劉 領(lǐng),馬宜林,悅飛雪,喬鑫鑫,尹 飛,王艷芳

河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,洛陽 471023

叢枝菌根(arbuscular mycorrhizal, AM)真菌是一類分布廣泛(能與80%以上植物根系形成共生體)且數(shù)量豐富(占土壤總微生物生物量的30%以上)的土壤有益微生物,AM真菌對(duì)土壤N素循環(huán)起著重要作用,可以顯著影響N素的吸收與礦化、生物固N(yùn)、硝化和反硝化,以及N素的淋失等諸多土壤氮素循環(huán)過程[5]。已有研究表明,AM真菌影響農(nóng)田N2O排放的潛在機(jī)理主要為：AM真菌可以通過改變作物-土壤系統(tǒng)的水分關(guān)系、影響土壤結(jié)構(gòu)和土壤通氣性能來調(diào)控N2O排放；AM真菌能夠通過競爭吸收氮素來調(diào)控N2O排放；AM真菌可以通過改變根際沉積過程來調(diào)控N2O排放,接種AM真菌能夠改變植物根系分泌物的組成及數(shù)量,從而導(dǎo)致根際及菌根際微生物群落發(fā)生變化,包括硝化、反硝化細(xì)菌群落來調(diào)控N2O排放[6-8]。

生物炭是一些農(nóng)作物秸稈、薪柴、雜草、糞便等生物質(zhì)在缺氧或低氧條件下通過高溫裂解后的富碳固體產(chǎn)物。近年來,國內(nèi)外學(xué)者對(duì)生物炭在改良土壤、提高作物產(chǎn)量、碳固存、溫室氣體減排等方面進(jìn)行了研究[9-12],特別是農(nóng)田施用生物炭對(duì)N2O排放的影響機(jī)制得到了廣泛的關(guān)注。一些研究表明,農(nóng)田施入生物炭可以通過影響硝化、反硝化功能基因來影響土壤N2O排放[7, 13]。另外一些研究表明,生物炭對(duì)AM真菌具有特別的促進(jìn)作用,生物炭影響土壤AM真菌的機(jī)制主要表現(xiàn)在：生物炭改善土壤理化特性有利于AM真菌孢子的萌發(fā)和生長；生物炭調(diào)節(jié)植物-真菌信號(hào)物質(zhì)影響AM真菌的萌發(fā)和菌絲的分枝；生物炭可能通過影響土壤中的解磷細(xì)菌活性,從而間接影響AM真菌[14-16]。

基于N2O排放是一系列復(fù)雜土壤生態(tài)過程的綜合反映,并受到多種生物和非生物因素的交互影響。生物炭輸入是如何調(diào)節(jié)土壤硝化、反硝化功能基因和AM真菌的,以及他們之間的關(guān)系需要進(jìn)一步了解。目前多數(shù)研究主要針對(duì)生物炭對(duì)AM真菌的影響[15,17]或生物炭對(duì)N轉(zhuǎn)化相關(guān)功能基因及N2O釋放的影響[3,13],然而對(duì)施入生物炭對(duì)土壤AM真菌及N轉(zhuǎn)化相關(guān)功能基因的影響以及它們之間的關(guān)系研究較少。

河南省西部(豫西)位于黃土丘陵區(qū),屬暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候,土壤類型為褐土,旱地農(nóng)業(yè)在該地區(qū)占據(jù)重要地位,由于農(nóng)田化肥使用量大,成為N2O的重要排放源[9]。本研究以豫西地區(qū)旱地玉米農(nóng)田為研究對(duì)象,探討生物炭施入后對(duì)土壤理化性質(zhì)、N轉(zhuǎn)化相關(guān)功能基因豐度、AM真菌及N2O釋放的影響,并探討它們之間的相關(guān)性,以期為旱地農(nóng)田合理施用生物炭實(shí)現(xiàn)N2O減排提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在河南省洛陽市河南科技大學(xué)開元校區(qū)農(nóng)場(34°41′N,112°27′E)進(jìn)行。該地區(qū)年均氣溫13.7 ℃,年均無霜期216 d,年降水量約600—800 mm,主要分布在6—8月,作物種植方式為小麥-玉米輪作,土壤類型為褐土,土壤基本理化性質(zhì)為：pH值為7.4,有機(jī)質(zhì)含量為15.1 g/kg,總氮1.0 g/kg,堿解氮78.6 mg/kg,速效磷9.2 mg/kg,速效鉀116.5 mg/kg,粘粒、粉粒、砂粒比例分別為20.34%、30.87%、48.79%。

1.2 試驗(yàn)材料

供試的玉米品種為“鄭單958”,供試生物炭材料為小麥秸稈生物炭(河南商丘三利新能源有限公司,熱裂解炭化溫度350—450℃),生物炭基本理化性質(zhì)為：pH 值10.4,比表面積為8.92 m2/g,有機(jī)碳為52.2%,全氮為5.9 g/kg,全磷為0.89 g/kg,全鉀為23.2 g/kg。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年6月5日開始,9月10日結(jié)束。試驗(yàn)期內(nèi)總降雨量為428.3 mm,與常年相比,屬于平水年。生物炭用量共設(shè)3個(gè)處理：T0：對(duì)照,不施用生物炭；T1：施用生物炭20 t/hm2；T2：施用生物炭40 t/hm2；每處理重復(fù)3次,共9個(gè)小區(qū),小區(qū)面積32 m2(4 m×8 m)。2019年6月5日種植玉米,行距為60 cm,株距為25 cm,種植密度為67000 株/hm2,各處理施氮量225 kg N/hm2,以含氮量46%的尿素為氮源,分2次施用,其中基肥占60%,大喇叭口期追肥占40%。各處理施磷肥40 kg P/hm2,鉀肥80 kg K/hm2,分別以含P2O512%的過磷酸鈣和含K2O 45%的硫酸鉀作為肥源。生物炭、基施氮肥、磷肥和鉀肥均在播前撒于地表后微耕機(jī)翻耕,與10 cm左右土層混合均勻,大喇叭口期在玉米壟一側(cè)距離植株5—6 cm處采用點(diǎn)種器追施氮肥,穴深6—8 cm,施入氮肥后立即覆土。試驗(yàn)期間采用雨養(yǎng)方式,不進(jìn)行灌溉,定期除草。

1.4 測定項(xiàng)目與方法

1.4.1N2O排放通量測定

本試驗(yàn)于追肥后第2天開始進(jìn)行氣體樣品采集,每2天采樣1次,連續(xù)采樣4次恢復(fù)為5—7 d采樣1次,強(qiáng)降雨后第2天開始每2天采樣1次,連續(xù)采樣3次恢復(fù)為5—7 d采樣1次,采氣直至成熟期。采用密閉式靜態(tài)箱法測定N2O排放通量,箱體由有機(jī)玻璃制作而成,包括底座和頂箱兩部分。頂箱長、寬、高均為50 cm,箱體外側(cè)包有一層2.5 cm厚的聚苯乙烯泡沫板,以減小采樣時(shí)因太陽輻射所引起的箱內(nèi)溫度變化,箱內(nèi)安裝風(fēng)扇以將箱內(nèi)氣體混勻。底座長、寬、高分別為50 cm、50 cm、15 cm,底座上緣有1.5 cm深的凹槽,待玉米發(fā)芽后將底座隨機(jī)安置在不同處理的小區(qū),插入土層5 cm 深處,整個(gè)生長季不再移動(dòng),不同處理小區(qū)安置5個(gè)底座,底座內(nèi)種植兩棵玉米,玉米長至九葉期折斷,只留45 cm高度[17]。

采集氣體時(shí)將頂箱套在底座凹型槽內(nèi),將水注入凹槽加以密封。采樣時(shí)間為08:00—10:00,分別于罩箱后0、10、20、30 min 用40 mL注射器采集箱內(nèi)氣體40 mL,將采集的氣體注射入40 mL的已抽為真空的集氣瓶中,帶回試驗(yàn)室檢測。采用島津氣相色譜儀(GC-2010)測定N2O氣體濃度,電子捕獲檢測器(ECD)檢測N2O含量。

N2O 排放通量計(jì)算公式為：

(1)

式中,F為N2O排放通量(μg m-2h-1)；T為采樣箱內(nèi)的平均溫度(℃)；ρ為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下N2O氣體密度,值為1.977 g/L；h為采氣箱高度(m)；dc/dt為采氣箱內(nèi)N2O濃度變化率(mL L-1min-1)。

N2O累積排放量的計(jì)算公式如下

(2)

式中,M為土壤N2O累積排放量(μg/m2)；F為N2O排放通量(μg m-2h-1)；i為采樣次數(shù)；ti+1-ti為采樣間隔天數(shù)。

1.4.2土壤DNA提取、土壤pH、含水量、容重、有機(jī)碳、土壤全氮、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮測定

玉米追肥后10 d,處于玉米抽雄、開花期,是由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長的關(guān)鍵時(shí)期,肥水需求量大,生理比較活躍,我們?nèi)≡摃r(shí)期土壤測定土壤理化性質(zhì)和提取土壤DNA。采用環(huán)刀法取0—20 cm土層測定土壤容重,用抖根法[18]采集玉米根際土壤,一個(gè)小區(qū)取3個(gè)土壤樣品,一部分土壤樣品儲(chǔ)存在-80℃ 冰箱用于土壤DNA提取,一部分土壤用于測定土壤pH、含水量、土壤有機(jī)碳、土壤全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(EE-GRSP)和總球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(T-GRSP)。土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮采用連續(xù)流動(dòng)分析儀(SAN++,Skalar,荷蘭)測定；土壤含水量采用烘干法進(jìn)行測定；土壤pH值采用pH計(jì)測定(上海精密科學(xué)儀器有限公司,雷磁pHS-3C),水土比為5∶1。土壤有機(jī)碳(SOC)測定采用外加熱、重鉻酸鉀(K)容量法[19]；全氮(TN)采用凱氏定氮法(2300全自動(dòng)定氮儀, Sweden)測定[20]。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。

采用Fast DNASPIN Kit for Soil(MP Biomedicals,美國)提取土壤DNA,操作步驟按照試劑盒操作說明進(jìn)行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性,用紫外分光光度計(jì)(NanoDrop2000,Thermo Fisher Scientific,美國)測定DNA濃度及質(zhì)量。檢測質(zhì)量合格的DNA樣品交由上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進(jìn)行熒光定量PCR分析。

1.4.3AM真菌侵染率和球囊霉素相關(guān)土壤蛋白的測定

使用抖根法取好土壤樣品后,仔細(xì)收集玉米根系,用清水清洗干凈,用于AM真菌侵染率的測定。AM真菌侵染率采用Bierman & Linderman(1981)的方法測定[21]。易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(EE-GRSP)、總球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(T-GRSP)采用李少朋等[22]的方法測定。

1.4.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

本試驗(yàn)選取土壤中AM真菌、氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細(xì)菌(AOB)的氨單加氧酶(amoA)基因、亞硝酸鹽還原酶(nirK、nirS)基因和氧化亞氮還原酶(nosZ)基因進(jìn)行定量分析,在ABI7500型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems, 美國)進(jìn)行熒光絕對(duì)定量PCR分析。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為20 μL,其中包含10 μL的 ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix(2X)(南京諾唯贊生物科技有限公司),前后引物(5μmol L-1)各0.8 μL,1 μL DNA模板,7.4 μL超純水。具體PCR引物和擴(kuò)增條件見表1,每個(gè)樣品重復(fù)3次。分別以含有AM真菌基因、氨氧化古菌amoA基因、氨氧化細(xì)菌amoA基因、亞硝酸鹽還原酶(nirK、nirS)基因和一氧化二氮還原酶(nosZ)基因的重組PMD18-T載體作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,然后計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù),10倍梯度稀釋構(gòu)建好的各質(zhì)粒,90μL 稀釋液+10μL 質(zhì)粒,一般做4—6個(gè)點(diǎn),通過預(yù)實(shí)驗(yàn)分別選取AOA 標(biāo)準(zhǔn)品的10-2—10-6稀釋液、AM、AOB、nirS、nosZ 標(biāo)準(zhǔn)品的10-2—10-7稀釋液、nirK標(biāo)準(zhǔn)品的10-2—10-5稀釋液用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算基因豐度。

表1 熒光定量PCR擴(kuò)增引物和反應(yīng)條件

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD法比較不同處理間的差異顯著性(P<0.05),采用Pearson相關(guān)分析對(duì)生物炭施用量、土壤pH值、含水量、容重、土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮,有機(jī)碳、土壤各基因豐度與N2O排放通量之間相關(guān)性和顯著性進(jìn)行分析,差異極顯著為P<0.01,差異顯著為P<0.05。采用Origin 10.0 軟件繪圖。利用R 2.7.1軟件里的“gbmplus”統(tǒng)計(jì)包,進(jìn)行聚類推進(jìn)樹(Aggregated boosted tree, ABT)分析土壤因子、硝化、反硝化功能基因和AM真菌豐度對(duì)N2O排放量的相對(duì)重要性。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)變化

由表2可知,不同生物炭處理?xiàng)l件下,土壤理化性質(zhì)發(fā)生相應(yīng)變化。隨著生物炭施用量的增加,土壤pH和土壤含水量呈增加趨勢,但均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。施加生物炭顯著降低土壤容重,T1和T2處理土壤容重分別較T0顯著降低3.97%和8.78%(P<0.05)；施加生物炭顯著提高土壤有機(jī)碳含量,T1和T2處理土壤有機(jī)碳含量分別較T0顯著提高38.44%和71.01%(P<0.05)；與T0相比,T1處理土壤全氮含量未達(dá)到顯著水平(P>0.05),T2處理顯著提高土壤全氮含量,較T0處理顯著提高14.87%(P<0.05)；添加生物炭土壤硝態(tài)氮含量顯著降低,與T0相比,T1和T2處理土壤硝態(tài)氮含量分別減少10.57%和21.40%(P<0.05),T1和T2兩處理間未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。添加生物炭后土壤銨態(tài)氮含量顯著高于不添加生物炭處理,T1和T2處理土壤銨態(tài)氮含量分別較T0顯著增加15.89%和30.46%(P<0.05)。

表2 不同生物炭處理土壤理化性質(zhì)

2.2 不同生物炭處理對(duì)硝化、反硝化功能基因豐度的影響

2.2.1不同生物炭處理對(duì)AOA-amoA、AOB-amoA基因豐度的影響

由圖1可知,各處理土壤AOA-amoA基因拷貝數(shù)顯著高于AOB-amoA。隨著生物炭施用量的增加,AOA-amoA基因豐度顯著降低(P<0.05),表現(xiàn)為T0>T1>T2。T0、T1和T2處理下AOA-amoA基因豐度分別為7.57×109、4.92×109和2.50×109拷貝/g,T1和T2處理分別較T0處理顯著降低35.07%和66.96%(P<0.05)。與T0相比,TI和T2處理的AOB-amoA基因豐度顯著下降(P<0.05),但T1和T2處理未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。T0、T1和T2處理下AOB-amoA基因豐度分別為3.60×106、2.02×106、2.36×106拷貝/g,T1和T2分別較T0處理顯著降低43.83%和34.58%(P<0.05)。說明生物炭對(duì)旱地玉米土壤AOA和AOB生長具有抑制作用。

圖1 不同生物炭處理下氨氧化細(xì)菌、氨氧化古菌基因豐度

2.2.2不同生物炭處理對(duì)反硝化基因豐度的影響

由圖2可知,隨著生物炭施用量的增加,nirK基因豐度顯著降低(P<0.05),表現(xiàn)為T0>T1>T2。T0、T1和T2處理下nirK基因豐度分別為1.08×1010、7.33×109、6.16×109拷貝/g,T1和T2分別較T0處理顯著降低31.90%和42.78%(P<0.05),T1和T2兩處理間無顯著差異(P>0.05)。隨著生物炭施用量的增加nirS基因豐度降低,表現(xiàn)為T0>T1>T2,T0、T1和T2處理下nirS基因豐度分別為3.57×107、3.12×107、1.90×107拷貝/g,T1和T0兩處理間無顯著差異(P>0.05),T2分別較T0和T1處理顯著降低46.69%和38.91%(P<0.05),說明生物炭能夠抑制反硝化反應(yīng)進(jìn)程。施加生物炭nosZ基因豐度增加,表現(xiàn)為T1>T2>T0。T0、T1和T2處理下nosZ基因豐度分別為2.11×107、3.74×107、2.92×107拷貝/g,以T1處理nosZ基因豐度最高,T1和T2處理分別較T0顯著提高77.28%和38.33%(P<0.05),說明施用生物炭能夠促進(jìn)nosZ基因表達(dá),加快了N2O還原進(jìn)程。(nirK+nirS)/nosZ的比值越大表明排放N2O的能力越強(qiáng)。由圖2可知,生物炭處理顯著降低(nirK+nirS)/nosZ的比值(P<0.05)。與T0處理相比,T1和T2處理顯著降低(nirK+nirS)/nosZ的比值(P<0.05),但T1和T2處理之間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同生物炭處理下反硝化基因豐度

2.3 生物炭對(duì)旱地玉米農(nóng)田土壤AM真菌的影響

由表3可知,隨著生物炭施用量的增加,菌根侵染率隨之增加,與T0相比,T1和T2處理均顯著增加菌根侵染率(P<0.05),但T1和T2處理差異不顯著(P>0.05)。隨著生物炭施用量的增加AM真菌基因豐度顯著增加(P<0.05),表現(xiàn)為T2>T1>T0。T1和T2分別較T0處理顯著提高71.88%和115.88%(P<0.05),說明生物炭對(duì)AM真菌生長具有明顯的促進(jìn)作用。施加生物炭顯著提高土壤總球囊霉素相關(guān)土壤蛋白和易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白含量,T1和T2處理土壤總球囊霉素相關(guān)土壤蛋白含量分別較T0顯著提高20.67%和34.36%(P<0.05),T1和T2處理土壤易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白含量分別較T0顯著提高17.40%和43.50%(P<0.05)。

表3 不同生物炭處理AM真菌侵染率、總球囊霉素相關(guān)土壤蛋白和易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白含量

2.4 生物炭對(duì)旱地玉米生長期N2O排放通量的影響

玉米大喇叭口期追肥后N2O排放通量和累積排放量動(dòng)態(tài)變化如圖3所示。在不同時(shí)期,施加生物炭處理的N2O排放通量均低于不施生物炭處理,N2O排放通量具體表現(xiàn)為：T0>T1>T2。追肥(7月24日)后,不同處理N2O排放通量的變化趨勢基本一致,均表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢。追肥(7月24日)后第1天 N2O排放量升高,追肥后第3天出現(xiàn)排放峰最高值,T0、T1、T2處理下N2O排放通量分別為522.14、409.35和382.35 μg m-2h-1,T1、T2處理分別較T0處理降低21.60%和26.77%。強(qiáng)降雨(8月6日)后第2天,出現(xiàn)第二次排放峰,T0、T1、T2處理N2O排放通量分別為210.59、158.04、139.63 μg m-2h-1,T1、T2處理分別較T0處理降低24.95%和33.70%。8月14日和8月21日降雨后又出現(xiàn)兩次排放峰?？偟膩碚f,施用生物炭降低旱地玉米土壤N2O排放,且施肥和降雨后會(huì)引起N2O排放量增加。

由圖3可知,隨著生物炭施用量的增加N2O累積排放量呈減少趨勢,表現(xiàn)為T0>T1>T2。施加生物炭顯著降低N2O累積排放量(P<0.05),T0、T1和T2處理下的N2O累積排放量分別為162.97、136.38、120.56 mg/m2,T1和T2分別較T0處理顯著降低16.31%和26.02%(P<0.05),說明施用生物炭對(duì)降低旱地玉米土壤N2O排放具有積極作用。

圖3 生物炭對(duì)旱地玉米農(nóng)田土壤N2O排放通量的影響

2.5 生物炭施用量與AM真菌及N轉(zhuǎn)化相關(guān)功能基因豐度的相關(guān)性分析

如表4所示,為生物炭施用量與AM真菌及N轉(zhuǎn)化相關(guān)功能基因豐度的相關(guān)分析,AM真菌基因豐度與生物炭施用量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；AOA、AOB、nirK、nirS基因豐度與生物炭施用量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)；nosZ與生物炭施用量未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。其中,nirK基因豐度與生物炭施用量的相關(guān)性系數(shù)最大,為-0.763,說明nirK基因豐度受生物炭施用量影響較大。

表4 生物炭施用量與各功能基因豐度的相關(guān)關(guān)系分析

2.6 N2O排放通量與硝化、反硝化功能基因、AM真菌基因豐度的相關(guān)性分析

由表5可知,AM真菌、nosZ基因豐度和N2O排放通量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),AOA、nirK、nirS和N2O排放通量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),AOB與N2O排放通量未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。說明AM真菌、AOA、nosZ、nirK和nirS是影響N2O排放的主要因子。

表5 N2O排放通量與各功能基因豐度的相關(guān)關(guān)系分析

2.7 N2O排放通量與土壤各因子的相關(guān)性分析

N2O排放通量與土壤各因子的相關(guān)性分析如表6所示。由表6可知,土壤含水量與N2O排放通量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),N2O排放峰出現(xiàn)在降雨后,土壤水分是影響N2O排放的主要因子。土壤容重、pH和總球囊霉素相關(guān)土壤蛋白含量與N2O排放通量未達(dá)到顯著水平(P>0.05)；土壤有機(jī)碳含量與N2O排放通量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白含量、銨態(tài)氮含量與N2O排放通量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)；土壤硝態(tài)氮含量與N2O排放通量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。其中,易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量與N2O排放通量的相關(guān)系數(shù)分別為-0.887、0.738、-0.909、,說明易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量是影響N2O排放的主要因子。

表6 N2O排放通量與土壤各因子的相關(guān)關(guān)系分析

2.8 硝化、反硝化功能基因與AM真菌變化之間的相關(guān)性分析

硝化、反硝化功能基因與AM真菌的相關(guān)性分析如表7所示。從表7中可得知,AM真菌與AOA、AOB、nirK、nirS基因豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),與nosZ呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；AOA與AOB、nirK、nirS基因豐度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與nosZ呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；AOB與nirK基因豐度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與nosZ呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；nirK與nirS基因豐度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與nosZ呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；nirS與nosZ基因豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表7 AM真菌與硝化、反硝化功能基因豐度的相關(guān)關(guān)系分析

2.9 土壤因子、硝化、反硝化功能基因和AM真菌豐度對(duì)N2O排放的相對(duì)貢獻(xiàn)率

將土壤因子、硝化、反硝化功能基因和AM真菌豐度分別加入ABT模型進(jìn)行分析(圖4),結(jié)果表明,AOA對(duì)N2O排放的影響最大(21.1%),其次是AM真菌(19.2%)和nirS(11.8%),其余因子貢獻(xiàn)率均不足10%；影響N2O排放量的相對(duì)貢獻(xiàn)率由大到小依次為：AOA、AM真菌、nirS、nosZ、AOB、銨態(tài)氮、土壤含水量、有機(jī)碳、硝態(tài)氮、nirK、土壤容重、pH。

圖4 土壤因子、硝化、反硝化功能基因和AM真菌豐度對(duì)N2O排放的相對(duì)影響的ABT分析

3 結(jié)論與討論

許多研究表明,農(nóng)田土壤施入生物炭后,土壤理化性質(zhì)如pH、含水量、容重、有機(jī)碳、氮等發(fā)生相應(yīng)變化[17,28]。本研究表明,施入生物炭后,土壤pH值和土壤含水量呈增加趨勢,但均未達(dá)到顯著水平,主要是因?yàn)樯锾孔陨沓蕢A性,施入土壤后能夠提高土壤pH值,但本試驗(yàn)地土壤為弱堿性,具有一定的酸堿緩沖能力,因此各處理間土壤pH值差異不顯著(表2),另外生物炭具有較好的親水性和持水能力,增加了水分的滲流模式和路徑,減緩了土壤水分的蒸發(fā)損失,引起土壤含水量增加。這和李培培等[28]的研究結(jié)果一致。施入生物炭后,土壤容重呈減少趨勢,這與Baiamonte等[29]的研究結(jié)果一致,主要是由于生物炭具有多孔疏松的結(jié)構(gòu)、大的比表面積,自身密度較小,施入土壤之后對(duì)土壤具有“稀釋效應(yīng)”[30]。施入生物炭后土壤有機(jī)碳的增加主要是由于以下幾方面原因：首先是由生物質(zhì)熱解形成的生物炭中的碳主要以惰性的芳香環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在,本身碳含量非常高,在土壤中加入生物炭可以提高土壤有機(jī)碳的含量；其次是生物炭具有較強(qiáng)的吸附性,能夠吸附土壤有機(jī)小分子,促進(jìn)有機(jī)小分子聚合形成土壤有機(jī)質(zhì)[31],另外生物炭的多孔結(jié)構(gòu)為微生物的生長繁殖提供附著位點(diǎn),為微生物提供了良好的棲息環(huán)境,土壤微生物量增加,加速了土壤有機(jī)態(tài)養(yǎng)分的分解釋放,從而增加土壤有機(jī)碳含量[17]。本研究表明,施入生物炭后,土壤全氮、銨態(tài)氮含量增加。這與Nguyen等[32]通過薈萃分析得出的結(jié)果不同,Nguyen等研究發(fā)現(xiàn)生物炭的高C/N特性及帶入的活性物質(zhì)引起微生物對(duì)土壤礦質(zhì)氮的固定,因此降低了氮素有效性。與宋大利等[33]和劉遵奇等[34]的研究結(jié)果相一致。主要是由于生物炭本身含有一定量的氮素；另外施用生物炭可降低氮素淋失和改善土壤通氣狀況抑制了微生物的反硝化作用,從而減少了N2O的形成和排放,進(jìn)而使得土壤中全氮含量增加。

生物炭孔隙由于能夠貯存水分和養(yǎng)分,為微生物棲息生活提供了優(yōu)越的天然微環(huán)境,生物炭施入土壤能夠顯著增加微生物數(shù)量及活性。本研究表明,施入生物炭能夠顯著提高AM真菌侵染率和AM真菌基因豐度,與Hammer等[17]的研究結(jié)果一致。主要原因可能為：(1)生物炭改善土壤理化特性有利于AM真菌孢子的萌發(fā)和生長,生物炭多孔結(jié)構(gòu)為AM真菌提供棲息地[15]；(2)生物炭調(diào)節(jié)植物-真菌信號(hào)物質(zhì)影響AM真菌的萌發(fā)和菌絲的分枝[35]；(3)生物炭可能通過影響土壤中的解磷細(xì)菌活性,從而間接影響AM真菌[36]。AM真菌在氮素吸收利用和土壤氮素循環(huán)過程中有著重要的作用,一方面AM真菌能夠通過競爭吸收氮素來調(diào)控N2O排放。AM真菌吸收大量氮素用以自身生長需要,并改善宿主植物的氮素營養(yǎng)[37],從而減少硝化、反硝化作用底物濃度而降低N2O排放速率；另一方面AM真菌能夠改變植物根系分泌物的組成及數(shù)量,從而導(dǎo)致根際微生物群落發(fā)生變化,包括一些硝化、反硝化細(xì)菌群落,從而影響N2O排放[38-39]。

總的來說,生物炭處理提高土壤AM真菌侵染率、調(diào)節(jié)土壤理化性質(zhì),生物炭和AM真菌協(xié)同調(diào)節(jié)土壤微生物,特別是對(duì)硝化、反硝化相關(guān)基因的調(diào)節(jié),進(jìn)而影響土壤N循環(huán)和N2O氣體的排放,但生物炭和AM真菌之間的協(xié)調(diào)機(jī)制需要進(jìn)行更進(jìn)一步研究。