陳彥君, 李俊生, 閆 冰, 關(guān) 瀟*, 陶 均

1.中國環(huán)境科學(xué)研究院, 國家環(huán)境保護(hù)區(qū)域生態(tài)過程與功能評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100012 2.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院, 海南 海口 570228 3.江西省科學(xué)院能源研究所, 江西 南昌 330096

轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化25年以來，總種植面積累計(jì)達(dá)到25×108hm2[1]. 在作物生長過程中，蟲害的發(fā)生以及除草劑的施用嚴(yán)重危害著其產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)量. 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入抗蟲、抗除草劑基因可有效降低靶標(biāo)害蟲的數(shù)量，降低作物對(duì)化學(xué)殺蟲劑的依賴，緩解除草劑對(duì)作物的影響[2]，但其是否會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成影響仍需要進(jìn)行全方位的安全性測定，這也是轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容.

對(duì)生物多樣性的影響研究作為轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全釋放的必要環(huán)節(jié)之一，目前已開展大量相關(guān)研究，但結(jié)論不盡相同. 部分研究表明，轉(zhuǎn)基因作物種植對(duì)根際土壤微生物[3-6]、昆蟲[7-10]、雜草[10-12]等的群落結(jié)構(gòu)與組成無顯著影響，但也有學(xué)者認(rèn)為其種植會(huì)影響田間生物多樣性[13-16]，研究結(jié)果的差異表明轉(zhuǎn)基因作物種植后可能對(duì)生物多樣性產(chǎn)生的影響并非一概而論，受體及外源基因等的差異都可能影響研究結(jié)果. 因此，對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物的安全性評(píng)價(jià)工作應(yīng)遵循“個(gè)案原則”[17].

Cry1Ah基因的主要靶標(biāo)動(dòng)物為鱗翅目昆蟲，對(duì)其具有較高的殺蟲活性，但對(duì)家蠶等重要經(jīng)濟(jì)昆蟲的殺蟲活性相對(duì)較低，表現(xiàn)出良好的環(huán)境安全性[18]，具有廣闊的應(yīng)用前景，但其是否會(huì)對(duì)生物多樣性產(chǎn)生顯著影響仍處于探索階段. 鑒于此，該文以轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60為研究對(duì)象，重點(diǎn)討論其對(duì)根際土壤微生物、田間節(jié)肢動(dòng)物以及田間雜草的影響，以期為轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60的環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，為生物安全管理的健康發(fā)展提供支持.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

該研究于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院海南樂東南繁生物育種試驗(yàn)基地進(jìn)行. 該基地位于海南島西南部樂東黎族自治縣，屬熱帶季風(fēng)性氣候，年均氣溫為23.9～25.2 ℃，光照充足，熱量豐富，年降水量約 1 000 mm，但水量不平衡，干季、雨季分明. 選用玉米品種為轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60(簡稱“HGK60”)及其對(duì)照常規(guī)玉米鄭58(簡稱“鄭58”)，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供.

試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，試驗(yàn)組為HGK60，對(duì)照組為鄭58，每個(gè)處理均設(shè)置4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)(小區(qū))面積為150 m2(10 m×15 m). 各小區(qū)間設(shè)置1 m寬的空白隔離帶，種植方式為一穴一粒、一穴兩粒循環(huán)播種，行距為60 cm，株距為25 cm. 玉米于2018年11月播種，田間管理同常規(guī)種植.

1.2 樣品采集與處理

1.2.1根際土壤樣品的采集、DNA提取、PCR擴(kuò)增、高通量測序

樣品采集. 在玉米生長的苗期、喇叭口期、抽穗期、完熟期以及玉米收獲后，采用“抖根法”按照五點(diǎn)采樣法采集根際土壤樣品，取樣時(shí)避開道路等可能影響因素. 土壤樣品用干冰保存帶回置于-80 ℃ 下.

DNA提取. 選用FastDNA? SPIN Kit for soil(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, US)試劑盒提取根際土壤微生物總DNA，采用超微量分光光度計(jì)檢測其濃度、純度.

PCR擴(kuò)增. 針對(duì)V1～V9區(qū)，以稀釋后的基因組DNA為模板，使用通用引物8F(5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′)和1509R(5′-GNTACCTTGTTACGAC TT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增. PCR反應(yīng)體系(50 μL)：Trans Fastpfu 1 μL，5×Buffer 10 μL，5×StimuLate 5 μL，dNTPs(2.5×10-3mol/L each) 5 μL，Primer Mix(1 μmol/L) 2 μL，gDNA 1 μL，NFW 26 μL. PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度98 ℃(2 min)；變性溫度95 ℃(30 s)，退火溫度60 ℃(45 s)，延伸溫度72 ℃(90 s)，35個(gè)循環(huán)后72 ℃終止延伸10 min. 根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等質(zhì)量混樣，充分混勻后使用1×TAE 濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，割膠回收目標(biāo)條帶. 所用試劑盒為QIAGEN公司QIAquick@ Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒.

高通量測序. 使用PACIFIC BIOSCIENCES(PacBio)公司的SMRTbellTMTemplate Prep Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，通過Qubit定量和FEMTO Pulse檢測片段大小，庫檢合格后使用PacBio的Sequel平臺(tái)進(jìn)行16S全長rDNA測序. 該研究測序工作委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成.

1.2.2節(jié)肢動(dòng)物調(diào)查

在玉米生長的苗期、喇叭口期、抽穗期和完熟期，采用五點(diǎn)法于每個(gè)生育期分別進(jìn)行3次節(jié)肢動(dòng)物調(diào)查：①直接觀察法，各點(diǎn)位調(diào)查15株玉米，記錄植株上節(jié)肢動(dòng)物種類和數(shù)量；②陷阱調(diào)查法，各小區(qū)埋設(shè)25個(gè)(每個(gè)點(diǎn)位放5個(gè))塑料杯，塑料杯直徑7.5 cm，間隔0.5 m，于調(diào)查的前一天在塑料杯中放置1/3容量的5%防凍液，24 h后記錄節(jié)肢動(dòng)物的種類和數(shù)量.

1.2.3雜草調(diào)查

分別在玉米生長的苗期、喇叭口期、抽穗期、完熟期于各小區(qū)按照五點(diǎn)法，避開調(diào)查節(jié)肢動(dòng)物時(shí)所設(shè)陷阱，選取5個(gè)1 m2(1 m×1 m)的樣方，調(diào)查并記錄樣方內(nèi)雜草種類和數(shù)量.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.3.1根際土壤微生物

1.3.1.1測序數(shù)據(jù)處理

將PacBio下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)出后，使用Lima軟件根據(jù)Barcode序列區(qū)分各樣本數(shù)據(jù). 進(jìn)行CCS(Circular Consensus Sequencing)校正及長度過濾，過濾含有連續(xù)相同堿基數(shù)>8的序列及引物切除. 對(duì)處理后得到的序列進(jìn)行去除嵌合體處理，通過UCHIME v7.0.1090與Silva全長數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)檢測嵌合體序列，去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù).

1.3.1.2OTU聚類和物種注釋

利用Uparse v7.0.1001軟件對(duì)所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，以97%的一致性將序列聚類成可操作分類單元OTUs(Operational Taxonomic Units). 依據(jù)相應(yīng)算法原則，篩選OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為其代表序列. 對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與Silva(http://www.arb-silva.de)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1)，獲得分類學(xué)信息并統(tǒng)計(jì)各分類水平上各樣本的群落組成. 使用MUSCLE v3.8.31軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系. 最后以數(shù)據(jù)量最少的樣品為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)分析均基于均一化處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行. 使用R v2.15.3軟件繪制門水平上的前10位物種相對(duì)豐度柱形圖與屬水平上的前35位物種相對(duì)豐度聚類熱圖，并對(duì)同一生育期的組間差異進(jìn)行分析(T檢驗(yàn)).

1.3.1.3樣品復(fù)雜度分析(alpha diversity)

使用Qiime v1.9.1軟件計(jì)算Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Phylogenetic diversity指數(shù)(簡稱“PD指數(shù)”)，使用R v2.15.3軟件進(jìn)行alpha多樣性指數(shù)組間差異分析(非參數(shù)Wilcoxon檢驗(yàn)).

1.3.1.4多樣品比較分析(beta diversity)

用Qiime v1.9.1軟件計(jì)算Weighted-Unifrac距離. 使用R v2.15.3軟件進(jìn)行(NMDS)，并進(jìn)行beta多樣性指數(shù)組間相似性分析(Analysis of Similarities, ANOSIM).

1.3.2節(jié)肢動(dòng)物與雜草的統(tǒng)計(jì)與分析

統(tǒng)計(jì)分析玉米各生育期田間節(jié)肢動(dòng)物和雜草的群落結(jié)構(gòu)與組成，計(jì)算各生態(tài)學(xué)指數(shù).

Margalef指數(shù)(Dmg)：

Dmg=(S-1)/lnN

(1)

Shannon-Wiener指數(shù)(H)：

(2)

Simpson指數(shù)(D)：

(3)

Pielou指數(shù)(J)：

J=H/lnS

(4)

式中：S為物種個(gè)數(shù)；Pi=Ni/N，其中Ni為第i個(gè)物種的個(gè)體數(shù)，N為總個(gè)體數(shù)[19].

利用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行兩兩T檢驗(yàn).

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60對(duì)根際土壤微生物的影響

將根際土壤樣品的高通量測序序列經(jīng)過質(zhì)控過濾后，共得到 633 812 條有效序列. 各樣品的高通量測序序列范圍為 6 480～55 762 條，平均有效序列為 21 127 條. 根據(jù)樣品中最小有效序列數(shù)，每個(gè)樣品隨機(jī)挑選 6 480 條有效序列進(jìn)行樣品測序深度的均一化處理. 以97%的一致性(Identity)將其聚類成OTUs，共注釋到34門、188科、524屬.

2.1.1物種相對(duì)豐度統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)根際土壤微生物門水平上的物種相對(duì)豐度，豐度前10位的門分別為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、未鑒定出的細(xì)菌(unidentified-bacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria). 其中，厚壁菌門在各處理中的相對(duì)豐度為18.88%～45.61%、變形菌門為24.52%～37.68%、酸桿菌門為9.28%～13.16%，且在各處理中相對(duì)豐度均大于5%，為優(yōu)勢(shì)種群.

結(jié)合T檢驗(yàn)，比較HGK60與鄭58根際土壤微生物發(fā)現(xiàn)，酸桿菌門、浮霉菌門、綠彎菌門在各生育期的相對(duì)豐度均差異不顯著(P>0.05)；厚壁菌門僅在抽穗期和完熟期表現(xiàn)為HGK60顯著高于鄭58(P<0.05)，變形菌門僅在抽穗期和完熟期表現(xiàn)為HGK60顯著低于鄭58(P<0.05)，放線菌門僅在完熟期表現(xiàn)為二者差異顯著(P<0.05)，擬桿菌門、芽單胞菌門僅在抽穗期表現(xiàn)為二者差異顯著(P<0.05)，但收獲后HGK60與鄭58在前10個(gè)門的相對(duì)豐度差異均不顯著(P>0.05)(見圖1).

根據(jù)所有樣品屬水平上的物種注釋，選取相對(duì)豐度前35位的屬繪制聚類熱圖(見圖2). 比較同一生育期HGK60與鄭58根際土壤微生物發(fā)現(xiàn)，部分物種存在一定差異，但僅出現(xiàn)在某個(gè)生育期，并未在整個(gè)生育期持續(xù)出現(xiàn). 苗期，Chitinophaga、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)等的相對(duì)豐度均表現(xiàn)為HGK60低于鄭58，寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、Pelomonas等的相對(duì)豐度則表現(xiàn)為HGK60高于鄭58；喇叭口期，嗜糖假單胞菌屬(Pelomonas)、Occallatibacter等的相對(duì)豐度表現(xiàn)為HGK60高于鄭58；抽穗期，Haliangium、Crenobacter等的相對(duì)豐度表現(xiàn)為HGK60低于鄭58；完熟期，Aquicella、Dechlorobacter等的相對(duì)豐度均表現(xiàn)為HGK60低于鄭58. 這表明HGK60的種植會(huì)在某些生育期對(duì)部分屬水平上的物種產(chǎn)生一定影響.

圖1 門水平上的前10的物種相對(duì)豐度Fig.1 The relative abundance of top 10 soil microorganisms at the phyla level

圖2 不同植株根際土壤中微生物前35個(gè)屬相對(duì)豐度聚類熱圖Fig.2 The relative abundance histogram of top 35 soil microorganisms at the genus level by heatmap

從生育期的角度來看，玉米根際土壤微生物部分屬水平上的物種呈現(xiàn)一定的季節(jié)性差異. 溶桿菌屬(Lysobacter)、類諾卡氏屬(Nocardioides)等的相對(duì)豐度主要表現(xiàn)為收獲后相對(duì)較高，玉米生長期間則相對(duì)較低；Tumebacillus等的相對(duì)豐度表現(xiàn)為喇叭口期明顯高于其他生育期；Pseudogulbenkiania、Crenobacter、Pseudolabrys、Aquicella等的相對(duì)豐度主要表現(xiàn)為抽穗期、完熟期相對(duì)較高，其他生育期則相對(duì)較低. 部分物種呈現(xiàn)一定的季節(jié)性特征，說明生育期是影響根際土壤微生物的因素之一. 但是由于聚類熱圖只能通過圖中不同處理間顏色的差異對(duì)處理間差異進(jìn)行判斷，無法進(jìn)行有效量化，需要結(jié)合多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果做進(jìn)一步分析.

2.1.2alpha多樣性指數(shù)與beta多樣性聚類分析

對(duì)HGK60與鄭58各生育期根際土壤細(xì)菌群落的alpha多樣性進(jìn)行非參數(shù)Wilcoxon檢驗(yàn). Shannon-Wiener指數(shù)分析結(jié)果顯示，HGK60與鄭58僅在抽穗期、完熟期差異顯著(P<0.05)；Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)在各生育期均表現(xiàn)為二者差異不顯著(P>0.05)；ACE指數(shù)僅表現(xiàn)為收獲后二者差異顯著(P<0.05)；PD指數(shù)則表現(xiàn)為僅抽穗期、完熟期二者差異顯著(P<0.05). 從整體上看，HGK60的種植不會(huì)對(duì)土壤微生物alpha多樣性產(chǎn)生持續(xù)性影響，部分影響主要存在于抽穗期與完熟期，除ACE指數(shù)外，收獲后HGK60與鄭58在各生態(tài)指標(biāo)上差異均不顯著(P>0.05)(見表1).

在beta多樣性分析中，根據(jù)不同生育期玉米根際土壤樣品的測序結(jié)果，基于Weighted-UniFrac進(jìn)行NMDS分析，以此對(duì)HGK60與鄭58根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性及差異性進(jìn)行定性分析(見圖3). 結(jié)合ANOSIM分析，比較同一生育期HGK60與鄭58，發(fā)現(xiàn)抽穗期、完熟期二者間差異顯著(P<0.05)，苗期、喇叭口期、收獲后二者均差異不顯著(P>0.05)，表明HGK60種植產(chǎn)生的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響僅出現(xiàn)在某些生育期，并未在整個(gè)生長階段持續(xù)存在，且收獲后差異不顯著(P>0.05). 從生育期的角度來看，不同生育期玉米根際土壤樣品細(xì)菌群落存在明顯差異，喇叭口期與抽穗期、完熟期與收獲后均表現(xiàn)為差異顯著(P<0.05).

表1 玉米根際土壤微生物的alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity indexes of rhizosphere soil microorganism

圖3 非度量多維尺度(NMDS)分析Fig.3 Non-metric multidimensional scaling

2.2 轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60對(duì)田間節(jié)肢動(dòng)物的影響

在HGK60與鄭58田間共調(diào)查到節(jié)肢動(dòng)物 19 835 頭，二者分別有 9 727 和 10 108 頭，隸屬于7目19科60種(見表2). 比較同一生育期HGK60與鄭58玉米田間節(jié)肢動(dòng)物數(shù)量分析，螟蛾科在苗期、喇叭口期、抽穗期均表現(xiàn)為HGK60顯著低于鄭58(P<0.05)，其他物種的差異只表現(xiàn)在某個(gè)生育期，并不會(huì)在整個(gè)生育期持續(xù)出現(xiàn)(見表3)，夜蛾科僅在抽穗期表現(xiàn)為HGK60顯著低于鄭58(P<0.05)，緣蝽科、盲蝽科、葉蟬科僅在喇叭口期表現(xiàn)為HGK60顯著高于鄭58(P<0.05)，飛虱可僅在完熟期HGK60顯著低于鄭58(P<0.05)，蚜科僅在苗期、完熟期表現(xiàn)為二者差異顯著(P<0.05)，草蛉科僅在抽穗期表現(xiàn)為HGK60顯著低于鄭58(P<0.05)，瓢蟲科僅在苗期表現(xiàn)為HGK60顯著高于鄭58(P<0.05)，薊馬總科則僅在喇叭口期HGK60顯著低于鄭58(P<0.05).

表2 田間節(jié)肢動(dòng)物群落的目、科、種分布Table 2 Patterns of the arthropod community in the fields in different orders, families and species

表3 各生育期田間節(jié)肢動(dòng)物數(shù)量Table 3 The number of arthropods in each growth period 頭

比較HGK60與鄭58田間節(jié)肢動(dòng)物群落的Margalef指數(shù)發(fā)現(xiàn)，僅抽穗期表現(xiàn)為HGK60顯著高于鄭58(P<0.05)，其他生育期均表現(xiàn)為二者差異不顯著(P>0.05)〔見圖4(A)〕. Shannon-Wiener指數(shù)分析結(jié)果顯示，HGK60與鄭58在各生育期差異均不顯著(P>0.05)〔見圖4(B)〕. Simpson指數(shù)表現(xiàn)為僅喇叭口期HGK60與鄭58差異顯著(P<0.05)，其他生育期二者差異均不顯著(P>0.05)〔見圖4(C)〕. Pielou指數(shù)分析結(jié)果顯示，HGK60與鄭58田間節(jié)肢動(dòng)物Pielou指數(shù)的變化范圍在0.9～1.0之間，且二者在各生育期差異均不顯著(P>0.05)〔見圖4(D)〕.

圖4 田間節(jié)肢動(dòng)物群落各生態(tài)指標(biāo)Fig.4 The ecological indexes of arthropods in the fields

2.3 轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60對(duì)田間雜草的影響

調(diào)查結(jié)果顯示，HGK60與鄭58田間雜草發(fā)生種類有8科16種，多為一年生雜草(見表4). 各生育期內(nèi)HGK60與鄭58的田間雜草密度差異均不顯著(P>0.05)(見圖5). 比較田間各雜草種類，發(fā)現(xiàn)僅喇叭口期的蒼耳表現(xiàn)為HGK60與鄭58差異顯著(P<0.05)，其他生育期、其他物種均表現(xiàn)為二者差異不顯著(P>0.05).

由圖6可見，HGK60與鄭58田間雜草群落Margelef指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)的變化趨勢(shì)一致，且各生育期二者無顯著差異(P>0.05)；HGK60與鄭58的Pielou指數(shù)變化范圍在0.8～1.0之間，HGK60僅在苗期顯著高于鄭58(P<0.05)，其他生育期二者差異不顯著(P>0.05).

2.4 討論

2.4.1轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60對(duì)根際土壤微生物的影響

該研究結(jié)果顯示，HGK60種植后對(duì)根際土壤微生物的影響僅出現(xiàn)在某些生育期，并不會(huì)在整個(gè)生育期持續(xù)出現(xiàn). 對(duì)門水平上相對(duì)豐度前10位根際土壤微生物的研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門、變形菌門、酸桿菌門在各生育期均為優(yōu)勢(shì)種群，其中厚壁菌門與變形菌門的相對(duì)豐度均在抽穗期和完熟期表現(xiàn)為HGK60與鄭58差異顯著，其他生育期之間差異均不顯著；酸桿菌門則在各生育期均表現(xiàn)為二者差異不顯著. 玉米收獲后前10個(gè)門均表現(xiàn)為HGK60與鄭58差異不顯著，認(rèn)為HGK60的種植不會(huì)對(duì)玉米根際土壤微生物門水平產(chǎn)生持續(xù)且顯著的影響. 厚壁菌門的內(nèi)在物種具有降解土壤中難溶化合物[20]、固定空氣中氮[21]、防治植物病蟲害[22]等作用，具有較強(qiáng)的降解能力和代謝活性，其在抽穗期、完熟期HGK60根際土壤中的相對(duì)豐度顯著高于鄭58，表明該生長階段HGK60的種植可有效增強(qiáng)土壤固氮、病蟲害防治及代謝能力等. 變形菌門廣泛分布于各類環(huán)境中，其在農(nóng)業(yè)、環(huán)保、衛(wèi)生等領(lǐng)域具有重要價(jià)值與作用[23-25]. 變形菌門的相對(duì)豐度在抽穗期、完熟期HGK60根際土壤中顯著低于鄭58，但收獲后二者差異不再顯著，表明HGK60的種植對(duì)變形菌門的影響過程相對(duì)較短且不持續(xù).

表4 田間雜草數(shù)量調(diào)查結(jié)果Table 4 The number of each species in the fields 株

圖5 田間雜草密度Fig.5 Weed density in the fields

圖6 田間雜草各生態(tài)指標(biāo)Fig.6 The ecological indexes of weeds in the fields

對(duì)前35個(gè)屬的研究發(fā)現(xiàn)，同一生育期HGK60與鄭58根際土壤微生物中金黃桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、嗜糖假單胞菌屬等的相對(duì)豐度存在差異，但亦只出現(xiàn)在某些生育期，并未在整個(gè)生育期持續(xù)出現(xiàn). 值得注意的是，金黃桿菌屬可降解苯胺、甲基叔丁基醚等難降解有機(jī)物[26]；寡養(yǎng)單胞菌屬對(duì)甲基對(duì)硫磷具有較高的降解性能[27]；嗜糖假單胞菌屬也具有降解有機(jī)物的作用[28]. 雖然以上物種均未對(duì)玉米根際土壤產(chǎn)生持續(xù)且顯著的影響，但仍值得關(guān)注，以充分發(fā)揮其功效，增加其對(duì)土壤微環(huán)境的良性作用.

對(duì)根際土壤微生物alpha多樣性的研究結(jié)果顯示，HGK60種植對(duì)土壤微生物的影響主要存在于抽穗期與完熟期，收獲后HGK60與鄭58在Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)、PD指數(shù)上的差異均不顯著；beta多樣性研究亦發(fā)現(xiàn)，抽穗期、完熟期HGK60與鄭58差異顯著，苗期、喇叭口期、收獲后二者均差異不顯著，與alpha多樣性的研究結(jié)果較為一致，均表明HGK60的種植雖在部分生育期對(duì)根際土壤微生物產(chǎn)生了顯著影響，但該影響并未持續(xù)存在，玉米收獲后HGK60與鄭58間差異不顯著. 已有學(xué)者對(duì)轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生物開展了研究，但并未得到十分明確的結(jié)論. 部分研究認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物種植對(duì)根際土壤微生物無顯著影響[29-34]；但也有研究認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物的種植會(huì)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性等產(chǎn)生顯著影響[35-36]. 上述差異說明轉(zhuǎn)基因作物種植對(duì)土壤微生物多樣性的影響可能與作物類型、轉(zhuǎn)入的外源基因、研究方法等有關(guān)，不可一概而論，需要進(jìn)一步深入研究.

從生育期的角度分析玉米根際土壤微生物的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)生育期的推進(jìn)會(huì)對(duì)其產(chǎn)生一定影響. ANOSIM分析結(jié)果顯示，HGK60與鄭58均表現(xiàn)出在喇叭口期與抽穗期、完熟期與收獲后兩兩生育期間的顯著差異. 一些學(xué)者也得出了生育期會(huì)對(duì)作物根際土壤微生物產(chǎn)生一定影響的結(jié)論[37-39].

2.4.2轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60對(duì)田間節(jié)肢動(dòng)物的影響

通過對(duì)田間節(jié)肢動(dòng)物群落的研究發(fā)現(xiàn)，HGK60主要對(duì)螟蛾科昆蟲有抑制作用. 從整體上看，HGK60種植對(duì)田間節(jié)肢動(dòng)物的多個(gè)生態(tài)指標(biāo)均未產(chǎn)生明顯影響，差異僅出現(xiàn)在個(gè)別生育期，并未在整個(gè)生育期持續(xù)出現(xiàn). 部分研究亦得出了轉(zhuǎn)基因玉米種植不會(huì)對(duì)田間節(jié)肢動(dòng)物產(chǎn)生顯著影響的結(jié)論[7-9]，與筆者所得結(jié)果較為一致. 但是也有研究得出了不同的結(jié)論，認(rèn)為轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的種植會(huì)在一定程度上造成田間天敵昆蟲數(shù)量的下降以及非靶標(biāo)昆蟲數(shù)量的上升[40]；也有部分研究認(rèn)為轉(zhuǎn)基因抗蟲作物可能會(huì)提高田間節(jié)肢動(dòng)物群落的豐富度和多樣性，從而提高生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性[41].

2.4.3轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60對(duì)田間雜草的影響

對(duì)田間雜草的研究結(jié)果顯示，HGK60的種植對(duì)田間種類、數(shù)量及各生態(tài)學(xué)指標(biāo)等均無顯著影響，與趙思楠[42]得出的轉(zhuǎn)G10evo-epsps基因和Cry1Ab/Cry2Aj融合基因抗蟲耐草甘膦玉米雙抗12-6對(duì)田間雜草多樣性無顯著影響的研究結(jié)果較為一致；劉來盤等[10]對(duì)抗除草劑大豆田間雜草進(jìn)行調(diào)查，認(rèn)為其對(duì)雜草群落組成與多樣性也無顯著影響. 但也有研究認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因作物種植可改變田間單子葉、雙子葉雜草比例[43]，其競爭優(yōu)勢(shì)搶占生存空間及次生代謝發(fā)生改變，可能產(chǎn)生“化感”作用，抑制雜草生長，抗蟲作物通過影響害蟲取食習(xí)性變化也可對(duì)田間雜草產(chǎn)生間接影響[44]. 從已有研究結(jié)果來看，不同作物、不同轉(zhuǎn)入基因等對(duì)田間雜草的研究結(jié)果差異較大，表明了轉(zhuǎn)基因作物對(duì)環(huán)境壓力反應(yīng)的復(fù)雜性.

3 結(jié)論

a) 轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60種植對(duì)根際土壤微生物的影響僅出現(xiàn)在某些生育期，其對(duì)抽穗期、完熟期的影響相對(duì)較大，但該影響并不會(huì)在玉米的整個(gè)生長階段持續(xù)出現(xiàn)，玉米收獲后HGK60與鄭58差異不顯著(P>0.05)；生育期是影響根際土壤微生物的重要因素之一.

b) 轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60對(duì)螟蛾科昆蟲具有顯著抑制作用(P<0.05)，但對(duì)田間節(jié)肢動(dòng)物的種類及Margalef指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Pielou指數(shù)等生態(tài)學(xué)指標(biāo)均無顯著影響(P>0.05).

c) 轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60種植對(duì)田間雜草密度及Margalef指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Pielou指數(shù)等生態(tài)學(xué)指標(biāo)均無顯著影響(P>0.05).