胡江，穆匯，周奇興，鄒盈，陳茹艷，趙虎

1.上海普陀區(qū)利群醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200333；2.上海普陀區(qū)利群醫(yī)院呼吸科，上海200333；3.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200040

肺部感染在各類感染疾病中的比例較高，尤其以老年患者更容易發(fā)生呼吸道感染。據(jù)推測(cè)，下呼吸道感染與呼吸道菌群變化之間可能存在密切關(guān)系。以往人們認(rèn)為健康人肺部是無菌的，并且對(duì)呼吸道菌群的研究也主要是依賴傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)。在過去的十多年間，高通量DNA 測(cè)序技術(shù)經(jīng)過不斷完善，已經(jīng)發(fā)展成為一個(gè)高效而精準(zhǔn)的強(qiáng)有力的工具，大大促進(jìn)了基礎(chǔ)和臨床各方面研究的突飛猛進(jìn)。近年來，將該技術(shù)應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)的微生物學(xué)研究之后，發(fā)現(xiàn)健康人肺部存在復(fù)雜的微生物群。但是，采用該技術(shù)深入研究疾病狀態(tài)下呼吸道菌群的變化，目前國內(nèi)外尚未見有報(bào)道。

本研究比較了高通量DNA 測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)的痰涂片和培養(yǎng)方法，檢測(cè)老年肺炎患者痰樣本中的菌群分布，發(fā)現(xiàn)這些患者的下呼吸道都具有豐富的細(xì)菌種類；并且16s rDNA 高通量測(cè)序方法相較傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)更為快速、精準(zhǔn)、靈敏度高。本研究發(fā)現(xiàn)有可能為開發(fā)臨床老年人肺炎患者的檢測(cè)方法提供新的思路。

1 對(duì)象和方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2018年7月-2019年12月上海普陀區(qū)利群醫(yī)院院就診的38 例未經(jīng)治的老年肺炎患者?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥65 歲，診斷為細(xì)菌性肺炎的患者，男女性別不限?；颊吲懦龢?biāo)準(zhǔn)：痰質(zhì)量不合格者和非感染原因如肺栓塞等所致的下呼吸道胸片的改變。細(xì)菌性肺炎感染診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南（2016年版）》[1]。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 痰液樣本的采集 在患者用藥前，使用纖維支氣管鏡置入患者支氣管中吸取其中的分泌物。將收集到的患者的吸痰分成2 份分別置于無菌容器內(nèi)。其中一份于2 h 內(nèi)涂片行革蘭染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)鱗狀上皮細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量及其比值，痰質(zhì)量檢測(cè)合格后觀察菌體形態(tài)特征，進(jìn)行初步鑒定，照相記錄。另外一份密封后于-80℃保存，后續(xù)送合作公司進(jìn)行測(cè)序并分析。

1.2.2 MiSeq 測(cè)序 將-80℃低溫保存的38 例份纖維支氣管鏡吸痰樣本統(tǒng)一送公司進(jìn)行測(cè)序?；蚪MDNA抽提完成后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提質(zhì)量、PCR 擴(kuò)增、熒光定量、Miseq 文庫構(gòu)建及測(cè)序，最后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 經(jīng)Miseq測(cè)序得到的PE reads，首先根據(jù)overlap 關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU 聚類分析和物種分類學(xué)分析。基于OTU 聚類分析結(jié)果，可以對(duì)OTU進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析，以及對(duì)測(cè)序深度的檢測(cè)；基于分類學(xué)信息，可以在多個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 OTU， 多樣性及稀釋曲線分析 對(duì)高通量測(cè)序所得序列進(jìn)行聚類，為了得到每個(gè)OTU 對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier 貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析。本實(shí)驗(yàn)中，16 s 細(xì)菌的比對(duì)數(shù)據(jù)庫為Silva，38 個(gè)樣本的總有效測(cè)序數(shù)目為4385 637 條，總有效堿基數(shù)目為1 839 833 969 bp，每條序列的平均長度為422 bp?？偒@得15 805 個(gè)OTU、3 690 種細(xì)菌。樣本稀釋曲線最終趨于平緩，且測(cè)序深度均值為0.99，說明此次測(cè)序數(shù)量大，測(cè)序深度廣，可以較全面地分析呼吸道菌群信息。 多樣性可以反應(yīng)微生物群落的豐富度（Chao 指數(shù)）、均勻度（Simpson 指數(shù)）、多樣性（Shannon 指數(shù)）、和覆蓋度（Coverage 指數(shù)）。本實(shí)驗(yàn)Chao 指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差較大，Simpsoneven 指數(shù)和Shannon 指數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差較小，標(biāo)本的菌群豐富度比較大，樣本之間存在個(gè)體差異。

2.2 群落組成分析 老年下呼吸道感染人群中含有豐富的細(xì)菌種類。本項(xiàng)研究對(duì)38 例老年肺炎患者，平均年齡（72.5±7.3 歲）的支氣管鏡吸痰樣本進(jìn)行測(cè)序，共獲得50 個(gè)門和1 562 個(gè)屬的細(xì)菌。在門分類水平上，38 個(gè)樣本中豐度從高到低依次為變形桿菌門（Proteobacteria），厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、髕骨細(xì)菌門（Patescibact eria）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）和梭桿菌門(Fusobacteria)等；在屬水平上，豐度從高到低依次為假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈球菌屬（Streptococcus）、普雷沃菌屬（Prevotella）、韋榮氏球菌屬（Veillonella）、霉?jié){菌屬（Mycoplasma）、嗜血桿菌屬（Haemophilus）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和棒桿菌屬（Corynebacterium）等。本研究結(jié)果表明：下呼吸道患者可能都具有豐富的細(xì)菌種類，并且以變形桿菌門的一系列未知分類單元的菌屬占據(jù)優(yōu)勢(shì)。

2.3 痰培養(yǎng)分析 將另外38 個(gè)配對(duì)的痰標(biāo)本進(jìn)行涂片鏡檢，按照標(biāo)準(zhǔn)程序[2]分別接種到血平板、巧克力平板和麥康凱平板上，置35℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育18～24 h 后，觀察菌落形態(tài)；進(jìn)一步將培養(yǎng)陽性的樣本在梅里埃Vitek 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌分析儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)的38 個(gè)樣本，平均每低倍視野鱗狀上皮細(xì)胞數(shù)<10 個(gè)，平均每低倍視野白細(xì)胞數(shù)>25 個(gè)，表明均為合格痰標(biāo)本。其中有23 株分離出咽部正常菌群，陽性率為39.5%。具體革蘭染色和痰培養(yǎng)結(jié)果見表1。

2.4 痰培養(yǎng)與16s rDNA 高通量測(cè)序結(jié)果 比較分析比較傳統(tǒng)痰培養(yǎng)結(jié)果和16s rDNA 高通量測(cè)序結(jié)果，如表1，如果高通量測(cè)序所占豐度最大的菌種與痰培養(yǎng)結(jié)果相同，本研究視兩者具有一致性；由于與本次測(cè)序尚未考慮真菌、病毒等致病微生物，如果高通量測(cè)序所占豐度最大或較大的菌種為非致病菌，本研究視高通量測(cè)序結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果“分離出咽部正常菌群”和“曲霉菌某種屬生長”具有一致性。由此，高通量測(cè)序結(jié)果與傳統(tǒng)痰培養(yǎng)結(jié)果的一致性為50%。

表1 樣本的革蘭染色、痰培養(yǎng)和16srDNA 測(cè)序結(jié)果

3 討論

肺部感染在各類感染疾病中的比例較高，有研究顯示醫(yī)院下呼吸道感染患者占26.75%，尤其以老年患者更容易發(fā)生呼吸道感染[3]。臨床上常根據(jù)患者的臨床癥狀、影像學(xué)檢查（胸片或CT）和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行診斷；采用經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療，同時(shí)送檢痰培養(yǎng)查找病原體，再依據(jù)痰培養(yǎng)病原體檢查結(jié)果及體外藥敏結(jié)果調(diào)整使用有效抗生素。目前，痰標(biāo)本革蘭染色涂片鏡檢仍然是呼吸道感染性疾病診斷的最經(jīng)濟(jì)、有效的方式，可以在半小時(shí)內(nèi)出結(jié)果。合格痰標(biāo)本的涂片結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果的符合率為72.78%[4]，痰涂片鏡檢質(zhì)量直接反應(yīng)痰培養(yǎng)檢出致病菌的可能性[5]。痰液中培養(yǎng)出的病原菌種類及藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)疾病的診斷和指導(dǎo)用藥有著重要的意義[6]。但是，痰涂片和痰培養(yǎng)這兩種方法僅能檢測(cè)部分可染色、可體外培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，對(duì)痕量的、難以染色和培養(yǎng)的微生物卻束手無策，且檢測(cè)靈敏度較低，呼吸道感染患者痰及咽部菌群的真實(shí)種類和占比未有明確參照[7]。這個(gè)特點(diǎn)反映在臨床工作中就是：即使當(dāng)患者有明顯的感染癥狀和體征時(shí)，痰培養(yǎng)的結(jié)果卻常為陰性。如本次研究中，標(biāo)本“PXL-XT”和“WJ-XT”高通量測(cè)序在種水平上所占豐度最大的為銅綠假單胞菌，但是傳統(tǒng)培養(yǎng)并沒有檢出致病菌。因而，許多臨床醫(yī)師認(rèn)為，痰培養(yǎng)結(jié)果對(duì)臨床診治的參考價(jià)值不大，一般還是經(jīng)驗(yàn)性的選用抗菌藥物。盡管現(xiàn)已有大量人體定植菌種可經(jīng)培養(yǎng)技術(shù)得到，但據(jù)估計(jì)超過70%的人體表菌種尚未獲得成功培養(yǎng)[8]。本項(xiàng)研究對(duì)38 例臨床診斷為肺炎的患者進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)，其中有15 例培養(yǎng)為陽性，陽性率與之前報(bào)道的較一致[9]。這表明傳統(tǒng)培養(yǎng)法的檢出陽性率較低；并且與高通量測(cè)序技術(shù)相比，它不能分析微生物群落整體。如表1，韋榮氏球菌屬是厭氧性微小球菌，需厭氧培養(yǎng)；結(jié)核分支桿菌專性需氧，常用羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)2～4 周可見菌落生長；霉?jié){菌又稱支原體，無細(xì)胞壁，人工培養(yǎng)營養(yǎng)要求較高。所以這些標(biāo)本的兩種培養(yǎng)結(jié)果具有一致性。但是奴卡菌繁殖速度慢，一般樣本5～7 d 可見菌落，樣本“YMZ-XT”傳統(tǒng)培養(yǎng)并沒有檢出，屬于漏檢。綜上，38 個(gè)樣本結(jié)果一致性僅為68.4%，傳統(tǒng)培養(yǎng)與高通量測(cè)序結(jié)果相差較大，鑒于此，傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)可能不再是臨床檢測(cè)病原微生物的金標(biāo)準(zhǔn)方法[10]。

微生物多樣性測(cè)序，是利用新一代高通量測(cè)序技術(shù)（NGS）對(duì)樣品中微生物的16S rDNA（或18S rDNA、Internal Transcribed Spacer、功能基因等）高變區(qū)序列進(jìn)行大規(guī)模、高通量測(cè)序，分析特定樣品中微生物群體的構(gòu)成情況或基因的組成以及功能。借助不同樣品中或不同環(huán)境下微生物群落的構(gòu)成差異分析，本研究不僅可以揭示微生物群落的多樣性和結(jié)構(gòu)組成，還可以分析微生物與環(huán)境因素或宿主之間的關(guān)聯(lián)，尋找標(biāo)志性菌群或特定功能的基因，為疾病的診療和微生物資源的開發(fā)提供基礎(chǔ)。本研究NGS 測(cè)序得到15 805 個(gè)OTU，3 690 個(gè)菌種，50 個(gè)菌門，測(cè)序快速，結(jié)果精準(zhǔn)，靈敏度高，檢出率高，檢出范圍廣，檢測(cè)菌種大大增多，信息量更加豐富。但是該方法檢測(cè)費(fèi)用相對(duì)較高，一般實(shí)驗(yàn)室尚未被普及，尚不能完全取代傳統(tǒng)的痰涂片和痰培養(yǎng)技術(shù)。本研究38 個(gè)病例中有5 例治療無效死亡，其中病例“XXD-XT”傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果完全不一致，原因有待挖掘。拋開復(fù)雜的臨床因素，單從技術(shù)層面，本研究認(rèn)為痰培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)該被新技術(shù)取代。

本研究是在纖維支氣管鏡下直接獲取痰標(biāo)本。纖維支氣管鏡是指將內(nèi)窺鏡導(dǎo)入氣管及支氣管內(nèi)，可以直接到達(dá)病灶位置，具有直視下逐級(jí)吸盡氣道內(nèi)的分泌物，沖洗痰痂，有效提高血氧飽和度，改善組織缺氧[11]，損傷小等優(yōu)點(diǎn)，作為預(yù)防肺部感染及痰液藥敏試驗(yàn)不可或缺的手段[12]。這里需要說明的是，本研究選取上海本地西北部具有代表性的老年肺炎患者的吸痰進(jìn)行了高通量測(cè)序，分析的樣本總量較少，尚未考慮更加復(fù)雜細(xì)致的臨床情形，例如：患者的不同性別、是否具有吸煙史等等。下一步將增加樣本量，同時(shí)與未發(fā)生下呼吸道感染的人群作比較，進(jìn)一步探尋老年下呼吸道菌譜特征，深入探討這些菌種分布和構(gòu)成情況與下呼吸道感染發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)等。另外，本研究中尚未考察肺炎患者的真菌和病毒等致病微生物。弄清這些病原體在疾病狀態(tài)下的種類、分布和組成結(jié)構(gòu)，甚至與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)、在疾病診治中的價(jià)值等，將是十分有意義的。這也將是未來研究的努力方向。

綜上，本研究通過比較痰涂片和培養(yǎng)與高通量測(cè)序的檢測(cè)方法，展示了這兩種方法的檢測(cè)特點(diǎn)，說明了高通量測(cè)序法的優(yōu)越性，指出了老年患者肺炎病例檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì),有可能為將來進(jìn)一步開發(fā)檢測(cè)老年肺炎的新方法提供思路；同時(shí)，發(fā)現(xiàn)老年肺炎患者的纖維支氣管鏡吸痰樣本中存在豐富的細(xì)菌種類，從而加深了人們對(duì)疾病狀態(tài)下呼吸道菌群的認(rèn)識(shí)。