左新慧， 李君， 韓祥禎， 劉小元， 何惠宇，2

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（附屬口腔醫(yī)院）口腔修復(fù)科，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊（830054）；

2.新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊（830011）

組織工程骨為解決骨組織的缺損和修復(fù)提供了新的方向，其中種子細(xì)胞、細(xì)胞因子與支架材料是構(gòu)成組織工程骨的三大要素。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有多向分化和自我更新的功能，可作為理想的種子細(xì)胞［1?2］，成熟的基因治療技術(shù)也為細(xì)胞構(gòu)建更加穩(wěn)定的生長環(huán)境，延緩其老化過程，促使細(xì)胞增殖能力和分化能力等提供了可靠的方法［3］。低氧誘導(dǎo)因子?1α（hypoxia?inducible factor?1α，HIF?1α）通過調(diào)控其編碼相對(duì)應(yīng)的生長因子產(chǎn)物，可以直接或者間接參與血管發(fā)生的整個(gè)過程。研究發(fā)現(xiàn)在骨缺損修復(fù)過程中HIF?1α 也發(fā)揮著調(diào)控作用，其通過不同途徑誘導(dǎo)成骨因子的生成，進(jìn)而促進(jìn)缺損部位血管生成［4］。利用RNA 干擾（RNAi）技術(shù)使目的基因表達(dá)沉默，具有高特異性［5］。

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)上調(diào)和下調(diào)BMSCs 中的HIF?1α 的表達(dá)，觀察各組BMSCs 中的成骨和血管生成相關(guān)因子的變化，探究HIF?1α 對(duì)BMSCs 成骨分化和血管生成相關(guān)因子表達(dá)的影響，為HIF?1α在骨組織工程中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

HIF?1α 過表達(dá)質(zhì)粒和低表達(dá)質(zhì)粒（由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司提供）；清潔級(jí)SD 大鼠，雌雄不限，體重（100 ± 10）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（新）2016?0003。

主要試劑：MEM basic（1 ×）培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胎牛血清（BI，美國）；0.25%胰蛋白酶（Hy?Clone，美國）；質(zhì)粒提試劑盒（BIOMIGA，美國）；限制性內(nèi)切酶（Thermo，美國）；Lip LTX 轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen，美國）；茜素紅染色液（北京索萊寶公司，中國）；引物序列（上海生物工程公司，中國）；QuantiNova?SYBR?Green PCR Kit 試 劑 盒（QIA?GEN，德國）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo，美國）；Rabbit?Anti?HIF?1α?antibody（Abcam，美國），Rabbit?Anti?Runx2?antibody（Abcam，美國），Rabbit ?Anti?PDGF?BB?antibody（Abcam，美國），Rabbit?Anti?GAPDH?antibody（Abcam，美國）。主要儀器：CO2恒溫培養(yǎng)箱（371 型，Thermo，美國）；熒光定量PCR 儀（CFX96，Bio?RAD，美國）；高速離心機(jī)（5810R，Ep?pendorf，德國）；western?blot 電泳裝置（PowerPacHC，Bio?RAD，美國）；酶標(biāo)儀（Multiskan Go，Thermo，美國）；激光共聚焦顯微鏡（TCS?SP8 SR，Leica，德國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒提取 根據(jù)GenBank 中HIF?1α 的基因序列，參照shRNA 設(shè)計(jì)原則進(jìn)行在線分析設(shè)計(jì)。后為獲取更多質(zhì)粒，將HIF?1α過表達(dá)質(zhì)粒和篩選出的低表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，將菌落分別接種于含有卡那霉素和氨芐霉素的SOC 培養(yǎng)基中。依據(jù)質(zhì)粒小體試劑盒的說明書提取質(zhì)粒，并檢測(cè)濃度，用BamHI 內(nèi)切酶將質(zhì)粒單切后進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，測(cè)試目的條帶，送往吉?jiǎng)P公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定 將SD 大鼠采用頸椎脫臼處死法，處死后放入75%（mL/mL）乙醇中浸泡5 min 后分離出股骨與肱骨，剪開骨骺兩端沖出骨髓，充分吹打混勻至懸液后離心。棄上清，管內(nèi)加入含15%胎牛血清、鏈霉素和青霉素的MEM 完全培養(yǎng)基，分裝至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后每2～3 d 更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞匯合度至85%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化1∶2 傳代，細(xì)胞傳至第3 代加入熒光抗體上流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BMSCs 取第3 代細(xì)胞，以密度為5 × 105個(gè)/孔接種于6 孔板內(nèi)，待細(xì)胞匯合度達(dá)90%左右時(shí)，按課題組前期已證實(shí)安全有效的轉(zhuǎn)染劑量，使用Lipofectamine?LTX 轉(zhuǎn)染試劑將各組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至BMSCs。轉(zhuǎn)染后48 h，使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光表達(dá)量，計(jì)算轉(zhuǎn)染率（轉(zhuǎn)染率＝鏡下熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)× 100%）。按照轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同將細(xì)胞分為過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組、過表達(dá)對(duì)照組、低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組和低表達(dá)對(duì)照組。

1.2.4 茜素紅染色 BMSCs 轉(zhuǎn)染48 h 后，換液為成骨誘導(dǎo)液（α?MEM+10% FBS+10 nmol/L β 甘油酸鈉+100 nmol/L 地塞米松+50 μmol/L VitaminC），每3 d 換液一次，成骨誘導(dǎo)3 d 和7 d 后分別進(jìn)行染色。PBS 洗滌2 遍，4%多聚甲醛固定30 min，ddH2O洗3 遍，1%茜素紅染液染色20～30 min，ddH2O 洗3遍后顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)并拍照。

1.2.5 RT?PCR 檢測(cè)相關(guān)基因mRNA 用Trizol 法裂解轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，提取總RNA，以2 μg 反轉(zhuǎn)20 μL 體系反轉(zhuǎn)錄為cDNA，后用RT?PCR 試劑盒檢測(cè)成骨分化特異標(biāo)志物Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt?related transcription factor 2，Runx2），以及血管生成特異標(biāo)志物血小板衍生生長因子?BB（platelet de?rived growth factor?BB，PDGF?BB）、轉(zhuǎn)化生長因子?β（transforming growth factor?β，TGF?β）的mRNA 表達(dá)量。所用引物序列見表1。檢測(cè)結(jié)果通過公式X＝2?ΔΔCt計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組目的基因較對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 RT?PCR 引物序列Table 1 Synthetic primers used for RT?PCR

1.2.6 Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白 在轉(zhuǎn)染48 h 后分別提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的總蛋白，胰蛋白酶消化后至離心管內(nèi)，用PBS 洗滌三遍，視細(xì)胞量的多少加入RIPA 裂解液，在冰上將細(xì)胞充分裂解30 min。后離心（4 ℃，12 000 r，5 min），取上清，加入5 × Loading Buffer 在100 ℃下煮沸10 min。電泳后，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉各2 h，一抗稀釋后（GAP?DH 稀釋比例為1∶10 000，HIF?1α、Runx2 和PDGF?BB 稀釋比例為1∶2 000）分別加入，放置搖床，4 ℃孵育過夜。1 × TBST 清洗3 遍，加入二抗室溫下孵育1 h，洗后加入AP 顯色液，使用Image lab version分析上述蛋白結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料符合正態(tài)性，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用GraphPad Prism 軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒提取

分別將過表達(dá)和低表達(dá)組質(zhì)粒用BamHI 酶切后，過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組、低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組的條帶大小分別為：7.8 kb、6.4 kb。與吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)結(jié)果一致。

2.2 BMSCs 培養(yǎng)和鑒定

原代細(xì)胞首次換液后鏡下觀察呈圓形，傳至P3 代可見細(xì)胞呈貼壁生長的長梭形、旋渦狀，見圖1。流式細(xì)胞術(shù)鑒定：間充質(zhì)干細(xì)胞抗原CD29 陽性率為98.2%；表面陰性標(biāo)記物：造血干細(xì)胞抗原CD45 陽性率為4.2%。以上結(jié)果均符合間充質(zhì)來源的干細(xì)胞特征。

Figure 1 Cell culture of BMSCs（×50）圖1 BMSCs 的培養(yǎng)（×50）

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染率

轉(zhuǎn)染48 h 后激光共聚焦顯微鏡下可見，成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的BMSCs 呈綠色熒光表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞生長密度約75%；低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量約為76%，對(duì)照組約70%；過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組熒光數(shù)量為73%，對(duì)照組約68%。見圖2。

Figure 2 BMSC transfected with plasmid after 48 h（×100）圖2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs 48 h 后（×100）

2.4 茜素紅染色結(jié)果

各組成骨誘導(dǎo)3 d 和7 d 后茜素紅染色顯示：低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組鈣結(jié)節(jié)面積小于其對(duì)照組，也少于同一時(shí)間段過表達(dá)組的結(jié)節(jié)數(shù)量；過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組紅色鈣結(jié)節(jié)面積大于其對(duì)照組，隨著成骨誘導(dǎo)時(shí)間的增加，各組鈣化面積也增大（圖3）。

Figure 3 BMSC alizarin red staining results for each group（×50）圖3 各組BMSCs 茜素紅染色結(jié)果（×50）

2.5 骨分化與血管生成相關(guān)因子mRNA 結(jié)果

過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組中HIF?1α 的mRNA 表達(dá)量高于其對(duì)照組（P＜0.001），低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組中HIF?1α 的表達(dá)減低（P＜0.001）；結(jié)果顯示：低表達(dá)組中Runx2、PDGF?BB 和TGF?β 的mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.001）；過表達(dá)組中Runx2、PDGF?BB 和TGF?β的mRNA 表達(dá)水平顯著高于其對(duì)照組（P＜0.001），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 各組成骨分化與血管生成相關(guān)因子mRNA 表達(dá)Table 2 mRNA expression of osteogenic differentiation and angiogenesis related factors ±s

表2 各組成骨分化與血管生成相關(guān)因子mRNA 表達(dá)Table 2 mRNA expression of osteogenic differentiation and angiogenesis related factors ±s

HIF?1α: hypoxia inducible factor?1α; Runx2: runt?related transcription factor 2; PDGF?BB: platelet derived growth factor?BB; TGF?β: transforming growth factor?β

Gene names HIF?1α Runx2 PDGF?BB TGF?β Low expression experimental group 0.373±0.020 0.618±0.012 0.097±0.011 0.447±0.013 Low expression control group 1.023±0.231 1.025±0.229 1.009±0.155 1.023±0.222 t P t P 22.522 32.776 16.531 9.203＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 Over expression experimental group 1.563±0.128 25.462±0.406 3.322±0.111 1.734±0.016 Over expression control group 1.013±0.171 1.023±0.204 1.009±0.147 1.006±0.112 0.896 6.278 1.705 17.389＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.6 骨分化與血管生成相關(guān)因子Western blot結(jié)果

過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組中HIF?1α 的蛋白表達(dá)高于其對(duì)照組（P＜0.001），低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組中HIF?1α 的表達(dá)低于其對(duì)照組（P＜0.001）；結(jié)果顯示：低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組中Runx2，PDGF?BB 的表達(dá)顯著降低（P＜0.001），過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組中Runx2，PDGF?BB 的表達(dá)顯著增高（P＜0.001），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（圖4）

3 討 論

新骨再生和血管生成是骨組織工程中修復(fù)骨缺損的兩個(gè)基本環(huán)節(jié)，研究表明，HIF?1α 途徑的激活可以作為血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)，而血管生成正是骨骼再生所必需的［6］。本研究選用HIF?1α 作為細(xì)胞因子探討其在組織工程骨中的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)茜素紅染色結(jié)果顯示，HIF?1α 的表達(dá)水平與BM?SCs 鈣結(jié)節(jié)形成面積成正比，表明了HIF?1α 水平對(duì)BMSCs 的成骨能力有重要的影響。

Figure 4 Protein expression of osteogenic differentiation and angiogenesis related factors圖4 各組成骨分化與血管生成相關(guān)因子表達(dá)

磷脂酰肌醇3?激酶（phosphatidylinositol 3?ki?nase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）作為與HIF?1α 密切相關(guān)的信號(hào)通路，其傳導(dǎo)途徑是一種原型存活途徑，其中Akt是下游靶標(biāo)，可在細(xì)胞生長或存活中起重要作用。激活后Akt可能通過抗凋亡和促凋亡底物的磷酸化產(chǎn)生抗凋亡作用［7］。其在血管生成中起重要作用，并對(duì)正常細(xì)胞的增殖、黏附和遷移也起關(guān)鍵作用，能夠直接或間接的參與血管生成的全過程。Xie 等［8］研究發(fā)現(xiàn)通過受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）激活PI3K/Akt途徑后，可使HIF?1α的表達(dá)增強(qiáng)。

轉(zhuǎn)化生長因子?β（transforming growth factor?β，TGF?β）可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌的遷移和分化，既有血管抑制作用也有促血管生成活性，在血管生成中發(fā)揮雙重作用［9-10］。TGF?β 可同時(shí)調(diào)控成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞間的作用，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)及Ⅰ型膠原的合成，從而參與骨重建。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMSCs 高表達(dá)HIF?1α 后，TGF?β 的mRNA 與蛋白表達(dá)水平也顯著增高，而HIF?1α 低表達(dá)后TGF?β 的mRNA 與蛋白表達(dá)水平顯著降低。Lv 等［11］將HIF?1α 干擾RNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠NIH?3T3 細(xì)胞以沉默內(nèi)源性HIF?1α，結(jié)果顯示沉默HIF?1α 后細(xì)胞中TGF?β 的表達(dá)沒有增加。

PDGF?BB 為一種貯藏在血小板內(nèi)的堿性蛋白質(zhì)，是間充質(zhì)細(xì)胞遷移和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［12］，通過在血管周圍細(xì)胞發(fā)揮作用從而促進(jìn)血管的成熟。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BMSCs過表達(dá)HIF?1α后顯示PDGF?BB 的mRNA 和蛋白表達(dá)均增加。Pang 等［13］在研究中發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt 信號(hào)通路參與了PDGF?BB誘導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞增殖與遷移。Mermis 等［14］將HIF?1α 特異性siRNA 敲低，結(jié)果顯示HIF?1α 轉(zhuǎn)染細(xì)胞PDGF?BB 在艾滋病病毒GP?120 蛋白的存在下的表達(dá)顯著降低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

Runx2 作為HIF?1α 直接靶點(diǎn)，能夠?qū)㈤g充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和前成骨細(xì)胞中的相關(guān)成骨基因進(jìn)行定向轉(zhuǎn)錄和翻譯，可用于檢測(cè)成骨分化的能力［15］。有報(bào)道指出HIF?1α 上調(diào)可以增強(qiáng)Runx2 的表達(dá)，Runx2 參與體內(nèi)成骨過程［16］；Qu 等［17］發(fā)現(xiàn)沉默HIF?1α 的表達(dá)后可顯著抑制Runx2 的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示分別上調(diào)和下調(diào)BMSCs 中的HIF?1α后，Runx2 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平分別呈上升和下降趨勢(shì)，這與Xu［16］的研究結(jié)果一致。

綜上所述，HIF?1α 作為促進(jìn)成骨分化及血管生成能力的重要因子，通過調(diào)控Runx2、PDGF?BB、TGF?β 的水平影響B(tài)MSCs 的成骨分化及血管生成能力。

【Author contributions】Zuo XH performed the experiments and wrote the article. Li J processed and analyzed the data. Han XZ re?vised the article. Liu XY performed the experiments. He HY de?signed the study and reviewed the article. All authors read and ap?proved the final manuscript as submitted.