孫奇林，陳雯潔，趙雪蘭，王浩，陳蔚

1.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院老年科，上海200040；2.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，上海200032

糖尿?。╠iabetes mellitus,DM）是影響人類健康的慢性疾病之一，DM 的患病率隨年齡增長而升高，約20%的老年DM 患者合并心血管并發(fā)癥[1]。與非DM 心血管病患者相比，老年DM 心血管病患者心力衰竭的發(fā)病率可增加3 倍[2-3]，已成為老年DM 患者的主要死因之一[4]。

老年DM 心血管病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，心肌纖維化在老年DM 患者病程早期就已出現(xiàn)，是促進(jìn)老年DM 心血管病發(fā)生及進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)[5]。在老年DM 狀態(tài)下，心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞可被誘導(dǎo)分泌白細(xì)胞介素-1（interleukin-1,IL-1）、IL-6 及轉(zhuǎn)化生長因子-（transforming growth factor-,TGF-）等多種促纖維化因子，合成細(xì)胞外基質(zhì)（I 和III型膠原），升高細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1,MMP1）、MMP3 和MMP9 的表達(dá)，引發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡、心肌膠原纖維過度沉積，造成心肌纖維化和心室重構(gòu)，最終導(dǎo)致心功能下降及心力衰竭[6-7]。黃芪多糖（astragalus polysaccharides,APS）是黃芪的均一多糖部分，為黃芪主要的活性成分之一。課題組前期研究證實(shí)，APS 可以改善DM 鼠的心臟功能，保護(hù)其心肌組織[8-9]。本研究擬在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討APS 對老年DM 鼠心肌纖維化的干預(yù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 鏈脲佐菌素（streptozocin,STZ,美國Sigma）；APS（中科院上海生理所）；糖化血清蛋白（glycosylated serum protein,GSP）試劑盒（美國Genzyme）；BCA 試劑盒（美國Thermo Fisher）；聚偏二氟乙烯膜（美國Millpoler）；I 型膠原多克隆抗體（美國ADI）；III 型膠原多克隆抗體（復(fù)旦上醫(yī)病理學(xué)系）；羊抗兔二抗（丹麥DAKO）；MMP1 抗體、MMP3抗體、MMP9 抗體、IL-抗體、IL-6 抗體、TGF-抗體、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）1/2 抗體、Jun 激酶（Jun kinase,JNK）抗體、p38 絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activation proteinkinase,MAPK）抗體、核因子（nuclearfactor-,NF- B）/p65 抗體、GAPDH 抗體（英國Abcam）。

1.1.2 主要儀器 小動(dòng)物彩色超聲診斷儀（加拿大VisualsSonics）；微量血糖測試儀（德國Bayer）；超薄切片機(jī)（澳大利亞Leica）；分析天平（德國Sar-torius）；組織研磨儀（美國Qiagen）；垂直電泳槽、蛋白電泳儀（美國Bio-rad）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Applied Biosystems）；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)5427R（德國Eppendorf）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18月齡SPF 級(jí)自然衰老的雄性C57-BL/6J 小鼠30 只[上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司，合格證號(hào)：SCXK（滬）2014-0002]，飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。飼養(yǎng)期間每日12 h 光照，小鼠自由飲水和攝食。

1.3 動(dòng)物分組與干預(yù) 30 只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為對照（NS）組、老年糖尿?。―M）組和老年APS組，每組10 只。老年DM 組和老年APS 組單次腹腔注射STZ（100 mg/kg）[10]；NS 組注射等體積生理鹽水。小鼠糖尿病模型建立成功后，老年APS 組予APS 2 g/kg/d 灌胃16 周[11]，NS 組和老年DM 組予等體積生理鹽水灌胃16 周。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 心臟功能及血流動(dòng)力學(xué) 小鼠麻醉后，使用小動(dòng)物彩色超聲診斷儀獲取超聲心動(dòng)圖。記錄左心室短軸縮短率（leftventricularfractionalshortening,LVFS）、左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure,LVSP）、左心室舒張末期壓（left ventricular end diastolic pressure,LVEDP）、左室內(nèi)壓最大上升速率（maximal change of pressure over time,+dP/dtmax）及左室內(nèi)壓最大下降速率（maximal change of pressure over time,-dP/dtmax）。

1.4.2 血糖和心肌酶譜 干預(yù)16 周后，剪尾采血法測定各組小鼠空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）。頸椎脫臼法處死小鼠，眼球取血后離心取上清，全自動(dòng)生化儀檢測GSP、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、肌酸激酶（creatine kinase,CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes,CK-MB）及乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）水平。

1.5 心肌膠原纖維化評(píng)估 心肌組織制作石蠟切片，HE染色觀察心肌組織病理變化，Masson 染色評(píng)估心肌纖維化程度。免疫組化法檢測I、III 型膠原纖維含量及比值，每組隨機(jī)選取5 個(gè)顯微鏡下無重疊的視野，通過Image J 對染色陽性物質(zhì)進(jìn)行灰度測定。

1.6 Western blot 取心肌組織勻漿裂解，BCA 法測定蛋白含量，SDS-PAGE 電泳分離法將蛋白轉(zhuǎn)膜，5%脫脂乳封閉后與相應(yīng)兔抗鼠一抗4℃孵育過夜，TBTS洗膜后加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育1 h，洗去二抗后ECL 顯色成像。以GAPDH 為內(nèi)參，檢測目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組比較采用單因素方差分析，事后檢驗(yàn)經(jīng)Bonferroni 校正法得2 組間檢驗(yàn)結(jié)果，<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血糖和心肌酶譜比較 與NS 組相比，老年DM 組和老年APS 組BG、GSP、AST、CK、CK-MB 及LDH升高（均<0.01）。與老年DM 組相比，老年APS 組BG、GSP、CK 和CK-MB 降低（均<0.01），2 組AST 和LDH 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。見表1。

表1 3 組血糖和心肌酶譜比較（±s）

表1 3 組血糖和心肌酶譜比較（±s）

注：與NS 組比較，*<0.01；與老年DM 組比較，#<0.01

項(xiàng)目 NS 組 老年DM 組 老年APS 組images/BZ_201_1716_1719_1740_1744.pngimages/BZ_201_2050_1719_2074_1744.pngBG（mmol/L）GSP（ mol/L）AST（U/L）CK（U/L）CK-MB（U/L）LDH（U/L）6.05±0.18 22.94±2.23 77.80±1.30 64.80±1.20 101.70±2.96 0.14±0.01 24.73±2.08*135.85±8.10*222.03±9.40*387.30±7.30*608.00±8.71*0.64±0.02*15.94±1.42*#85.91±4.20*#194.82±8.20*166.22±6.10*#339.00±6.98*#0.47±0.01*648.600 566.200 798.500 14 174.000 16 538.000 5 271.000<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

2.2 心臟功能和血流動(dòng)力學(xué)比較 與NS 組相比，老年DM 組LVFS、LVSP、+dP/dtmax 及-dP/dtmax 降低；LVEDP 升高（均<0.01）。與老年DM 組相比，老年APS 組LVFS、LVSP、+dP/dtmax 及-dP/dtmax 升高；LVEDP 降低（均<0.01）。與NS 組相比，老年APS組LVFS、LVSP 和-dP/dtmax 降低（均<0.01），2 組LVEDP 及+dP/dtmax 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 3 組心臟功能和血流動(dòng)力學(xué)比較（±s）

表2 3 組心臟功能和血流動(dòng)力學(xué)比較（±s）

注：與NS 組比較，*<0.01；與老年DM 組比較，#<0.01

項(xiàng)目 NS 組 老年DM 組 老年APS 組images/BZ_201_1819_2275_1843_2300.pngimages/BZ_201_2085_2275_2109_2300.pngLVFS（%）LVSP（mmHg）LVEDP（mmHg）+dP/dtmax（mmHg/s）-dP/dtmax（mmHg/s）64.00±4.30 97.00±3.30 7.80±1.10 8 197.00±471.00 6 851.00±333.00 36.00±1.15*75.00±1.72*13.10±2.10*5 828.00±236.00*4 706.00±227.00*56.00±1.90*#94.00±2.60*#7.60±0.90#8 129.00±438.00#6 489.00±310.00*#447.300 343.400 61.190 69.870 247.400<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

2.3 心肌膠原纖維化比較 與NS 組相比，老年DM 組心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，膠原纖維明顯沉積，I 型膠原纖維含量和I/III 型膠原纖維比值升高（均<0.01）。與老年DM 組相比，老年APS 組心肌組織排列紊亂現(xiàn)象好轉(zhuǎn)，膠原纖維沉積減少，I 型膠原纖維含量和I/III 型膠原纖維比值降低（均<0.01）。NS 組與老年APS組膠原纖維含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3、圖1。

圖1 3 組心肌病理HE 染色和心肌膠原纖維Masson 染色（×400）

表3 3 組心肌膠原纖維化比較（±s）

表3 3 組心肌膠原纖維化比較（±s）

注：與NS 組比較，*<0.01；與老年DM 組比較，#<0.01

項(xiàng)目 NS 組 老年DM 組 老年APS 組images/BZ_201_1807_2773_1831_2798.pngimages/BZ_201_2081_2773_2105_2798.pngI 型膠原纖維含量III 型膠原纖維含量I/III 型膠原纖維比值3.65±0.23 1.52±0.11 2.12±0.07 5.46±0.29*1.85±0.13 2.67±0.22*3.92±0.14#1.64±0.07 2.14±0.11#240.500 13.910 48.030<0.01<0.01<0.01

2.4 MMPs 和促纖維化因子蛋白表達(dá) 與NS 組相比，老年DM 組心肌細(xì)胞外MMP1、MMP3、MMP9、IL-1 、IL-6 和TGF- 蛋白表達(dá)增多（均<0.01）。與老年DM 組相比，老年APS 組心肌細(xì)胞外MMP1、MMP3、MMP9、IL-1 、IL-6 和TGF-蛋白表達(dá)減少（均P<0.01）。與NS 組相比，老年APS 組MMP3（P=0.018）及IL-1 、IL-6、TGF-（均P<0.01）蛋白表達(dá)增多，2 組MMP1 和MMP9 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

圖2 3 組MMPs 和促纖維化因子蛋白表達(dá)比較

2.5 MAPK 的蛋白磷酸化水平 與NS 組相比，老年DM 組心肌ERK1/2、JNK、p38 MAPK 及NF-/p65蛋白磷酸化水平升高（均<0.01）。與老年DM 組相比，老年APS 組心肌p38 MAPK 及NF- B/p65 蛋白磷酸化水平降低（均<0.01），2 組ERK1/2 和JNK的蛋白磷酸化水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與NS 組相比，老年APS 組ERK1/2、JNK 及p38 MAPK 蛋白磷酸化水平升高（均<0.01），2 組NF- B/p65 蛋白磷酸化水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 3 組ERK1/2、JNK、p38MAPK 和NF- B/p65 磷酸化表達(dá)

3 討論

老年DM 心血管病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，公認(rèn)的經(jīng)典機(jī)制包括心肌能量代謝障礙、氧化應(yīng)激、慢性炎癥、胰島素抵抗和心肌纖維化等。目前認(rèn)為心肌纖維化是老年DM 心血管病的重要發(fā)病機(jī)制之一[12]。心肌纖維化導(dǎo)致心肌廣泛性壞死、間質(zhì)纖維化、心室重構(gòu)及心功能不全等一系列老年DM 心血管病病理過程，最終引發(fā)老年DM 患者的充血性心力衰竭[13-14]。

黃芪主治氣虛，多用于DM 患者心功能不全的配伍治療，臨床觀察確有療效而機(jī)制不明[15]，APS 是黃芪主要的有效活性成分之一[16]。本次研究發(fā)現(xiàn)，APS干預(yù)治療后老年DM 組心肌酶譜恢復(fù)正常，心臟功能改善，血流動(dòng)力學(xué)紊亂得以糾正，提示APS 對老年DM 鼠心血管病有一定的保護(hù)作用。APS 干預(yù)后，老年DM 鼠的心肌IL-、IL-6、TGF-、MMP1、MMP3和MMP9 蛋白表達(dá)減少，I 型膠原纖維含量和I/III 型膠原纖維比值恢復(fù)正常，說明APS 可以延緩老年DM鼠心肌纖維化的發(fā)生與發(fā)展，對老年DM 鼠心臟功能起到有效的保護(hù)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，老年DM 鼠心肌ERK1/2、JNK、p38 MAPK 及其下游基因NF-/p65 的蛋白磷酸化水平增高，而APS 可以降低p38 MAPK 及NF-/p65 的蛋白磷酸化水平?？紤]該現(xiàn)象可能與p38 MAPK/NF-信號(hào)通路調(diào)控的生理過程相關(guān)。

p38 MAPK 作為一類酪氨酸磷酸化蛋白激酶，與心肌膠原沉積及纖維化的調(diào)控關(guān)系密切[17]。而NF-是p38 MAPK 下游重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其表達(dá)活性受p38 MAPK 的正調(diào)控。研究表明，p38MAPK/NF-B 信號(hào)通路的激活是心血管疾病和心肌纖維化反應(yīng)鏈的“基因開關(guān)”[18-19]。此次研究結(jié)果也支持這一理論。目前認(rèn)為持續(xù)的高血糖能激活心肌p38 MAPK/NF-信號(hào)通路，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子，合成炎性蛋白和炎癥介質(zhì)，從而介導(dǎo)老年DM 心血管病的心肌纖維化[20]。

綜上所述，APS 可能通過下調(diào)老年DM 鼠心肌p38 MAPK 及其下游基因NF-的蛋白磷酸化水平，減少老年DM鼠心肌促纖維化因子蛋白和心肌細(xì)胞外MMPs 的蛋白表達(dá)，抑制心肌I 型膠原纖維過度沉積和I/III 型膠原纖維比例失調(diào)，延緩心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展，從而對老年DM 心臟功能起到保護(hù)作用。但APS延緩DM心肌纖維化的具體分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究，未來將進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)深入探討APS 對DM心肌纖維化的抑制作用及其機(jī)制。