唐曉玲 郭 健 熊林楷 王利勤 熊墨年

1.江西省中醫(yī)藥研究院惡性腫瘤益氣清毒重點研究室，江西南昌 330046；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，江西南昌330006；3.江西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)二科，江西南昌 330029；4.江西省中醫(yī)藥研究院，江西南昌 330046

大腸癌是目前威脅人類健康與生命安全的惡性疾病之一，具有較高的發(fā)病率[1]，且早期發(fā)病隱匿，加之目前我國國民體檢及胃腸道篩查普及率不高，多數(shù)腸癌患者確診時已是中晚期[2]，錯過最佳手術(shù)時機，并且放化療除具有較嚴(yán)重的毒副反應(yīng)外，長時間應(yīng)用還易導(dǎo)致患者不耐受及耐藥等情況，限制了臨床的應(yīng)用[3]。近年來，中醫(yī)藥在各種惡性疾病的治療中扮演重要角色，成為臨床應(yīng)用及研究的重點和熱點[4]。益氣清毒法是熊墨年教授基于祖國醫(yī)學(xué)“邪之所湊，其氣必虛”和“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”理論，在長期的腫瘤臨床診療與科研實踐中形成并提出的治療腫瘤的學(xué)術(shù)思想。本研究主要針對益氣清毒消瘤方含藥血清對大腸癌細胞生長的抑制作用，初步分析其誘導(dǎo)腸癌細胞凋亡的機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗資料

1.1.1 主要儀器和試劑 激光流式細胞儀、激光共聚焦顯微鏡、凝膠成像儀均購自O(shè)lympus 公司，電泳儀購自北京六一公司；RPMI1640 培養(yǎng)基、單克隆Bcl-2 抗體、單克隆Bax 抗體、單克隆Fas 抗體均購自abcam公司。

1.1.2 益氣清毒消瘤方藥物制備 太子參15 g，白術(shù)15 g、茯苓15 g、甘草6 g、黃芪20 g、白花蛇舌草30 g、半枝蓮30 g、藤梨根20 g、敗醬草15 g、地榆15 g、枳殼10 g、莪術(shù)10 g，加水煎煮1 h，煎液濃縮至1.3 g/mL 生藥，冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 含藥血清制備 本研究經(jīng)過動物倫理委員會審核同意。采用清潔級18～22 g 雄性昆明小鼠40 只（南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，動物合格證號：190608），隨機分為高、中、低劑量組和對照組，每組各10 只，對照組給予0.2 mL的生理鹽水，高、中、低劑量組給藥量分別為13 g 生藥/kg 體重、6.5 g 生藥/kg 體重、3.25 g生藥/kg 體重，4 組小鼠均灌胃給藥3 d，2次/d，于末次給藥前12 h 禁食，末次給藥后1 h 乙醚麻醉，下腔動脈取血，無菌分離血清，經(jīng)56℃30 min 滅活，過濾除菌，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細胞培養(yǎng)及傳代

人大腸癌Wide 細胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所，使用含15 %胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2～3 天傳代1次。

1.3 細胞增殖抑制試驗（MTT 法）

取對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化后計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2×105/mL，接種于96 孔板內(nèi)，每孔0.1 mL，培養(yǎng)24 h后加入等體積不同濃度血清（高、中、低劑量組和對照組），每組設(shè)4個復(fù)孔，37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12、24、48 h后，細胞增殖抑制試驗（MTT 法）測定各組細胞OD值，計算抑制率，重復(fù)3次獨立實驗。

1.4 細胞凋亡的形態(tài)觀察

配置0.025%AO-EB 染液，取蓋玻片培養(yǎng)細胞，入AO 染液染色5 s，20%乙醇-生理鹽水溶液分色2 s，置于載玻片上，藍光（502 nm）激發(fā)，激光共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察各組細胞形態(tài)。

1.5 流式細胞儀（FCM）檢測

1.5.1 細胞凋亡率測定 取經(jīng)各含藥血清處理24 h后的腸癌細胞，胰酶消化后調(diào)整細胞數(shù)為1×106/mL，按試劑說明每樣本分別加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白5 μL 和碘化丙啶10 μL，震蕩混勻，加入緩沖溶液懸浮細胞400 μL 進行FCM 檢測。

1.5.2 蛋白免疫印跡試驗（Western Blot）檢測凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax、Fas的蛋白表達 含藥血清處理24 h 胰酶消化后調(diào)整細胞數(shù)為1×106/mL，常規(guī)處理細胞進行凝膠電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉，按細胞內(nèi)蛋白染色方法，分別加入20 μL的Bcl-2、Bax、Fas 抗體進行抗原-抗體雜交反應(yīng)，完成后置于凝膠成像儀觀察檢測結(jié)果并拍照。各組蛋白表達強度=每個樣本條帶的灰度值/β-actin條帶灰度值，進行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；多組間比較采用單因素分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組培養(yǎng)12、24、48 h后的OD值和抑制率的比較

對照組24、48 h的OD值高于12 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量組48 h的OD值高于12 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；低、中、高劑量組培養(yǎng)12、24、48 h的OD值低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；含藥血清干預(yù)組細胞抑制率呈現(xiàn)時間和劑量依賴趨勢（表1）。

2.2 各組細胞形態(tài)的比較

AO/EB 染色LSCM 鏡下顯示，對照組細胞完整，橙色細胞占（3.12±0.13）%；低劑量組細胞膜存在皺縮現(xiàn)象，少量凋亡細胞，橙色細胞占（38.37±7.92）%；中劑量組橙色細胞占（69.16±9.65）%，呈簇出現(xiàn)，細胞膜明顯皺縮、細胞質(zhì)存在空泡、染色質(zhì)存在塊狀及邊聚現(xiàn)象，凋亡比例升高；高劑量組橙色細胞占（84.64±11.37）%，細胞膜破碎，染色質(zhì)團塊狀、邊聚，核固縮、核破碎，裸核的壞死細胞比例高于其他三組（圖1，封四）。

表1 各組培養(yǎng)12、24、48 h后的OD值和抑制率的比較

2.3 各組細胞凋亡率的比較

含藥血清干預(yù)組24 h后細胞凋亡率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中、高劑量組24 h 細胞凋亡率均高于低劑量組，高劑量組24 h 細胞凋亡率高于中劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2，圖2）。

表2 各組細胞凋亡率的比較（%，）

表2 各組細胞凋亡率的比較（%，）

與對照組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，#P＜0.05；與中劑量組比較，&P＜0.05

組別 早期 晚期對照組（n=10）低劑量組（n=10）中劑量組（n=10）高劑量組（n=10）F值P值4.26±0.71 13.75±1.23*19.53±1.34*#29.36±2.04*#&610.848 0.000 1.06±0.56 7.94±1.65*10.38±1.93*#14.81±1.83*#&143.318 0.000

圖2 各組細胞24h后早期細胞凋亡流式檢測

2.4 各組細胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax、Fas的蛋白表達的比較

含藥血清干預(yù)組細胞凋亡調(diào)控基因Bax、Fas表達高于對照組，Bcl-2表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中、高劑量量組細胞凋亡調(diào)控基因Bax、Fas表達高于低劑量組，Bcl-2表達低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量量組細胞凋亡調(diào)控基因Bax、Fas表達高于中劑量組，Bcl-2表達低于中劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表3，圖3）。

表3 各組細胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax、Fas的蛋白表達的比較（）

表3 各組細胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax、Fas的蛋白表達的比較（）

與對照組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，#P＜0.05；與中劑量組比較，&P＜0.05

組別 Bax Bcl-2 Fas對照組（n=10）低劑量組（n=10）中劑量組（n=10）高劑量組（n=10）F值P值0.17±0.02 0.33±0.06*0.56±0.04*#0.81±0.05*#&459.830 0.000 1.06±0.08 0.67±0.07*0.45±0.09*#0.21±0.06*#&266.354 0.000 0.11±0.03 0.39±0.05*0.51±0.09*#0.73±0.07*#&173.384 0.000

圖3 各組細胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax、Fas 蛋白的表達

3 討論

近年來，隨著祖國醫(yī)學(xué)在腫瘤領(lǐng)域的不斷進展，中醫(yī)藥在惡性腫瘤治療中越發(fā)重要[5]。熊墨年教授基于多年的科研和臨床實踐，提出“益氣清毒法”治療腫瘤的學(xué)術(shù)思想，其益氣清毒消瘤方以中醫(yī)扶正祛邪和脾樞機理論為基礎(chǔ)，以四君子湯健脾益氣、運轉(zhuǎn)樞機、激發(fā)和調(diào)理臟腑功能為核心，兼以消除毒邪、消腫散結(jié)，提高機體免疫和抗腫瘤能力，全方用藥輕柔，如清滌污濁，達到扶正不留邪，攻邪不傷正的目的[6]。臨床以此方為基礎(chǔ)視腫瘤侵犯臟器的情況而辨證加減，產(chǎn)生良好的效果。

腸癌相當(dāng)于中醫(yī)“腸蕈”“臟毒”“鎖肛痔”“積聚”等范疇，病機特點多為本虛標(biāo)實和虛實夾雜，脾虛和腎虛是虛之本，氣、濕、痰、瘀、毒為實之標(biāo)[7]。中醫(yī)認為，脾胃為后天之本，氣血生化之源，氣虛則受納與健運乏力，加之濕濁內(nèi)生，脾胃運化不利則引起腸胃等諸多疾病[8]。四君子湯組方以太子參為君，甘溫益氣，健脾養(yǎng)胃；臣以苦溫之白術(shù)，健脾燥濕，加強益氣助運之力；佐以甘淡茯苓，健脾滲濕，苓術(shù)相配，則健脾祛濕之功益著；使以炙甘草，益氣和中，調(diào)和諸藥，益氣健脾之功[9]。另黃芪包括苷類、多糖、黃酮、葉酸及多種微量元素具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等多種作用[10]；白花蛇舌草包含蒽醌、萜類、黃酮、香豆素、苯丙素、多糖等多種化學(xué)成分，具有調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)、抗腫瘤、抑制血管生成等多種作用[11]；半枝蓮具有調(diào)節(jié)免疫力、抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等作用[12]；藤梨根清熱利濕，祛風(fēng)除痹，解毒消腫，在消化系癌腫中應(yīng)用廣泛[13]；敗醬草具有清熱解毒，祛痰排膿之功[14]；地榆解毒斂瘡[15]；枳殼理氣寬中，行滯消脹[16]；莪術(shù)破血祛瘀行氣、消腫止痛[17]。全方用藥輕柔，以四君子湯為核心，健脾益氣、調(diào)理臟腑，兼以諸藥消除毒邪，調(diào)理機體免疫和抗腫瘤能力。

本研究結(jié)果顯示，益氣清毒消瘤方對大腸癌細胞生長具有明顯的抑制作用，細胞抑制率呈現(xiàn)時間和劑量依賴趨勢，并且能夠破壞腸癌細胞結(jié)構(gòu)，增加細胞凋亡率，同樣呈現(xiàn)明顯的量效相關(guān)性，進一步證實益氣清毒消瘤方在大腸癌中的治療作用。本研究對Bcl-2、Bax、Fas的蛋白表達進行了檢測，Bcl-2、Bax 為同屬家族，但二者作用相反，Bcl-2 為凋亡抑制基因，Bax 為凋亡促進基因[18]，F(xiàn)as 屬于死亡受體家族，是一種跨膜蛋白[19]?，F(xiàn)已證實，包括腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤Bcl-2、Bax、Fas 均異常表達[20]，并且存在相互關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示，對照組Bax、Fas 明顯低表達，Bcl-2 高表達，提示腸癌細胞可能存在凋亡與增殖失衡，從而促進癌細胞的生長和增殖。此外，含藥血清干預(yù)組細胞凋亡調(diào)控基因Bax、Fas表達高于對照組，Bcl-2表達低于對照組，且隨劑量的升高Bax、Fas表達升高，Bcl-2表達降低，呈現(xiàn)明顯的量效相關(guān)性。因此，有理由認為益氣清毒消瘤方可能通過調(diào)控腸癌細胞Bax、Fas的高表達、Bcl-2 低表達干預(yù)細胞結(jié)構(gòu)，使細胞膜破碎，染色質(zhì)團塊狀、邊聚，核固縮、核破碎，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。

綜上所述，益氣清毒消瘤方能夠明顯抑制腸癌細胞的生長和增殖，有效提高細胞凋亡調(diào)控基因Bax、Fas表達，抑制Bcl-2表達，促進細胞凋亡，為益氣清毒法治療大腸癌提供了可靠的實驗數(shù)據(jù)。