吳麗莎 朱紅軍

(汕頭市中心醫(yī)院檢驗科，汕頭 515041)

眼部真菌感染是一種治療棘手且易致視力損害的眼部感染性疾患，是致盲的主要因素之一。Paraconiothyriumcyclothyrioides是一種罕見的條件致病性真菌，隨著檢測手段的進步，逐漸可見其感染人類的報道，但目前對其診斷和治療仍然缺乏系統(tǒng)性的數(shù)據(jù)。我院診斷了1例眼外傷導(dǎo)致的Paraconiothyriumcyclothyrioides感染眼內(nèi)炎。盡管對該患者進行了外科治療和氟康唑及伊曲康唑聯(lián)合抗真菌治療，但其感染仍未能得到控制，最終進行了左眼剜除術(shù)。由于實驗室在鑒定這類少見絲狀真菌時緩慢且臨床數(shù)據(jù)有限，導(dǎo)致臨床對這類罕見真菌如Paraconiothyriumcyclothyrioides感染的診治困難，目前主要依賴于外科手術(shù)和抗真菌治療的結(jié)合?，F(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象

患者,男，75歲，因“左眼被竹枝彈傷致視物模糊、紅痛半年”于2017年3月14日來我院就診。眼科檢查顯示：左眼結(jié)膜充血，角膜12點方位至角膜中央可見縱向傷口長約6 mm，其周角膜變性混濁，前房極淺，中軸約1CT，房水混濁+++，傷口附近可見團狀乳白色滲出物，對光反射消失，晶體全乳白混濁。右眼正常。入院后完善相關(guān)檢查后，于2017年3月17日行左眼角膜創(chuàng)口修補、前房取材、沖洗術(shù)，術(shù)中抽取前房沉積物，并送微生物檢查。臨床診斷考慮左眼真菌性眼內(nèi)炎，術(shù)后給予頭孢呋辛、氟康唑、伊曲康唑進行常規(guī)抗菌治療，外用左氧氟沙星滴眼液等。經(jīng)治療后病情有改善，左眼感染有所控制，傷口縫線在位，密閉性可，患者要求出院?；颊叱鲈?個多月后，癥狀反復(fù)，再次來我院就診，因其真菌性眼內(nèi)炎并發(fā)角膜穿孔，晶體脫出嵌頓，眼前節(jié)失去正常結(jié)構(gòu)，無復(fù)明希望，進行左眼眼內(nèi)容剜除術(shù)。術(shù)后繼續(xù)給予伊曲康唑抗真菌治療，癥狀好轉(zhuǎn)。

1.2 方法

菌株培養(yǎng) 將術(shù)中抽取送檢的前房沉積物常規(guī)接種于血平板、麥康凱平板置于35℃培養(yǎng)，2個馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA平板)，1個置于35℃培養(yǎng)，另1個置于25℃培養(yǎng)，并觀察其生長情況。

分子生物學鑒定分析 使用北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司購買的PCR反應(yīng)試劑盒(Takara，R011)對ITS基因序列進行PCR和測序分析。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站genebank序列庫進行比對分析。采用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，分析方法為鄰接法(neighbor joining method)，使用Kimura 2參數(shù)模型，bootstrap次數(shù)設(shè)置為1000。

2 結(jié) 果

培養(yǎng)結(jié)果 PDA培養(yǎng)基25℃生長速度較快，48 h可見菌落生長，直徑約3 cm，初期為淺米色細絨毛狀周邊有白色絨毛圈，表面有皺褶的菌落，隨著培養(yǎng)時間延長，菌落顏色逐漸加深，變?yōu)榛揖G色或橄欖色，周圍有白色絨毛圈，呈柔軟表面有皺折的絨毛狀(見圖1、2)。培養(yǎng)7 d后呈深橄欖色，呈粉末狀擴散的菌落(見圖3)。

該菌在35℃下生長緩慢，4 d左右方可見米粒大小的白色凸起菌落，15 d左右菌落稍有增大，呈皺褶凸起狀，中間黃褐色，外周有白色絨毛圈，氣生菌絲較少(見圖4、5)。

用透明膠紙沾取該菌并用乳酸酚棉蘭染色，鏡下可見大量結(jié)節(jié)狀分隔菌絲，光滑，呈不規(guī)則樹枝樣分枝，未見分生孢子(見圖6)。延長培養(yǎng)時間，進行小培養(yǎng)均未見產(chǎn)孢。

分子生物學鑒定結(jié)果 該菌ITS測序結(jié)果與GenBank中Paraconiothyriumcyclothyrioides對應(yīng)序列的相似度在99%以上，該菌株的ITS序列已經(jīng)提交至Genebank數(shù)據(jù)庫，序列號為MK903525。利用MEGA7.0構(gòu)建的基于ITS序列的種系發(fā)生樹如圖7所示，可見其與Paraconiothyriumcyclothyrioides序列一致。

3 討 論

本病例的患者因竹子劃傷眼睛后導(dǎo)致真菌性眼內(nèi)炎，經(jīng)常規(guī)細菌培養(yǎng)及ITS測序后確認為Paraconiothyriumcyclothyrioides感染的真菌性眼內(nèi)炎，該患者經(jīng)常規(guī)手術(shù)和抗真菌藥物治療后效果不佳，病情進一步惡化，隨后進行左眼眼內(nèi)容剜除術(shù)，喪失一側(cè)視力。經(jīng)衛(wèi)生部醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目查新報告顯示國內(nèi)未見有Paraconiothyriumcyclothyrioid感染性眼內(nèi)炎的公開研究報道，所以這是國內(nèi)首次報導(dǎo)的由Paraconiothyriumcyclothyrioides引起的真菌性眼內(nèi)炎。

本病例中培養(yǎng)到的Paraconiothyriumcyclothyrioides的特點主要有以下幾個方面：①生長速度：25℃生長快速，2 d即可見明顯的淺綠色毛絨狀菌落，直徑約3 cm，4 d左右成熟；35℃生長緩慢，4 d左右可見小且凸起的白色菌落，直徑約0.5 cm，延長培養(yǎng)時間至15 d其菌落約生長至1 cm；②菌落形態(tài)：25℃培養(yǎng)初期呈淺米色毛絨狀菌落，隨培養(yǎng)時間延長顏色逐漸加深，呈灰綠色，外周有白色絨毛，菌落中央有放射狀溝，氣生菌絲較豐富；35℃培養(yǎng)初期呈針尖樣突起皺褶的白色菌落，隨培養(yǎng)時間延長變化不大，菌落稍有增大且凸起，表面凹凸不平有皺褶，顏色稍有加深變淺綠色，氣生菌絲少；③鏡下形態(tài)：25℃和35℃培養(yǎng)鏡下均未能見到孢子，可見密集的竹節(jié)樣分隔菌絲，光滑呈不規(guī)則樹枝樣分枝。④該菌形態(tài)學沒有典型的結(jié)構(gòu)，因此很難從形態(tài)學對其進行鑒定，ITS測序結(jié)果與GenBank中Paraconiothyriumcyclothyrioides對應(yīng)序列的相似度在99%以上，該菌株的ITS序列已經(jīng)提交至Genebank數(shù)據(jù)庫，序列號為MK903525；⑤由于該菌株不產(chǎn)孢，故未能進行藥敏試驗。

Paraconiothyriumcyclothyrioides是引起人類真菌感染的一種罕見真菌，是一種條件致病性真菌，目前認為其危險因素包括免疫抑制和外傷等。該菌最早于1995年在巴布亞新幾內(nèi)亞收集的土壤樣品中分離出來[1]，其臨床報導(dǎo)病例較少。

圖1 PDA 25℃ 培養(yǎng)48 h，菌落呈淺米色細絨毛狀，周邊有白色絨毛圈，表面有皺折 圖2 PDA 25℃ 培養(yǎng)96 h,菌落顏色逐漸加深，呈灰綠色 圖3 PDA 25℃ 培養(yǎng)7 d，菌落顏色加深為深橄欖色，呈粉末狀擴散 圖4 PDA 35℃ 培養(yǎng)96 h，生長緩慢 圖5 PDA 35℃ 培養(yǎng)15 d，菌落呈呈皺折凸起狀，中間黃褐色，外周有白色絨毛圈，氣生菌絲較少 圖6 乳酸酚棉蘭染色鏡下形態(tài)，可見大量結(jié)節(jié)狀分隔菌絲，光滑，呈不規(guī)則樹枝樣分枝，未見分生孢子(×40)

圖7 該菌與Genebank其他近源菌株ITS序列系統(tǒng)發(fā)生分析圖

2007年Balajee等[2]最早報道了1例接受肝臟移植的3歲兒童，移植后1年在一側(cè)下肢出現(xiàn)一潰爛病變，并從其病變部位培養(yǎng)到絲狀真菌，其測序結(jié)果為Paraconiothyriumcyclothyrioides，但該報道沒有提供關(guān)于感染的臨床進展和治療信息。

2012年Rachel等[3]報道了1例腎移植患者因Paraconiothyriumcyclothyrioides感染引起的下肢皮膚感染潰爛的病例，該患者在腎移植后左膝前內(nèi)側(cè)出現(xiàn)一無痛、無瘙癢的潰爛斑塊，在治療開始口服伏立康唑(200 mg/12 h)，但效果不佳，隨后從病變部位的活檢物中培養(yǎng)到絲狀真菌，經(jīng)ITS測序后確定為Paraconiothyriumcyclothyrioides，患者開始使用兩性霉素B脂質(zhì)復(fù)合物(靜脈注射400 mg/d)和米卡芬凈(靜脈注射100 mg/d)。但由于患者肌酐水平升高，出現(xiàn)腎損害，于是停用兩性霉素B和米卡芬凈，改用泊沙康唑(口服400 mg/12 h)治療。在使用泊沙康唑治療后10 d，該患者的皮損病變明顯改善。出院后繼續(xù)使用泊沙康唑持續(xù)治療4周。隨后其病變完全消失痊愈。同時該報道研究表明Paraconiothyriumcyclothyrioides在PDA上生長時， 27℃時生長速度最佳，而在35℃時生長最慢，該菌在PDA 25℃培養(yǎng)6 d可見羊毛狀灰橄欖色外周有白色絨毛圈菌落，可見其生長溫度、生長速度及菌落形態(tài)均與本研究相符合。同時該研究還在25℃條件下用CLA瓊脂(carnation leaf agar)培養(yǎng)4周后，鏡下可見有紅棕色、透明的圓柱形厚壁分生孢子，由此可見Paraconiothyriumcyclothyrioides需要在特定的培養(yǎng)基及較長的培養(yǎng)時間方可產(chǎn)生分生孢子。

由于本研究中實驗條件有限，且該菌株不產(chǎn)孢，故本研究未能進行藥敏試驗，且該菌的體外藥敏試驗尚無標準，目前沒有相關(guān)的藥敏報道。Rachel[3]認為Paraconiothyriumcyclothyrioides在對唑類抗真菌藥物敏感性方面存在差異性，該患者對伏立康唑治療沒有效果，但在改為泊沙康唑治療后有明顯的療效，其病灶消退并痊愈。而兩性霉素B因為其腎毒性停藥，無法判斷其療效。本研究中的患者使用氟康唑和伊曲康唑治療后效果不佳，最終因真菌性眼內(nèi)炎并發(fā)角膜穿孔，晶體脫出嵌頓，采取手術(shù)切除左眼后治愈，可見Paraconiothyriumcyclothyrioides對抗真菌藥存在明顯的差異性，其藥物敏感性仍需進一步研究，可見臨床治療中若能對少見真菌進行早期準確鑒定，臨床治療中就可參考相關(guān)文獻及根據(jù)實際情況進行抗真菌藥物的選擇和更換。

眼部真菌感染具有難治療、預(yù)后差的特點，是致盲的主要原因之一。引起眼部真菌感染的主要致病菌為鐮刀菌等,但也有許多無法通過形態(tài)學鑒定的不產(chǎn)孢的絲狀真菌。何宏等[4]對眼部真菌感染的患者中分離到的不產(chǎn)孢子菌進行ITS測序，19株不產(chǎn)孢子菌包括可可毛色二孢子菌6株、月狀彎孢霉1株、節(jié)菱孢霉菌2株、Neodeightoniasubglabosa2株、紅貝菌1株、肉座菌1株、多喙莖點霉1株、紅色毛癬菌1株、深海曲霉菌1株、Roussoellasiamensis1株、撕列蠟孔菌1株、茄病鐮刀菌1株。不產(chǎn)孢子菌在眼病致性真菌譜中占據(jù)非常重要的位置(僅次于鐮刀菌)，而Paraconiothyriumcyclothyrioides目前國內(nèi)仍未見報道。ITS基因測序可準確地鑒定不產(chǎn)孢子菌的種屬。

基因序列分析被認為可作為絲狀真菌鑒定的“金標準”[5]，位于核糖體RNA基因大小亞單位之間的ITS序列分析可將大多數(shù)真菌鑒定到種，ITS即內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，是真菌核糖體RNA基因中度保守區(qū)域，在生物進化中能容忍更多的變異，不同種屬真菌的ITS序列表現(xiàn)出較高的特異性，且片段短易于擴增，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于絲狀真菌的鑒定[6,7]。

Paraconiothyriumcyclothyrioides是一種罕見的條件致病性真菌，免疫功能低下和外傷是重要的高危因素，其形態(tài)學沒有特征性，難以從形態(tài)學進行鑒定，本病例是國內(nèi)首次報導(dǎo)的由Paraconiothyriumcyclothyrioides引起的真菌性眼內(nèi)炎。目前絕大多數(shù)實驗室對絲狀真菌的鑒定主要依賴于形態(tài)學鑒定，但由于絲狀真菌各類繁多、形態(tài)各異，對于形態(tài)結(jié)構(gòu)不典型或少見的絲狀真菌，傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法往往不能得到準確的鑒定，需要借助于基因序列分析。同時本研究的病例提示對于外傷性眼部感染在常規(guī)抗菌藥物治療無效，病情持續(xù)進展的情況下除考慮常見的真菌感染外，還應(yīng)特別注意少見真菌的感染，及時進行基因測序及更換合適的抗真菌藥物。