楊 涵，靳芙蓉，關統(tǒng)偉，徐紅星，胡小朋，謝 強

(1.西華大學 食品與生物工程學院，成都 610039；2.西寧市農(nóng)業(yè)技術推廣服務中心，西寧 810008；3.成都復興農(nóng)源生物科技有限公司，成都 610039)

2020年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在我國全面實現(xiàn)化肥使用量零增長的基礎上，再次印發(fā)了《2020年種植業(yè)工作要點》的通知，強調繼續(xù)深入開展化肥減量增效行動，保持化肥使用量負增長，拓展有機肥替代化肥的試點范圍。施肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可或缺的重要措施，可以直接或間接影響土壤的理化性質，在全球范圍內被廣泛用于提高土壤肥力和作物產(chǎn)量[1]。自20世紀80年代以來，中國開始在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上大量施用化肥，以滿足人民日益增長的糧食需求[2]。然而，化肥的過量施用也導致了土壤質量的嚴重退化，具體表現(xiàn)為土壤酸化[3]、土壤養(yǎng)分利用率降低[4]、土壤微生物胞外酶活性、呼吸速率以及生物量降低等[5-6]。相比之下，施用有機肥可通過改變土壤物理結構、養(yǎng)分含量、酶活性及微生物群落結構，來降低或消除因長期單施或過施無機肥對土壤質量產(chǎn)生的負面影響，因而逐漸成為提高土壤肥力的優(yōu)先選擇[7]。如Yang等[8]和Xia等[9]均發(fā)現(xiàn)在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中施用有機肥不僅可以增加土壤有機碳含量，還能顯著提高作物產(chǎn)量。

真菌作為土壤微生物的重要組成部分，是評估土壤肥力和健康的關鍵指標之一，其生長的pH和溫度范圍廣，抗逆性強，通常直接參與有機質循環(huán)、養(yǎng)分轉化、重金屬生物吸附及有機污染物降解等重要的土壤生態(tài)過程[10]。此外，與細菌相比，真菌降解復雜有機物的能力更強，還能通過形成菌根與作物共生，在控制植物病害發(fā)生、促進作物生長、維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定等方面發(fā)揮著關鍵作用[11-12]。不同的施肥制度對土壤真菌的影響存在差異。Zhou等[13]的研究表明，長期施加無機肥會降低東北黑土真菌群落多樣性，促進病原真菌的生長。Lang等[14]的報道指出，施用有機肥能改變真菌群落的組成和豐度，并顯著降低了作物根際土壤中黃萎病致病菌--大麗輪枝菌(Verticilliumdahlia)的種群數(shù)量。因此，了解不同施肥制度下真菌群落的變化對選擇最佳施肥方式，改善土壤生態(tài)環(huán)境具有重要意義。近年來已有大量研究報道土壤真菌對有機肥的響應特征，但這些研究多在長期施肥30 a以上的試驗田內進行[15-16]，很少關注3 a以下短期有機肥的施加對土壤肥力和真菌群落的影響。本研究在現(xiàn)有文獻[17]的基礎上加大有機肥施用量，通過Illumina Miseq高通量測序技術，探討有機肥替代部分化肥在2 a內對溫室土壤化學性質和真菌群落結構的影響，以期為有機肥替代化肥在設施農(nóng)業(yè)中的進一步推廣應用提供理論與實踐參考。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗于2017年12月至2019年8月在青海省西寧市多巴鎮(zhèn)進行(36°38′43″N,101°35′36″E)，試驗地點屬高原大陸性氣候，海拔約為 2 457.3 m，年平均降水量為378.3 mm，蒸發(fā)量為 1 451.1 mm，年平均氣溫為4.5 ℃，年均日照時數(shù)2 588.3 h，無霜期140～150 d。試驗區(qū)前茬作物為茄子，采樣時作物為辣椒。試驗前土壤基本理化性質為：pH 8.92，有機質16.31 g/kg，全氮0.89 g/kg，速效磷75.60 mg/kg，速效鉀 192.00 mg/kg。

1.2 試驗設計

試驗在保溫式大棚內進行，共設3個處理：(1)對照組(XN001)：常規(guī)施加100%復合化肥 1 500 kg/hm2；(2)處理組1(XN002)：50%常規(guī)復合化肥+有機肥45 000 kg/hm2；(3)處理組2(XN003)：30%常規(guī)復合化肥+有機肥60 000 kg/hm2。每個處理設置3次重復，共計9個小區(qū)，每個小區(qū)面積為6 m×15 m=90 m2。供試有機肥為潤蒼有機肥(有機質≥45%，N+P2O5+K2O≥5%)，購自四川中農(nóng)潤澤生物科技有限公司；供試化肥為復合肥(N∶P2O5∶K2O=10∶ 15∶25)，購自成都華宏生物科技有限公司。常規(guī)化肥施加量與溫室大棚管理措施均按照當?shù)爻Ｒ?guī)設施農(nóng)業(yè)種植習慣進行。連續(xù)施肥2 a后采樣分析土壤化學性質與真菌群落變化情況。

1.3 樣品采集

2019年8月采用五點法分別鉆取各處理小區(qū)1～30 cm土層土壤，每個處理共計15個土樣，過2 mm篩去雜、均勻混合后，采用四分法留取 1 kg作為一個土壤處理樣本。將每個土壤樣本平均分成兩份，一份置于-80 ℃冰箱保存，用于DNA的提??；另一份自然風干，用于理化指標的測定。

1.4 土壤化學性質測定

土壤化學性質的測定參照鮑士旦[18]的方法。土壤pH測定采用酸度計法(土∶水=1.0∶ 2.5)；土壤全氮(Toal nitrogen,TN)的測定采用半微量凱氏定氮法；土壤速效磷(Available phosphorus,AP)的測定采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀(Available potassium,AK)的測定采用1 mol/L NH4Ac浸提-原子吸收火焰光度法；有機質(Soil organic matter,SOM)測定采用重鉻酸鉀容量法。所有土壤化學性質的測定重復3次。

1.5 土壤微生物DNA提取和高通量測序

采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA kit(Omega Bio-tek,Norcross,GA,United States)試劑盒提取土壤微生物基因組總DNA，操作過程按試劑盒說明書進行。使用帶有Illumina測序平臺標簽序列的已融合通用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對真菌ITS rDNA上的ITS1-ITS2可變區(qū)進行兩輪PCR擴增[19]。第二輪PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測和0.8倍的磁珠(Agencourt AMPure XP)純化回收后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成Illumina MiSeq高通量 測序。

1.6 序列分析

經(jīng)過質量過濾，剩余的高質量序列使用USEARCH(version 5.2.236)在97%的相似水平下聚類為不同的操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTUs)，比對的ITS rDNA參考數(shù)據(jù)庫是UNITE ITS database(http://unite.ut.ee/index.php)。然后用RDP classifier貝葉斯算法對OTU的代表性序列進行物種分類學分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計每個樣本的群落組成。所有序列都保存在NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫中，獲得登錄號為SRR10533228、SRR10533227和SRR10533226。

1.7 數(shù)據(jù)處理

通過分析軟件MOTHUR(version 1.30.1)計算α多樣性指數(shù)(ACE、Chao1、Shannon、Simpson)。用QIIME(version 1.8.0)獲取各組樣本在門和屬分類水平上的真菌群落組成。利用R語言工具(version 3.2)繪制OTU分布維恩圖、Shannon-Wiener曲線和群落物種分布柱狀圖。采用Microsoft Excel 2019和SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行整理和統(tǒng)計分析，包括單因素ANOVA分析和Pearson相關性分析，并采用Duncan’s法進行平均值顯著性多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 土壤化學性質的變化

經(jīng)過連續(xù)2 a的施肥處理，土壤pH、有機質、全氮、速效磷和速效鉀含量均發(fā)生顯著變化(表1，P<0.05)。對照組XN001的土壤pH最高，為8.23，相較之下XN002和XN003的土壤pH分別顯著降低0.28和0.70。隨著有機肥施用量的增加，土壤有機質、全氮、速效磷和速效鉀含量均有顯著增加，與XN001相比，XN002和XN003的有機質含量分別增加35.07%和 102.17%，全氮含量分別增加32.97%和57.14%%，速效磷含量分別增加37.49%和50.69%，速效鉀含量分別增加10.88%和21.77%?？梢姡袡C肥替代部分化肥能提高溫室土壤的養(yǎng)分含量。

表1 不同土壤樣品的化學性質Table 1 Chemical properties of different soil samples

2.2 土壤真菌群落OTU差異分析

OTU分布Venn圖可以清晰地展現(xiàn)不同土壤樣品之間真菌群落的OTU數(shù)目組成、特異性、重疊情況和相似性[20]。本研究在ITS序列中共獲得161 697條高質量序列，在97%的相似水平下共聚類為1 722個OTU。圖1顯示，與對照組XN001相比，處理組XN003的土壤真菌OTU總數(shù)增加3.88%。XN001和XN002共有OTU 32個，XN001和XN003共有OTU 80個，XN002和XN003共有OTU 26個。3個樣品之間共有真菌OTU數(shù)量為74個，僅占總OTU數(shù)目的4.30%，其中XN001獨有的OTU為588個，XN002獨有的OTU為298個，XN003獨有的OTU為624個，各樣品獨有OTU占OTU總數(shù)的17.31%～36.24%。可見，不同土壤樣品之間的真菌群落物種組成存在一定差異。

2.3 土壤真菌群落的Alpha多樣性

Shannon-Wiener曲線反映樣品文庫測序數(shù)據(jù)量的合理性，同時也反映樣品中微生物多樣性的高低(圖2)。隨著測序量不斷增加，各樣品的Shannon指數(shù)增長逐漸趨于平緩，曲線延伸終點處XN001、XN002和XN003的Shannon指數(shù)依次為3.94、1.21和3.13，這表明獲得的測序量足以真實代表溫室土壤真菌群落的多樣性。此外，本研究還在97%相似水平上計算各土壤樣品測序的覆蓋率，結果顯示，各樣品文庫測序覆蓋率均達到99%(表2)，進一步說明本次測序數(shù)據(jù)能夠真實地反映溫室土壤的真菌群落特征。

ACE和Chao1指數(shù)可以反映群落物種豐富度，數(shù)值越大，群落物種豐富度越高。由表2數(shù)據(jù)可知，有機肥替代部分化肥后土壤真菌ACE和Chao1指數(shù)分別表現(xiàn)為XN002>XN003>XN001以及XN003>XN002>XN001。與XN001相比，XN002的ACE指數(shù)增加49.72%，但Chao1指數(shù)僅增加2.55%；XN003的ACE和Chao1指數(shù)則分別增加24.08%和24.29%，說明有機肥替代部分化肥提高了土壤真菌群落的豐富度。此外，Shannon和Simpson指數(shù)用于表征土壤微生物群落多樣性，Shannon值越大，群落多樣性越高；而Simpson值越大，群落多樣性越低。與XN001相比，XN002和XN003的Shannon指數(shù)均有下降，分別降低69.29%和20.56%，符合Shannon-Wiener曲線的變化特征；與Shannon指數(shù)相反，XN002和XN003的Simpson指數(shù)出現(xiàn)上升，分別增加11.4倍和1.8倍。綜合Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的變化可以發(fā)現(xiàn)，有機肥替代部分化肥降低土壤真菌群落的多樣性。

表2 土壤真菌的Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity indices of soil fungi

2.4 土壤真菌群落結構特征

本研究從土壤樣品中獲得的OTUs共歸屬于16個真菌門，其中相對豐度大于1%的真菌門主要有子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)和未分類真菌(unclassified Fungi)(圖3)。子囊菌門的平均相對豐度最高，為47.87%，且在3種處理的土壤中所占比例均達10%以上，是溫室土壤中的最優(yōu)勢菌門。未分類真菌所占比例也較高，其平均相對豐度為38.72%，且在XN002中相對豐度高達85.86%。對于XN001中的真菌群落，子囊菌門、被孢霉門和擔子菌門約占總序列數(shù)的 67.69%，未被分類到已知真菌的序列占 32.11%，其余相對豐度小于1%的真菌只占 0.2%。與XN001相比，XN002的子囊菌門相對豐度降低48.94%，而XN003的子囊菌門相對豐度則提高7.81%；對于擔子菌門，其在XN001和XN002中的相對豐度較低(≤1%)，但在XN003中卻成為僅次于子囊菌門的優(yōu)勢菌門，相對豐度增至13.35%；此外，被孢霉門在所有土壤樣品中僅占1.02%～4.81%。

在屬水平上，所有土壤樣品共獲得229個真菌屬。圖4為相對豐度排名前10的優(yōu)勢菌屬，包括未知真菌屬(unclassified Fungi)、未分類子囊菌門(unclassified Ascomycota)、未分類火絲菌科(unclassified Pyronemataceae)、久浩酵母屬(Guehomyces)、鐮刀菌屬(Fusarium)和被孢霉屬(Mortierella)等。除了未知真菌以外，久浩酵母屬隸屬于擔子菌門，被孢霉屬隸屬于被孢霉門，其余優(yōu)勢菌屬均隸屬于子囊菌門，是子囊菌門序列的主要貢獻者。未知真菌屬是3個土壤樣品共有的優(yōu)勢菌屬，相對豐度為9.13%～85.86%，同時也是XN001和XN002中的最優(yōu)勢屬。XN003中的最優(yōu)勢屬為火絲菌科內的一些未知新屬，相對豐度達36.4%，比XN001和XN002分別高出36.31%和34.24%，次優(yōu)勢屬為久浩酵母屬，相對豐度為12.16%，但該屬在XN001和XN002中均未檢出?？梢园l(fā)現(xiàn)，有機肥替代部分化肥改變了土壤真菌群落結構，使土壤真菌優(yōu)勢屬的組成及其相對豐度發(fā)生變化。此外，由于未知真菌屬在XN002中相對豐度過高，引起物種分布均勻度過低，導致XN002中真菌群落多樣性最低，而XN001和XN003中的真菌群落是由類似相對豐度的多個物種組成的，因此多樣性均高于XN002，這與前文中Alpha多樣性的分析結果 一致。

2.5 土壤真菌群落Alpha多樣性與土壤化學性質的相關性

有研究表明，土壤真菌活性和群落多樣性受土壤結構、pH、溫度、水分、鹽度等多種環(huán)境因子的調節(jié)[10]。本研究Pearson相關性分析顯示(表3)，溫室土壤真菌群落的Alpha多樣性指數(shù)與土壤化學性質如pH、有機質、全氮、速效磷和速效鉀含量存在一定的相關性，但相關性均未達顯著水平(P>0.05)。可以看出，土壤真菌群落Chao1指數(shù)與有機質、全氮、速效磷和速效鉀含量均呈正相關，而與土壤pH呈負相關，說明土壤化學性質能夠驅動真菌群落豐富度的改變；此外，Shannon指數(shù)與土壤pH、有機質、全氮和速效鉀含量的相關系數(shù)均較低，但與速效磷含量呈較好的負相關，說明溫室土壤中速效磷含量是真菌群落多樣性的主要影響因子。

表3 土壤真菌群落Alpha多樣性指數(shù)與土壤化學性質之間的Pearson相關性Table 3 Pearson correlation between Alpha diversity indices of soil fungal communities and soil chemical properties

3 討 論

3.1 有機肥替代部分化肥對土壤肥力的影響

面對日益增加的化肥施用量，需要全球共同制定有效的策略來恢復土壤質量和土著微生物生產(chǎn)力，施加有機肥是一項可行的方案[21]。本研究表明，有機肥替代部分化肥后，土壤有機質、全氮、速效磷和速效鉀含量均顯著高于單施復合化肥處理，這與Bei等[4]在華北平原小麥-玉米輪作地中的研究結果一致。參照全國第二次土壤普查制定的養(yǎng)分分級標準[22]，XN001、XN002和XN003的速效磷含量均處于“很豐富”(>40 mg/kg)水平，達到1級肥力土壤(最高等級)的要求。XN001的速效鉀含量僅處于“中等”(100～150 mg/kg)水平，但增施有機肥后，XN002和XN003的速效鉀含量則提高到“豐富”(150～200 mg/kg)水平，并達到2級肥力土壤的要求。對于全氮含量，XN001處于“缺乏”(0.75～1.00 g/kg)狀態(tài)，XN002和XN003則處于“中等” (1.0～1.5 g/kg)水平，達到3級肥力土壤的要求。土壤有機質作為反映土壤肥力的重要指標[23]，其在XN001和XN002中含量缺乏(10～20 g/kg)，但在XN003中含量達到“中等”(20～30 g/kg)水平以及3級肥力土壤的要求，甚至接近“豐富”(30～40 g/kg)水平?？梢钥闯?，本研究有機肥替代化肥量最多的處理組XN003土壤綜合肥力最高，說明有機肥確實有助于土壤有機質等營養(yǎng)物質的積累，進而提高土壤肥力。此外，有機肥替代部分化肥后土壤pH顯著降低0.28～0.70，這可能是由于有機肥中含有帶羧基和酚羥基的有機酸，這些有機酸能在堿性土壤中積累，從而導致土壤pH下降[24]。

3.2 有機肥替代部分化肥對土壤真菌Alpha多樣性的影響

由ACE和Chao1指數(shù)可知，有機肥替代部分化肥會影響土壤真菌豐富度。Rousk等[25]發(fā)現(xiàn)，在4.0～8.3的pH范圍內，較低的土壤pH有利于真菌生長。本研究增施有機肥后，土壤pH由8.23下降至7.53，且與真菌豐富度呈負相關，這與上述學者的報道相符。此外，Ding等[16]報道稱，真菌豐富度與土壤有機質呈正相關，而本研究則發(fā)現(xiàn)真菌豐富度與土壤有機質、全氮、速效磷和速效鉀含量均呈正相關，且相關系數(shù)為 0.766～0.969?？梢?，有機肥替代部分化肥能通過降低土壤pH和增加土壤養(yǎng)分含量來提高土壤真菌豐富度。觀察Shannon和Simpson指數(shù)的變化可以發(fā)現(xiàn)，增施有機肥會降低土壤真菌多樣性，這與Hartmann等[26]的報道一致，但與Ding等[16]得到的研究結果相反，說明土壤類型、生態(tài)環(huán)境、施肥量以及施肥方式不同，土壤真菌多樣性差異也比較大。另一方面，Bell等[27]認為施肥對土壤微生物多樣性的影響可能與土壤養(yǎng)分含量的變化有關。Siciliano等[28]更加明確地指出磷是土壤細菌和真菌群落多樣性的第二大驅動因子。由于真菌可以借助菌絲在土壤中延伸，增加其對水分和有效磷吸收的表面積，因此真菌對土壤中磷的敏感度高于細菌[29]。本研究Pearson相關分析同樣表明，土壤真菌多樣性主要受到速效磷的調控，且與速效磷含量呈負相關。因此，有機肥替代部分化肥后土壤速效磷含量的增加可能是本研究中土壤真菌多樣性降低的關鍵原因。

3.3 有機肥替代部分化肥對土壤真菌群落結構的影響

子囊菌門為3個處理土壤中的共有優(yōu)勢真菌，這與江蘇小麥-水稻輪作田[30]對土壤真菌群落結構的報道基本一致。子囊菌門大多為腐生菌，是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的主要真菌門和土壤中難降解有機物的重要分解者，在養(yǎng)分循環(huán)方面起著關鍵作用[31-32]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)子囊菌門既能降解多環(huán)芳烴(PAHs)[33]，又對重金屬污染土壤中的銅、鎘、鉛、鋅具有較高的清除率[34]，甚至對鋁脅迫和鈾脅迫也存在較強的耐受性[35-36]。因此，本研究處理組XN003中子囊菌門的相對豐度比對照組XN001高出7.81%，可能對提高土壤肥力、減少重金屬和有機污染物在土壤中的積累起到了一定的積極作用。另一方面，與常規(guī)施化肥相比，有機肥替代化肥量最多的處理組XN003中鐮刀菌屬的相對豐度降低3.87%，被孢霉屬的相對豐度增加1.86%。鐮刀菌屬為常見的土傳性病原菌，不僅是辣椒[37]、番茄[38]、香蕉[39]等作物枯萎病和根腐病的致病因子，還會產(chǎn)生伏馬菌素(FB)等毒素污染小麥、玉米等谷物[40]。被孢霉屬作為一類腐生真菌，是一種潛在的生物控制劑，通常對土壤生態(tài)和作物健康有益，不但能很好地降解土壤中的植物凋落物和芳香烴，而且可以促進作物對磷的吸收，并對某些植物病原體和蟲害具有防治作用[41-42]。由此可見，有機肥替代部分化肥能優(yōu)化土壤真菌群落結構，有效抑制土壤病原真菌的生長，并增加有益真菌的競爭優(yōu)勢，從而改善土壤生態(tài)環(huán)境，減少作物病蟲害的發(fā)生。同時，增施有機肥后，土壤出現(xiàn)了新的優(yōu)勢菌屬，如隸屬于擔子菌門的久浩酵母屬僅在XN003中發(fā)現(xiàn)。久浩酵母屬是一類海洋環(huán)境中常見的需氧型耐冷酵母菌，可分泌海藻糖幫助其抵御不良生活環(huán)境，曾在牛糞和玉米秸稈的堆肥中被檢測為優(yōu)勢屬[43-44]，測試的樣本地點位于高原地區(qū)，比較寒冷，久浩酵母屬的出現(xiàn)可能有助于溫室大棚作物抵御不良環(huán)境。

4 結 論

本研究利用Illumina Miseq高通量測序技術，分析了有機肥替代部分化肥對溫室土壤肥力和真菌群落的影響。有機肥替代部分化肥能在短期內顯著提高土壤肥力，增加土壤真菌群落豐富度，降低土壤真菌群落多樣性，并優(yōu)化土壤真菌群落結構，使有益真菌相對豐度增加，病原真菌相對豐度降低，從而在一定程度上改善溫室土壤生態(tài)環(huán)境。但未來還需要在本研究的基礎上更加深入地揭示有機肥施用量與土壤真菌群落特征之間的關系，確定有機肥最佳施用量，為更加合理地利用有機肥維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性提供科學 依據(jù)。