宋永娜 王林納 翟建霞 董潤 祖翡翠 焦曉琪 陳秋生

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種以肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、彌漫性肺泡炎及肺纖維化為主要病理特征的疾病[1]。該病起病隱襲，早期診斷困難，治療上除肺移植外無其他有效方法，因此預(yù)后極差[1-3]。IPF的中位生存期僅為3年，死亡率甚至與許多終末期惡性腫瘤的死亡率相當(dāng)[3-5]。隨著IPF 研究的深入，國外關(guān)于IPF早期診斷的相關(guān)基因研究逐漸成為熱點(diǎn)[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，人粘蛋白5B(mucin-5 subtype B，MUC5B)啟動子的多態(tài)性與IPF的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后具有一定相關(guān)性，而目前此類研究主要集中于白種人，在國內(nèi)的相關(guān)研究較少[6-7]。因此，本研究通過病例對照研究，探討MUC5B rs35705950和rs868903兩個位點(diǎn)的基因多態(tài)性與IPF發(fā)病風(fēng)險之間的相關(guān)性，以便早期發(fā)現(xiàn)易感人群、協(xié)助判斷患者預(yù)后及為治療提供新思路。

資料與方法

一、資料收集

按照ATS/ERS/JRS/ALAT聯(lián)合頒布的最新IPF診斷及治療國際性循證指南[5,8]，選取2014年1月至2018年12月于我院確診的IPF患者114例作為病例組(已排除繼發(fā)性肺纖維化、惡性腫瘤、急性感染、嚴(yán)重心血管疾病、糖尿病腎病及結(jié)核病)。另隨機(jī)選擇我院同期健康體檢者100例為對照組。收集兩組患者的相關(guān)臨床資料(年齡、性別、吸煙史、家族史等)。這項研究已通過本院的倫理委員會批準(zhǔn)，所有參與者均簽署知情同意書。

二、方法

1 DNA樣本的提取 所有研究對象均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集外周靜脈血2 mL于EDTA-K2抗凝管中，采用血液DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)提取DNA，操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

2 引物設(shè)計 引物序列設(shè)計參照相關(guān)文獻(xiàn)[3,5]：MUC5B rs35705950引物序列上游：5′-AACCGGCGTGTTCCCTTTCCTTCCT-3′，下游：5′-GACTTGTCGTCCCT CCCACTA-3′；MUC5B rs868903引物序列上游：5′-TGCAACACCAGCTCACCAT-3′，下游：5′-TGTCCAC AGCAGCATCACT-3′。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行合成。

3 DNA擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL，含基因組DNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，10×PCR緩沖液(含Mg2+)2.5 μL，4×dNTP 0.5 μL以及Taq聚合酶0.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃ 變性45 s，55 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，35個循環(huán)后72 ℃繼續(xù)延伸7 min。

4 基因測序 分別檢測MUC5B rs35705950和MUC5B rs868903的單核苷酸多態(tài)性。PCR產(chǎn)物測序由北京康旭醫(yī)學(xué)檢驗所完成。

5 隨訪方式 采用患者復(fù)診與電話溝通相結(jié)合的方式進(jìn)行隨訪。隨訪截止日期為2020年5月31日?？偵媛?overall survival rate，OS)定義為首次確診為IPF至患者死亡或至隨訪截止時間。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組研究對象的一般資料比較

本研究共納入IPF確診病例114例，同期健康體檢者100例。兩組研究對象均無IPF家族史，且兩組對象在年齡、性別、吸煙史、BMI指數(shù)等方面均無顯著差異(P>0.05)，具有可比性(見表1)。

表1 兩組研究對象的一般資料比較[n(%)]

二、遺傳平衡性檢驗

根據(jù)表2可知，兩組研究對象的MUC5B rs35705950和MUC5B rs868903基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗(P>0.05)，顯示所研究的樣本具有群體代表性(見表2)。

表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗

三、兩組研究對象MUC5B rs35705950不同基因型和等位基因分布

由表3可知，病例組中GT+TT基因型和T等位基因的頻率顯著高于對照組(P=0.015，P=0.007)。采用二元Logistic回歸分析進(jìn)行基因多態(tài)性的比較發(fā)現(xiàn)，攜帶突變基因型GT或TT者較野生基因型GG者患IPF的OR為2.511，95%CI為(1.173-5.373)；攜帶T等位基因者較G等位基因者患IPF的OR為2.603，95%CI為(1.268-5.343)。

四、兩組研究對象MUC5B rs868903不同基因型和等位基因分布

由表4可知，病例組中CT+CC基因型和C等位基因的頻率顯著高于對照組(P=0.033，P=0.045)。采用二元Logistic回歸分析進(jìn)行基因多態(tài)性的比較發(fā)現(xiàn)，攜帶突變基因型CT或CC者較野生基因型TT者患IPF的OR為1.968，95%CI為(1.051-3.683)；攜帶C等位基因者較T等位基因者患IPF的OR為1.477，95%CI為(1.008-2.165)。

表3 兩組研究對象MUC5B rs35705950不同基因型和等位基因分布

表4 兩組研究對象MUC5B rs868903不同基因型和等位基因分布

五、MUC5B rs3570595和rs868903基因多態(tài)性與IPF患者生存狀況的關(guān)系

本研究共隨訪到106例患者，8例缺失，隨訪率92.98%。106例患者中死亡32例(30.19%, 95%CI：21.45%-38.93%)，平均總生存期(OS)為26.08個月。根據(jù)圖1A、B示，MUC5B rs3570595的GT和TT基因型患者的OS顯著低于GG患者(χ2=3.971，P=0.046)；而MUC5B rs868903的CT和CC基因型患者與TT患者的OS之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.650，P=0.420)(見圖1A、1B)。

圖1A MUC5B rs35705950基因多態(tài)性與IPF患者生存狀況的關(guān)系

圖1B MUC5B rs868903基因多態(tài)性與IPF患者生存狀況的關(guān)系

討 論

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種病因不明、慢性、進(jìn)行性致纖維化的間質(zhì)性肺炎[1,9]。據(jù)報道，IPF的發(fā)病率約為6.8～16.3人/10萬人，且發(fā)病率逐年增高[10]。而IPF患者對藥物治療反應(yīng)小，預(yù)后極差，嚴(yán)重威脅人類的生存健康[3,11]。因此，IPF的發(fā)病機(jī)制成為目前研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)研究認(rèn)為遺傳基因在IPF的發(fā)病過程中起到了重要作用，其中MUC5B啟動子的單核苷酸多態(tài)性引起人們的廣泛關(guān)注[5,10]。MUC5B是一種分泌蛋白，主要是由呼吸道遠(yuǎn)端氣道黏膜下黏液腺細(xì)胞所產(chǎn)生，主要影響氣道黏液的流變特性和氣道防御功能等[9,10]。研究發(fā)現(xiàn)，MUC5B 啟動子的多態(tài)性不僅可作為 IPF 易感性的指標(biāo)，也可以反映 IPF 的預(yù)后[9,10]。然而目前這些研究主要集中在西方國家的患者，關(guān)于東亞人口的相關(guān)數(shù)據(jù)仍然有限。因此，明確我國人群IPF的易感基因，對IPF患者早期診斷、治療及預(yù)后判斷具有重要意義。

Seibold等[9,12]早在2011年就發(fā)現(xiàn)MUC5B轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游rs35705950 基因多態(tài)性與IPF的發(fā)病具有較強(qiáng)的相關(guān)性。之后Borie等[13]進(jìn)行一項前瞻性隊列研究發(fā)現(xiàn)，MUC5B啟動子rs35705950多態(tài)性與IPF相關(guān)，但與硬皮病所引起的間質(zhì)性肺疾病不相關(guān)，提示兩者具有不同的病理生理。國內(nèi)Wang等[14]的一項針對我國漢族人群的MUC5B啟動子rs35705950多態(tài)性分析顯示，IPF患者T等位基因的頻率高于健康人群，表明該變異與我國漢族IPF患者遺傳易感性相關(guān)。而茍安栓等[15]對88例維吾爾族IPF患者M(jìn)UC5B啟動子rs35705950多態(tài)性分析，并未發(fā)現(xiàn)基因型構(gòu)成與等位基因之間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。本研究人群同樣為漢族人群，結(jié)果示IPF患者GT+TT基因型和T等位基因的頻率顯著高于健康對照組，且攜帶T等位基因者對IPF的易感風(fēng)險是G等位基因者2.603倍，提示攜帶T等位基因可能是IPF的易感基因，這與Wang等人的研究結(jié)果相似。

Peljto等[16]研究認(rèn)為MUC5B啟動子rs35705950基因多態(tài)性雖然可以導(dǎo)致IPF的發(fā)病風(fēng)險增高，但其攜帶者的死亡率反而較低。Allen等[17]研究亦發(fā)現(xiàn)基因型為GT或TT的IPF患者死亡風(fēng)險顯著低于GG患者，認(rèn)為MUC5B rs35705950基因多態(tài)性與IPF患者死亡率減少相關(guān)。國內(nèi)郭璐等[5]研究同樣發(fā)現(xiàn)GT基因型較GG基因型的IPF患者具有更長的生存期，死亡人數(shù)顯著低于GG組。而相反的是，國內(nèi)Jiang等[9,18]研究發(fā)現(xiàn)MUC5B rs35705950基因多態(tài)性與IPF患者FVC、DLco下降相關(guān)，生存分析顯示攜帶T等位基因的IPF患者總生存期較短。本研究發(fā)現(xiàn)MUC5B rs35705950 GT和TT基因型患者的平均總生存期顯著低于GG患者，認(rèn)為MUC5B rs35705950單核苷酸多態(tài)性與IPF患者的死亡率減低有一定關(guān)系，識別IPF患者此位點(diǎn)的基因多態(tài)性，對判斷患者的預(yù)后具有一定的價值。

目前關(guān)于MUC5B啟動子的另一個單核苷酸多態(tài)性rs868903的相關(guān)研究很少，我國Wang等[6]首次研究證明MUC5B rs868903基因多態(tài)性與高分辨率計算機(jī)斷層掃描的蜂窩狀混濁程度和IPF患者的死亡率相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)IPF患者CT或CC基因型和C等位基因的頻率顯著高于健康人群，攜帶突變基因C者患IPF的風(fēng)險是攜帶野生型基因T者的1.477倍，提示攜帶C等位基因可能是IPF的易感基因。但對MUC5B rs868903基因多態(tài)性與IPF患者死亡風(fēng)險關(guān)系的研究中，我們未發(fā)現(xiàn)攜帶突變基因型與患者的預(yù)后相關(guān)，其在對患者預(yù)后的預(yù)測價值上仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，MUC5B rs3570595和 rs868903基因多態(tài)性可能是我國IPF患者的易感因素，其中MUC5B rs35705950基因多態(tài)性與IPF患者的死亡率減低有一定關(guān)系，而MUC5B rs868903基因多態(tài)性與IPF預(yù)后的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。本研究是一個單中心研究，樣本量尚小且種族單一，而IPF基因多態(tài)性可能存在人種、地區(qū)等差異，其與IPF發(fā)病風(fēng)險及預(yù)后的關(guān)系仍要多中心、大樣本量來進(jìn)一步證實(shí)。