湯曉東，蘇燕，張麗娜，陳曉水，蔣佳磊，朱書秀，楊君

浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，杭州市西湖區(qū)轉(zhuǎn)塘鎮(zhèn)科海路118號310024

煙用香精是一類重要的煙草添加劑，根據(jù)其施加工藝與作用的不同分為加香香精和加料香精。卷煙企業(yè)通過在加香、加料工藝中添加不同的香精以改善卷煙品質(zhì)。煙用香精成分復(fù)雜，而有機酸是其中重要的組成部分。煙用香精中有機酸分為揮發(fā)性有機酸、半揮發(fā)性有機酸和非揮發(fā)性有機酸［1］。半揮發(fā)性有機酸和非揮發(fā)性有機酸是影響煙草吸食品質(zhì)的主要化學(xué)成分之一，其在卷煙燃燒過程中具有平衡煙氣的酸堿度、減輕煙氣的刺激性、增加煙氣濃度的作用，對卷煙的抽吸品質(zhì)具有重要影響［2-4］。因此，準(zhǔn)確分析煙用香精中半揮發(fā)性有機酸和非揮發(fā)性有機酸的種類和質(zhì)量分數(shù)，對了解各種香精內(nèi)在品質(zhì)及設(shè)計香精配方具有重要意義。

近年來，對于有機酸的測定主要集中在食品［5-6］、飲料［7-8］、煙草及煙草制品［9-11］等領(lǐng)域，分析方法主要有GC法和HPLC法。GC法是目前測定非揮發(fā)性有機酸最常用的方法，該法需要經(jīng)過水解、皂化、酯化、提取等前處理過程；HPLC法多采用將有機酸衍生成具有紫外吸收的物質(zhì)后用紫外檢測器檢測，或采用熒光法檢測［12］。目前，有關(guān)香精中有機酸的分析研究鮮見報道，王軍等［13］采用10%（體積分數(shù)）硫酸甲醇溶液于80℃下加熱回流煙用香精樣品，使其中的有機酸與甲醇充分反應(yīng)成酯，然后將二氯甲烷萃取液經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，采用GC法檢測。該方法在實際應(yīng)用時存在以下缺點：①部分煙用香精經(jīng)高溫回流衍生后，用二氯甲烷萃取會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，不利于后期的儀器分析；②采用氣相色譜-火焰離子化檢測器分析復(fù)雜樣品時會出現(xiàn)“假陽性”的情況；③對于大批量樣品的分析，該衍生化方法效率較低。因而有必要建立一種簡便靈敏的、適合于批量分析煙用香精中有機酸的方法。因此，本研究中以含硫酸的甲醇溶液在室溫下靜置反應(yīng)的方式對香精中有機酸進行衍生化，優(yōu)化了衍生化反應(yīng)條件，以GC-MS-SIM法測定有機酸的質(zhì)量分數(shù)，建立了一種簡便、靈敏、準(zhǔn)確測定煙用香精中有機酸的方法，旨在為香精中有機酸的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

香精樣品1#～26#，其中1#～15#為加料香精樣品，16#～26#為加香香精樣品，由浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供。

草酸（標(biāo)準(zhǔn)品，99.999%，美國Aldrich公司）；丙二酸、棕櫚酸（99.5%），硬脂酸（99.2%），琥珀酸（96.5%），亞油酸（98.0%）（標(biāo)準(zhǔn)品，美國Chem Service公司）；DL-蘋果酸（標(biāo)準(zhǔn)品，＞99.0%，日本東京化成工業(yè)株式會社）；檸檬酸（≥99.5%），油酸（≥99.0%），亞麻酸（≥98.5%）（標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma-Aldrich公司）；己二酸（標(biāo)準(zhǔn)品，≥99.5%，美國Sigma公司）；甲醇、二氯甲烷（色譜純，迪馬科技有限公司）；硫酸（95.0%～98.0%，西隴科學(xué)股份有限公司）。

7890A/5977A型氣質(zhì)聯(lián)用儀、HP-INNOWAX色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）（美國Agilent公司）；XP205型電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）。TALBOYS渦旋振蕩混合器（美國Henry Troemner公司）；4-16K離心機（德國Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

（1）內(nèi)標(biāo)溶液和單一標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。準(zhǔn)確稱取1 000 mg（精確至0.1 mg）己二酸，加入100 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成濃度為10 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。分別準(zhǔn)確稱量100 mg草酸、50 mg丙二酸、50 mg琥珀酸、400 mg蘋果酸、50 mg棕櫚酸、100 mg檸檬酸、50 mg硬脂酸、300 mg油酸、300 mg亞油酸和100 mg亞麻酸于10 mL容量瓶中，分別精確至0.1 mg，用甲醇定容，配制成10種有機酸的單一標(biāo)準(zhǔn)品儲備液；在0～4℃條件下密封避光貯存。

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確移取100μL上述單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液到10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1；分別準(zhǔn)確移取1 000μL上述單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液，同法配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2。

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線1：分別準(zhǔn)確移取10、25、50、100、250、500μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1于50 mL離心試管中，用氮氣吹干后，加入5 mL 10%（體積分數(shù)）硫酸甲醇溶液和50μL 10 mg/mL己二酸內(nèi)標(biāo)溶液，振蕩搖勻后，靜置反應(yīng)24 h。然后加入10 mL水和5 mL二氯甲烷，旋緊蓋子，以2 000 r/min渦旋振蕩10 min后，離心5 min，取下層有機相過濾后進行GC-MS分析。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線2：分別準(zhǔn)確移取50、100、250、500和1 000μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2于50 mL離心試管中，其余處理過程同標(biāo)準(zhǔn)工作曲線1。

1.2.2 樣品處理與GC-MS分析

準(zhǔn)確稱取1.0 g煙用香精樣品，置于50 mL離心管中，加入5 mL 10%硫酸甲醇溶液和50μL 10 mg/mL的己二酸內(nèi)標(biāo)溶液。后續(xù)處理同標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作。GC-MS分析條件：

色譜柱：HP-INNOWAX柱；進樣口溫度：240℃；分流比：10:1；載氣：He，99.999%；流量：1.0 mL/min；升溫程序：50℃（2 min）240℃（15 min）；溶劑延遲：5 min；電子能量：70 eV；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；傳輸線溫度：240℃。采用選擇離子監(jiān)測方式（SIM）掃描，采用NIST譜庫檢索并結(jié)合標(biāo)樣及目標(biāo)物的特征離子進行定性，采用特征離子和內(nèi)標(biāo)法進行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性與定量分析

有機酸衍生物GC-MS分析的定性和定量離子結(jié)果見表1。

表1 10種有機酸的保留時間及特征離子Tab.1 Retention time and characteristic ions of 10 organic acids

2.2 色譜柱的選擇

對于有機酸甲酯的定量分析，常用的色譜柱是DB-5MS和HP-INNOWAX色譜柱。本研究中對比分析了這兩種色譜柱對10種有機酸分離的效果，發(fā)現(xiàn)非極性的DB-5MS色譜柱能有效分離其中的8種有機酸，但不能將油酸和亞麻酸分離；強極性的HP-INNOWAX色譜柱可以將10種有機酸完全分離，且峰形尖銳、對稱、無拖尾現(xiàn)象（圖1）。因此，選擇HP-INNOWAX色譜柱用于分離10種有機酸。

2.3 衍生化條件的選擇

甲酯化反應(yīng)的體系通常選擇BF3、濃硫酸或堿的甲醇溶液，由于BF3甲醇溶液的毒性較大，故考察濃硫酸甲醇溶液和NaOH甲醇溶液對脂肪酸甲酯化的影響［14］。酸催化甲酯化法適合處理游離型和甘油三酯型的脂肪酸，而堿催化甲酯化法不太適合處理游離型脂肪酸［15］。因此，選擇濃硫酸甲醇溶液對有機酸進行衍生化，其中多元酸的所有羧基均會被甲酯化。有機酸的定量分析是否準(zhǔn)確，關(guān)鍵在于衍生化的完全程度及樣品處理的準(zhǔn)確性。本研究中以各有機酸衍生物峰面積與內(nèi)標(biāo)衍生物峰面積的比值定量，考察了衍生化溫度、時間和衍生化試劑的濃度對有機酸甲酯化程度的影響。

圖1 HP-INNOWAX色譜柱對有機酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分離的色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard solutions for 10 organic acids separated by HP-INNOWAX column

2.3.1 衍生化溫度的影響

取4份煙用香精樣品，每份1 g，各加入5 mL 10%硫酸甲醇溶液和50μL 10 mg/mL己二酸內(nèi)標(biāo)溶液，分別于室溫和40、60、80℃水浴條件下衍生化2 h，冰浴快速冷卻至室溫后，加入10 mL水和5 mL二氯甲烷，萃取。1#香精樣品在不同溫度下用二氯甲烷萃取時的現(xiàn)象見圖2。該現(xiàn)象并非個例，經(jīng)實驗驗證發(fā)現(xiàn)部分香精樣品在室溫和40℃條件衍生后，用二氯甲烷萃取時分層良好；而在60和80℃下衍生后，用二氯甲烷萃取時出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，影響香精成分定量的準(zhǔn)確性。為了使該方法的適用性更廣，主要分析比對了室溫和40℃條件下各有機酸的衍生化效率。由表2可知，相較于室溫，除檸檬酸外，大多數(shù)有機酸在40℃下的衍生化效率變化不大。因此，考慮到易操作性和安全性，選擇室溫作為衍生化條件。

圖2 不同溫度下用二氯甲烷萃取樣品后的實物圖Fig.2 Pictures of samples extracted with dichloromethane at different temperatures

表2 衍生化溫度對有機酸衍生化效率的影響①Tab.2 Effects of temperature on efficiency of organic acid derivatization （%）

2.3.2 衍生化時間的影響

在室溫下，考察了衍生化時間（1、5、9、15、18、21、24、27 h）對各有機酸衍生化效率的影響，結(jié)果見表3。隨衍生化時間的增加，各有機酸的衍生化效率逐漸提高。衍生化時間為21 h時，各有機酸已經(jīng)基本完全衍生化；繼續(xù)延長衍生化時間，各衍生化產(chǎn)物的色譜峰面積基本不變。為確保衍生化完全，同時方便實驗操作，選擇衍生化時間為24 h。

2.3.3 衍生化試劑濃度的選擇

文獻［16-17］報道衍生化試劑的濃度對脂肪酸甲酯化有極顯著影響。在優(yōu)化后的溫度和時間條件下，對比2%、5%、10%、15%和20%硫酸甲醇溶液對各有機酸衍生化效率的影響，結(jié)果見表4。可見，硫酸與甲醇的體積比對檸檬酸的衍生化效率影響最大；而V硫酸∶V甲醇=10∶90（體積比）時，各有機酸的甲酯化效果均較好。因此，選擇V硫酸∶V甲醇=10∶90作為衍生化條件。

表3 衍生化時間對有機酸衍生化效率的影響①Tab.3 Effects of time on efficiency of organic acid derivatization （%）

表4 硫酸與甲醇的體積比對有機酸衍生化效率的影響①Tab.4 Effects of sulfuric acid-methanol ratios（V/V）on efficiency of organic acid derivatization （%）

2.3.4 衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性

取有機酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按優(yōu)化條件衍生化，然后進行GC-MS分析；進樣后立即4℃冷藏，分別放置8、24、48、72 h后再一次進樣。每次進樣前取出，室溫下放置30 min。結(jié)果顯示，各有機酸衍生物峰面積與內(nèi)標(biāo)衍生物峰面積比值的RSD均小于5.75%。說明這些有機酸的甲酯化產(chǎn)物穩(wěn)定，適合定量分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

分別對配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按照優(yōu)化后的衍生化條件進行衍生，并以目標(biāo)化合物和內(nèi)標(biāo)峰的定量離子峰面積之比與各目標(biāo)物濃度和內(nèi)標(biāo)濃度之比進行回歸分析，得到10種目標(biāo)物的線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)。根據(jù)實際樣品分析需要，建立了兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比（S/N=3）計算檢測限（LOD），以S/N=10計算定量限（LOQ）。由表5可知，10種有機酸在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（回歸方程的R2均大于0.998），10種有機酸的檢出限和定量限分別在0.004～0.080和0.013～0.267 mg/kg之間，可以滿足各目標(biāo)物的定量分析要求。

2.4.2 方法的回收率和精密度

在高、中、低3個不同濃度水平進行加標(biāo)回收率實驗，每個添加水平下平行測定6次，計算樣品中各有機酸的回收率和RSD，結(jié)果見表6?？芍?，10種有機酸在不同濃度水平下的加標(biāo)回收率在83.06%～110.29%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.01%～6.50%之間。說明本方法的回收率高、精密度好。

表5 10種有機酸的線性參數(shù)、檢出限及定量限Tab.5 Linear parameters,limits of detection and limits of quantification of 10 organic acids

表6 10種有機酸的回收率和精密度（n=6）Tab.6 Spiked recoveries and precision of 10 organic acids（n=6）

2.5 實際樣品的測定

采用本方法分析了26個香精樣品，其中1#樣品的色譜圖如圖3所示，26個樣品中10種有機酸的檢測結(jié)果如表7所示。由表7可知，10種有機酸在大多數(shù)香精樣品中均有檢出。所有香精樣品中，質(zhì)量分數(shù)較高的有機酸均是蘋果酸和檸檬酸，而硬脂酸和亞麻酸的質(zhì)量分數(shù)均較低?？傮w而言，加料香精組的10種有機酸的總量明顯高于加香香精組。

圖3 1#香精樣品的色譜圖Fig.3 Chromatogram of tobacco flavor sample 1#

表7 香精樣品中10種有機酸的分析結(jié)果Tab.7 Analysis results of 10 organic acids in tobacco flavors （mg·kg－1）

3 結(jié)論

①通過優(yōu)化色譜條件和衍生化條件，采用內(nèi)標(biāo)法定量，建立了可同時測定香精中10種有機酸的GC-MS分析方法。②在優(yōu)化條件下，目標(biāo)物的檢出限和定量限分別在0.004～0.080和0.013～0.267 mg/kg之間，加標(biāo)回收率在83.06%～110.29%之間，RSD在1.01%～6.50%之間。③實際樣品的檢測結(jié)果顯示，10種有機酸在絕大多數(shù)樣品中均有檢出，且其質(zhì)量分數(shù)在加料香精和加香香精樣品中差異明顯。④該方法操作簡便、靈敏度和精密度高，適合于批量測定香精中的10種有機酸，可為煙用香精品質(zhì)控制提供一種技術(shù)手段。