 南五味子醇甲的測(cè)定 使用移液槍將不同濃度的南五味子醇甲提取液吸取1.0 mL，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，按1.1.1色譜條件重復(fù)進(jìn)樣三次，按下式計(jì)算提取液中南五味子醇甲的質(zhì)量濃度[15]。

Y(mg·g-1)=C·N·V/M

式中：C-為回歸方程計(jì)算出的南五味子醇甲濃度(mg·mL-1)；N-為溶液稀釋倍數(shù)；V-為提取液體積(mL)；M-為南五味子醇甲粉末質(zhì)量(g)。

1.2.5 單因素試驗(yàn) 分別考察液料比(1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12)、微波功率(200、350、500、650、800W)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(55、65、75、85、95%)、提取時(shí)間(5、10、15、20、25 min)對(duì)南五味子醇甲得率的影響。

1.2.6 響應(yīng)面法試驗(yàn) 基于單因素試驗(yàn)，進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。以X1、X2、X3為自變量，以南五味子醇甲得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6.0軟件對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率和提取時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行3水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，得到最佳優(yōu)化提取工藝參數(shù)，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)評(píng)最佳提取工藝參數(shù)可靠性。

1.2.7 抑菌性試驗(yàn) 菌懸液的制備：在試管中注入等量無菌水，挑取活化后的菌種接入到無菌水中，震蕩，搖勻，制備成濃度為1×105cfu·mL-1的菌懸液備用。

南五味子醇甲抑菌能力測(cè)定：南五味子醇甲提取液配制成7個(gè)濃度梯度(2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg·mL-1)，每個(gè)濃度3組平行。在37℃、相對(duì)濕度67%的條件下培養(yǎng)24 h后取出觀察，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑[16]。

1.2.8 復(fù)合保鮮液配方制備 單因素試驗(yàn)：分別考察普魯蘭多糖添加量(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 g)、丙三醇添加量(0.5、1.0、1.5、2、2.5 mL)、油酸添加量(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL)、南五味子醇甲添加量(6、7、8、9、10 mL)對(duì)雞蛋保鮮效果的影響。

正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取普魯蘭多糖、丙三醇、油酸、南五味子醇甲添加量4個(gè)因素、設(shè)置3個(gè)水平，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化復(fù)合保鮮液配方[17,18]。

1.2.9 復(fù)合保鮮液應(yīng)用 將制備的復(fù)合保鮮液用于雞蛋保鮮，取未處理過的新鮮雞蛋作為對(duì)照組按照相同實(shí)驗(yàn)條件在35℃恒溫加速貯藏，檢測(cè)失重率、哈夫單位、蛋白pH及感官品質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)南五味子醇甲得率的影響 據(jù)圖2分析可知，南五味子醇甲的提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷增大先提高而后逐漸降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到85%后提取率呈下降趨勢(shì)，究其原因：一是由于溶液極性變強(qiáng)，使木脂素類物質(zhì)溶解度降低。二是較高的乙醇濃度會(huì)分解或破壞南五味子中的有效成分使醇甲含量變低。因此，選取85%為較佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.1.2 料液比對(duì)南五味子醇甲得率的影響 據(jù)圖3分析可知，南五味子醇甲得率隨著料液比得增加而變大，當(dāng)料液比為1∶10時(shí)得率為2.351 mg·g-1達(dá)到此范圍最大值；當(dāng)料液比增加到1∶12時(shí)，得率無明顯改變。考慮經(jīng)濟(jì)效益可選取1∶10作為較佳料液比。

2.1.3 微波功率對(duì)南五味子醇甲得率的影響 據(jù)圖4分析可知，微波功率從350 W增加到500 W時(shí)，南五味子醇甲的得率不斷增加，當(dāng)微波功率達(dá)到500 W時(shí)得率最達(dá)。隨著微波功率逐漸增大，南五味子內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致醇甲得率降低。因此，選取500 W為較佳微波功率。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)南五味子醇甲得率的影響 據(jù)圖5分析可知，南五味子醇甲的提取率隨著提取時(shí)間的不斷延長，先增大而后緩慢減小。提取時(shí)間達(dá)到10 min時(shí)醇甲得率達(dá)到最大，繼續(xù)延長時(shí)間使細(xì)胞與空氣接觸時(shí)間延長同時(shí)增加接觸面積，其內(nèi)部發(fā)生降解或縮合反應(yīng)使得率降低。因此，10 min為較佳提取時(shí)間。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)南五味子醇甲得率的影響

圖3 料液比對(duì)南五味子醇甲得率的影響

圖4 微波功率對(duì)南五味子醇甲得率的影響

圖5 提取時(shí)間對(duì)南五味子醇甲得率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果 以單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，在固定料液比為1:10的前提下，選擇A(乙醇體積分?jǐn)?shù))、B(微波功率)、C(提取時(shí)間)為響應(yīng)面自變量，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果見表1。

2.2.2 回歸分析 利用Design-Expert 8.0.6.0對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到以編碼因子表示的最終方程為：

Y=2.78+0.32A+0.037B+0.16C+0.06AB-0.30AC+0.062BC-0.74A2-0.038B2-0.22C2

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表2，該實(shí)驗(yàn)所建立的二次多項(xiàng)模型，P模型<0.0001，具有高度顯著性。P失擬項(xiàng)=0.031，不顯著，表明無失擬因素存在。其中交互項(xiàng)(AC)差異高度顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)差異極顯著，提取時(shí)間(C)差異高度顯著。

表2 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

由表3，南五味子酯甲提取率的變異系數(shù)C.V.%可以反應(yīng)回歸方程可信度。校正系數(shù)R2Adj=0.9762，表明該回歸模型擬合程度好，可以解釋97.62%響應(yīng)值的變化，變異系數(shù)C.V=3.36%，說明所得數(shù)據(jù)具有較高的穩(wěn)定性。

表3 回歸模型方差分析

2.2.3 響應(yīng)面分析 由圖6，乙醇體積分?jǐn)?shù)固定時(shí)，南五味子醇甲得率隨微波功率的逐漸增加先升高后降低，微波功率在500 W時(shí)得率最大；微波功率固定時(shí)，醇甲得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加先升高后降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)在85%～90 %時(shí)南五味子醇甲得率最大；由圖7，乙醇體積分?jǐn)?shù)固定時(shí)，南五味子醇甲得率隨提取時(shí)間的增加而變大，提取時(shí)間為9～11min時(shí)醇甲得率最大；提取時(shí)間固定時(shí)，得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增加先升高后降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)在85%時(shí)南五味子醇甲得率最大；由圖8，微波功率固定，南五味子醇甲得率隨著提取時(shí)間的延長而緩慢增加，提取時(shí)間為9～11 min時(shí)醇甲得率達(dá)到最大，隨后得率趨于穩(wěn)定變化較??；提取時(shí)間固定時(shí)，醇甲得率隨微波功率的逐漸增加呈現(xiàn)先增長再下降的細(xì)微變化，微波功率在500 W時(shí)南五味子醇甲得率最大。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波功率對(duì)南五味子醇甲得率的交互影響等高線和響應(yīng)曲面

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)南五味子醇甲得率的交互影響等高線和響應(yīng)曲面

圖8 微波功率和提取時(shí)間對(duì)南五味子醇甲得率的交互影響等高線和響應(yīng)曲面

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 優(yōu)化工藝條件：料液比1∶10，微波功率為500 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%，提取時(shí)間為10 min。由響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及Box-Benhnken設(shè)計(jì)給出的最優(yōu)方案進(jìn)行南五味子醇甲的提取，檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)南五味子醇甲得率為2.824 mg·g-1，優(yōu)于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可作為優(yōu)化方案。

2.3 抑菌性實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

表4表明，南五味子醇甲的抑菌效果順序?yàn)椋荷抽T氏菌<金黃色葡萄球菌<大腸桿菌，大腸桿菌的MIC為0.125 mg·mL-1，對(duì)其抑菌效果明顯優(yōu)于金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。

表4 南五味子醇甲最低抑菌濃度

2.4 復(fù)合保鮮液配方制備及應(yīng)用

2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 普魯蘭多糖含量對(duì)雞蛋保鮮效果的影響：由圖9，隨著貯藏時(shí)間延長，各組雞蛋均有一定失重，在普魯蘭多糖添加量為6 g時(shí)其失重率減輕最緩；由圖10，各試驗(yàn)組哈夫單位隨時(shí)間的延長而減小，其中普魯蘭多糖添加量為6 g和5.5 g時(shí)雞蛋哈夫單位值變化較小，與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組相比保鮮效果較為明顯；由圖11，各試驗(yàn)組蛋黃指數(shù)隨時(shí)間的延長而減小，空白組下降速度最快，在普魯蘭多糖添加量6 g時(shí)蛋黃指數(shù)下降較緩，結(jié)合以上分析可得普魯蘭多糖添加量為6 g時(shí)復(fù)合保鮮液保鮮效果較好。

丙三醇含量對(duì)雞蛋保鮮效果的影響：由圖12，隨著貯藏時(shí)間延長，雞蛋均有一定的失重，其中丙三醇添加量為2.5 mL時(shí)雞蛋重量減輕較緩，比對(duì)照實(shí)驗(yàn)組低了3.9%；由圖13，計(jì)算哈夫單位后發(fā)現(xiàn)丙三醇添加量為2.5 mL時(shí)雞蛋哈夫單位值變化較小，在同組實(shí)驗(yàn)中較高；由圖14，丙三醇添加量為2.5 mL和2 mL時(shí)蛋黃指數(shù)下降稍緩，結(jié)合以上分析可得丙三醇添加量為2.5 mL的復(fù)合保鮮液保鮮效果較好。

油酸含量對(duì)雞蛋保鮮效果的影響：由圖15，隨著貯藏時(shí)間延長，雞蛋均有一定的失重，其中油酸添加量為3 mL時(shí)雞蛋重量減輕較緩，比對(duì)照實(shí)驗(yàn)組低了3.2%；由圖16，計(jì)算哈夫單位后發(fā)現(xiàn)油酸添加量為3 mL時(shí)哈夫單位值變化較小，在同組實(shí)驗(yàn)中較高，為53 Ha。可能由于添加較高的油酸黏度及穩(wěn)定性較好，能更好的成膜保護(hù)雞蛋；由圖17，油酸添加量為3 mL和3.5 mL時(shí)蛋黃指數(shù)下降較緩，結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得油酸添加量為3 mL時(shí)保鮮效果較好。

南五味子醇甲提取液對(duì)雞蛋保鮮效果的影響：由圖18，貯藏時(shí)間延長使雞蛋均有一定的失重，使用10 mL五味子醇甲溶液的雞蛋重量減輕較緩，比對(duì)照實(shí)驗(yàn)組低了3.1%；由圖19，計(jì)算哈夫單位后發(fā)現(xiàn)南五味子醇甲添加量為10 mL時(shí)其雞蛋哈夫單位值變化較小，經(jīng)15 d 35℃恒溫保藏后為52 Ha，與對(duì)照試驗(yàn)組相比保鮮效果明顯；由圖20，各試驗(yàn)組蛋黃指數(shù)隨時(shí)間的延長而減小，空白組下降速度最快，在南五味子醇甲添加量分別為9 mL與10 mL時(shí)蛋黃指數(shù)下降較緩，結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得南五味子醇甲添加量為10 mL時(shí)保鮮效果較好。

圖9 普魯蘭多糖添加量對(duì)雞蛋失重率的影響

圖10 普魯蘭多糖添加量對(duì)哈夫單位的影響

圖11 普魯蘭多糖添加量對(duì)蛋黃指數(shù)的影響

圖12 丙三醇添加量對(duì)雞蛋失重率的影響

圖13 丙三醇添加量對(duì)哈夫單位的影響

圖14 丙三醇添加量對(duì)蛋黃指數(shù)的影響

圖15 油酸添加量對(duì)雞蛋失重率的影響

圖16 油酸添加量對(duì)雞蛋哈夫單位的影響

圖17 油酸添加量對(duì)蛋黃指數(shù)的影響

圖18 南五味子醇甲添加量對(duì)雞蛋失重率的影響

圖19 南五味子醇甲添加量對(duì)雞蛋哈夫單位的影響

圖20 南五味子醇甲添加量對(duì)蛋黃指數(shù)的影響

2.4.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 由表5，在35℃恒溫貯藏條件下，不同配方復(fù)合保鮮液處理的雞蛋與空白組相比失重率均為上升趨勢(shì)，哈夫單位值呈下降趨勢(shì)。結(jié)果表明，經(jīng)10 mL五味子醇甲溶液+5.5 g普魯蘭多糖+1.5 mL丙三醇+3.5 mL油酸處理過的雞蛋保藏效果較好。

2.4.3 復(fù)合保鮮液應(yīng)用 通過以上正交試驗(yàn)選擇出最佳的復(fù)合保鮮液配方為A3B2C1D3，將制備的復(fù)合保鮮液應(yīng)用于雞蛋，取未處理過的新鮮雞蛋作為對(duì)照組按照相同實(shí)驗(yàn)條件在35℃恒溫加速貯藏5 d，檢測(cè)貯藏后雞蛋的失重率、哈夫單位及感官品質(zhì)見表6。

表5 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果與分析

表6 35℃加速貯藏后雞蛋感官評(píng)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

(1)基于單因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的方法得到商洛南五味子醇甲的優(yōu)化提取工藝為：料液比1∶10的條件下，微波功率500 W、85%的乙醇體積分?jǐn)?shù)提取10 min，南五味子醇甲的得率為2.824 mg·g-1。

(2)南五味子醇甲的抑菌效果順序?yàn)椋荷抽T氏菌<金黃色葡萄球菌<大腸桿菌；其對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最為顯著，MIC為0.125 mg·mL-1。

(3)制備的復(fù)合保鮮液最優(yōu)配方為：10 mL南五味子醇甲溶液、5.5 g普魯蘭多糖、1.5 mL丙三醇、3.5 mL油酸，將其應(yīng)用于新鮮雞蛋后，35℃恒溫貯藏，與空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)組對(duì)比，使用復(fù)合保鮮液后的雞蛋保藏效果要優(yōu)于空白對(duì)照組，能延長貯藏期15 d。

3.2 討論

(1)研究通過微波輔助乙醇浸提法提取木脂素類物質(zhì)南五味子醇甲，利用高效液相色譜儀測(cè)定其得率，得到南五味子醇甲的優(yōu)化提取工藝，與其他提取方法如乙醇回流、超臨界萃取法相比操作簡便、省時(shí)省力，適用于大批量的提取，可明顯節(jié)約成本。提取的南五味子醇甲略低于黃惠華的試驗(yàn)得率[19]，究其原因：一是由于購買的干制南五味子在采摘時(shí)錯(cuò)過了南五味子醇甲含量最高的時(shí)期，導(dǎo)致部分南五味子醇甲分解；二是由于粉碎程度不夠細(xì)小，未能將有效成分全部提取。試驗(yàn)的抑菌效果順序與吳少輝的研究結(jié)論一致[7]。

(2)研究能夠較好地提取并檢測(cè)南五味子醇甲，探討了一條較為精準(zhǔn)、可操作的實(shí)驗(yàn)方法。南五味子醇甲具有一定的清除自由基、保鮮防腐效果，利用南五味子醇甲與普魯蘭多糖、丙三醇、油酸進(jìn)行復(fù)配并應(yīng)用于蛋類保鮮中，可為蛋類制品的貯藏及運(yùn)輸銷售的防腐保鮮提供一定的參考依據(jù)。

(3)建議今后研究注意：盡量在南五味子花期結(jié)束后就進(jìn)行采摘，最大程度避免因采摘期不當(dāng)造成的得率偏差；可進(jìn)行多次粉碎以盡可能增大與溶劑的接觸面積提高提取率；鑒于南五味子果核與果肉中的醇甲含量差別較大，今后可分別進(jìn)行研究。