郭耀東, 張曉文,馬應(yīng)卓,梁旭華

(1.商洛學(xué)院 健康管理學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

山茱萸為山茱萸科落葉小喬木植物，其干燥成熟的果肉為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材[1]。山茱萸性微溫，味酸、澀，歸肝、腎經(jīng)，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、降血糖、抗炎、抑菌等作用，具有較高的藥用價(jià)值，在藥品和保健品行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用[1～3]。2020年，國(guó)家衛(wèi)健委將山茱萸列入“藥食同源”管理物質(zhì)試點(diǎn)，進(jìn)一步擴(kuò)展了山茱萸在食品中的應(yīng)用范圍。陜西是我國(guó)三大山茱萸主產(chǎn)區(qū)之一，山茱萸種植加工產(chǎn)業(yè)已成為我省商洛、漢中等地為發(fā)展區(qū)域經(jīng)濟(jì)、實(shí)現(xiàn)脫貧攻堅(jiān)目標(biāo)而大力的特色產(chǎn)業(yè)[4]。

山茱萸中主要生物活性物質(zhì)為揮發(fā)性成分、有機(jī)酸及酯類、多糖和鞣質(zhì)[5～6]。其中，山茱萸多糖(PFC)生物活性已成為近年來(lái)的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，相關(guān)研究已對(duì)其體外抗氧化、抑菌、調(diào)節(jié)免疫及抗衰老作用及機(jī)制進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究[7～10]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是人體血腦屏障重要組成部分，對(duì)維持正常腦內(nèi)環(huán)境具有重要作用。氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要因素，通過(guò)引發(fā)動(dòng)脈血管壁炎性環(huán)境形成和脂質(zhì)沉積，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[11]。中藥多糖能夠通過(guò)增加ECs活性、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的保護(hù)作用[12]。筆者研究通過(guò)建立內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型，系統(tǒng)評(píng)價(jià)了山茱萸多糖對(duì)ox-LDL刺激小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd.3)的保護(hù)作用，以期為下一步山茱萸多糖的深度利用提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料和試劑

山茱萸多糖，在商洛學(xué)院健康食品實(shí)驗(yàn)室按照研究團(tuán)隊(duì)前期優(yōu)化的工藝進(jìn)行制備[13]；胎牛血清，購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)液，購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胰蛋白酶-EDTA消化液、青鏈霉素混合液，購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；ox-LDL，購(gòu)自廣州奕源生物科技有限公司；Bax、Bcl-2、caspase3、GAPDH抗體，購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠、羊抗兔二抗，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Western blot發(fā)光液，購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司；細(xì)胞裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、蛋白marker、CCK8，購(gòu)自美國(guó)Thermo生物公司；上樣緩沖液、瑞氏-姬姆薩染液、BCA蛋白定量試劑盒、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒、一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒、內(nèi)皮素-1(ET-1)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；脫脂奶粉，由內(nèi)蒙古伊利集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)；其他常規(guī)分析純?cè)噭?，由天津科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 主要儀器設(shè)備

DH-160I型CO2培養(yǎng)箱，上海三騰儀器有限公司；單人雙面潔凈工作臺(tái)，蘇州惠豐凈化設(shè)備有限公司；9140A型電熱恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；4℃冰箱，蘇州三星電子有限公司；-20℃冰箱，北京福意電氣有限公司；-80℃冰箱，北京德力萊技發(fā)展有限公司；高壓滅菌鍋，北京博勱行儀器有限公司；電泳儀，美國(guó)伯樂(lè)公司；搖床，美國(guó)Rosi公司；JY96-IIN型超聲破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀，美國(guó)伯樂(lè)公司；顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性 將小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3置于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，每孔按1×105個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)中箱靜置培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后更換無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)液中加入濃度分別為0、30、50、80、100、150、200、300 mg·L-1山茱萸多糖孵育24 h，加入10 μL CCK-8溶液，孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm下測(cè)定吸光度值。

1.3.2 瑞氏-姬姆薩染色法觀察細(xì)胞形態(tài) 將直徑為8 mm的滅菌后的圓形蓋玻片平鋪于24孔板中，每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵化貼壁后，更換無(wú)血清培養(yǎng)基孵育24 h。CT組和ox-LDL組加入無(wú)血清培養(yǎng)基，ox-LDL+PFC組分別給予含200 mg·L-1的山茱萸多糖無(wú)血清培養(yǎng)基，孵育2 h后，除CT組，各孔再加入100 μg·mL-1ox-LDL刺激24 h。結(jié)束后用PBS緩沖液清洗各孔3遍后，每孔滴加瑞氏-姬姆薩染液3滴，使整個(gè)細(xì)胞爬片完全被染液覆蓋，2 min后滴加等量PBS緩沖液，混勻，染色5 min；吸掉染液再用水清洗，最后用鑷子夾取細(xì)胞爬片，輕輕倒扣于滴有水性封片液的載玻片上，干燥后鏡檢，拍照。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)液中NO、MDA、SOD、ET-1活性檢測(cè) 按照1×107個(gè)細(xì)胞密度，接種至含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基的10 cm培養(yǎng)皿中，分組和培養(yǎng)條件與1.3.2相同。24 h后收集各組細(xì)胞上清液，按照NO、MDA、SOD和ET-1檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平的表達(dá)變化 棄去上述各組細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)剩余培養(yǎng)液，加入冰PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次，棄掉多余的PBS，每個(gè)培養(yǎng)皿加入100～150 μL細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，將各組細(xì)胞與細(xì)胞裂解液的混懸液分別收集在3個(gè)EP管內(nèi)，冰浴條件下進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎，繼續(xù)放于冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 rpm、離心15 min[14]。 收集各組細(xì)胞上清液到新的EP管。按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，測(cè)定每組上清液的蛋白含量。然后加入上樣緩沖液(上清液與上樣緩沖液比例為4∶1)，混勻[15]。樣品在100 ℃下煮沸10 min，4℃保存。取出樣品，混勻，置冰上備用，80 V條件下開(kāi)始電泳，25～30 min后，將電壓調(diào)至120 V，繼續(xù)電泳至條帶跑至膠板底端。電泳結(jié)束后，采用三明治夾心法進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜。100 min后取出膜，置于5%脫脂奶粉-PBST液中，搖床上封閉2 h。再將膜置于稀釋成一定比例的一抗內(nèi)，4℃孵育過(guò)夜。再用PBST將條帶漂洗3次，每次10 min。繼續(xù)與二抗常溫孵育1 h，PBST緩沖液漂洗3次，每次10 min。將膜從PBST緩沖液中取出，放在全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀中，將發(fā)光劑按照1∶1的比例配制好充分混勻后，均勻涂抹于膜上,并成像，拍照，利用Image J 1.47圖像處理系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)條帶的灰度值進(jìn)行分析[16]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)結(jié)果均以 X±SEM表示，采用SPSS19.0對(duì)相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 不同山茱萸多糖處理濃度下的bEnd.3細(xì)胞活性試驗(yàn)結(jié)果分析

CCK8法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞活性試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，與CT組比較，山茱萸多糖濃度為300 mg·L-1時(shí)，小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3活性顯著降低(P<0.05)。說(shuō)明該山茱萸多糖濃度過(guò)高會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性作用，而山茱萸多糖濃度在30、50、80、100、150、200 mg·L-1時(shí)，bEnd.3細(xì)胞活性影響不顯著。最終選擇200 mg·L-1為山茱萸多糖的處理濃度。

圖1 山茱萸多糖對(duì)bEnd.3細(xì)胞增殖活性的作用

2.2 山茱萸多糖對(duì)ox-LDL刺激的bEnd.3細(xì)胞形態(tài)影響分析

不同處理?xiàng)l件下的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3瑞氏-姬姆薩染色結(jié)果如圖2所示。從圖2可見(jiàn)，bEnd.3細(xì)胞形態(tài)在ox-LDL作用下發(fā)生明顯變化。與正常細(xì)胞相比，ox-LDL組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)核聚頭現(xiàn)象，體積明顯變小，細(xì)胞核明顯碎裂，聚集于細(xì)胞膜周圍。胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，內(nèi)皮細(xì)胞受損，甚至發(fā)生凋亡改變。ox-LDL+PFC組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核明顯，分布均勻，說(shuō)明經(jīng)過(guò)山茱萸多糖處理后，受到ox-LDL刺激的bEnd.3細(xì)胞狀態(tài)逐漸恢復(fù)。

2.3 山茱萸多糖對(duì)ox-LDL刺激bEnd.3細(xì)胞中NO、MDA、SOD和ET-1含量影響分析

ox-LDL使內(nèi)皮細(xì)胞減少NO釋放，增加收縮因子ET-1釋放，SOD活性降低、MDA水平升高。MDA、SOD、ET-1和NO含量是反映內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵指標(biāo)[17～18]。不同處理?xiàng)l件下的bEnd.3細(xì)胞的NO、MDA、SOD和ET-1檢測(cè)結(jié)果如表1和圖3～圖6所示。ox-LDL刺激能夠引起bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞上清液中NO和SOD含量顯著下降(P<0.01)，MDA和ET-1含量顯著上升(P<0.01)。經(jīng)過(guò)山茱萸多糖處理后，上述指標(biāo)變化發(fā)生了顯著改變。與ox-LDL組相比，ox-LDL+PFC組細(xì)胞中的NO和SOD含量顯著升高(P<0.01)，MDA和ET-1含量顯著下降(P<0.01)。

表1 不同處理?xiàng)l件下bEnd.3細(xì)胞中NO、MDA、SOD和ET-1水平比較

注：①A、D組：CT組，B、E組：ox-LDL組，C、F組：ox-LDL+PFC組；②A、B、C組(200×)，D、E、F組(1000×)

圖3 山茱萸多糖對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量的影響

圖4 山茱萸多糖對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA含量的影響

圖5 山茱萸多糖對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD含量的影響

圖6 山茱萸多糖對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ET-1含量的影響

2.4 山茱萸多糖對(duì)ox-LDL刺激引起的bEnd.3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響分析

不同條件處理下的bEnd.3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，經(jīng)過(guò)ox-LDL刺激后，bEnd.3細(xì)胞中促凋亡蛋白BAX(P<0.01)和caspase3(P<0.05)表達(dá)顯著升高，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明ox-LDL刺激能夠促進(jìn)bEnd.3細(xì)胞凋亡。而經(jīng)過(guò)山茱萸多糖處理后的bEnd.3細(xì)胞中BAX(P<0.01)和caspase3(P<0.05)蛋白表達(dá)顯著下降，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，說(shuō)明山茱萸多糖可抑制ox-LDL刺激引起的bEnd.3細(xì)胞凋亡。

(注：*，#表示P<0.05，**，##表示P<0.01)

3 結(jié)論與展望

動(dòng)脈粥樣硬化是慢性心血管疾病中最常見(jiàn)的一種病理過(guò)程，可形成動(dòng)脈內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積，伴有平滑肌細(xì)胞和纖維基質(zhì)成分的增殖以及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，進(jìn)而發(fā)展為冠心病、腦梗塞等慢性心血管疾病[19]，嚴(yán)重威脅人類健康。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的常見(jiàn)因素之一[20]。特別是細(xì)胞內(nèi)低密度脂蛋白經(jīng)過(guò)氧化修飾生成ox-LDL，造成內(nèi)皮細(xì)胞變性、凋亡、壞死、脫落等損傷[21]，使血管內(nèi)皮通透性增加，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞減少舒血管因子NO，并增加收縮因子ET-1的釋放，使SOD活性下降、MDA水平升高，引發(fā)炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)沉積、粥樣斑塊形成，促使動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生。

筆者研究發(fā)現(xiàn)bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞在ox-LDL刺激下細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)細(xì)胞增殖分裂能力下降等凋亡改變，細(xì)胞上清液中NO、SOD含量顯著下降，ET-1和MDA含量顯著上升。經(jīng)過(guò)山茱萸多糖處理后bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞狀態(tài)逐漸恢復(fù)，細(xì)胞上清液中NO、SOD含量顯著增加，ET-1及MDA含量顯著降低。說(shuō)明山茱萸多糖能夠在一定程度上保護(hù)ox-LDL引發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，抑制細(xì)胞凋亡，具有潛在的動(dòng)脈粥樣硬化作用。下一步，筆者研究團(tuán)隊(duì)將聚焦于山茱萸多糖在動(dòng)物整體水平上的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，開(kāi)展相關(guān)研究，為山茱萸多糖的利用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。