王承煜， 范亞偉， 王玨

1.山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，山西 太原（030000）； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院口腔科，山西 太原（030000）

隨著對口腔種植技術(shù)的深入研究，研究者發(fā)現(xiàn)當(dāng)種植術(shù)區(qū)具有充足的軟組織量時才能保證良好的生物學(xué)封閉，減少種植體周圍炎的發(fā)生［1］。目前，修復(fù)口腔黏膜缺損的方法有很多，然而判斷軟組織增量效果的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是自體結(jié)締組織移植［2］，但其創(chuàng)傷較大、易發(fā)生感染且需要開辟第二術(shù)區(qū)，不易被患者接受。隨著生物科技的進(jìn)步和發(fā)展，生物膜性材料逐步發(fā)展并成為臨床中常用的軟組織修復(fù)材料，其中富血小板纖維蛋白（plate?let rich fibrin，PRF）和脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM）在臨床上應(yīng)用較多，但目前兩種修復(fù)材料增量技術(shù)比較相關(guān)研究較少［3］。本實驗主要探討PRF 和ADM 對口腔黏膜缺損的修復(fù)效果，為生物膜性材料在口腔種植中的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3 月齡健康雄性日本大耳白兔36 只，體重2.74～3.08 kg，由太原市小店區(qū)豐澤園種養(yǎng)農(nóng)民專業(yè)合作社提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（晉）2015?0003。

1.2 實驗分組

隨機(jī)將實驗動物分為4 組，每組9 只；分別為PRF 組，ADM 組，Autograft 組（自體結(jié)締組織移植組）及Control 組（空白對照組）。本研究已獲得山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 PRF 及ADM 的獲取

對PRF 組9 只兔子在耳中動脈處連接真空采血管，采血量為5 mL，以3 000 rpm 轉(zhuǎn)速離心10 min。靜置后，取出并修剪PRF 凝膠，最后用紗布擠壓法除去PRF 凝膠中的水分，塑形成PRF 膜。ADM 組采用吉特瑞?醫(yī)用膠原修復(fù)膜，修剪為直徑10 mm 的圓形膜。

1.4 制備10 mm 黏膜缺損模型以及缺損平均厚度的測定

術(shù)前8 h 對實驗動物禁飲食，使用苯巴比妥鈉（100 mg/kg）經(jīng)腹腔注射實施麻醉，待麻醉后固定于兔臺。1%碘伏消毒，鋪單，拉開口角，暴露硬腭。在距上頜門齒8 mm 的硬腭區(qū)中央位置，用直徑為10 mm 環(huán)形切取器制備黏膜缺損，去除黏骨膜瓣形成圓形缺損區(qū)（圖1a），暴露骨面。PRF 組用4?0 絲線將對應(yīng)的PRF 間斷縫合于各自的黏膜缺損處；ADM 組用4?0 絲線將直徑10 mm 的ADM間斷縫合于各自的黏膜缺損處；Autograft 組在術(shù)區(qū)后方2.5 mm 處開辟第二術(shù)區(qū)，用10 mm 環(huán)形切取器取結(jié)締組織瓣，修剪后間斷縫合于各自的黏膜缺損處，第二術(shù)區(qū)紗布壓迫30 min 止血；Control 組黏膜缺損處使用紗布壓迫30 min 止血。術(shù)前1 h和術(shù)后連續(xù)3 d 肌肉注射青霉素鈉（100 000 U/kg），1 次/d，預(yù)防感染。游標(biāo)卡尺測量在建模時切取下的硬腭黏膜中心及外側(cè)，取平均值作為各組的硬腭黏膜厚度（圖1b）。

Figure 1 Preparation of 10 mm mucosal defect model and measurement of mucosal defect thickness圖1 制備10 mm 黏膜缺損模型及測量黏膜缺損厚度

1.5 效果評價

1.5.1 創(chuàng)面愈合率的測定 術(shù)后7、14、21 d 將四組的實驗兔麻醉后肉眼觀察創(chuàng)面愈合情況并拍照記錄。觀察完畢后各組隨機(jī)處死3 只，利用牙周探針給定標(biāo)準(zhǔn)長度，單反相機(jī)垂直與組織創(chuàng)面進(jìn)行拍攝。ImagePlus 6.0 軟件測量愈合率。R＝（S初-S末）÷S初。R 為愈合率，S初為初始創(chuàng)面面積，S末為未愈合的創(chuàng)面面積。創(chuàng)面愈合區(qū)組織標(biāo)本行石蠟包埋切片。

1.5.2 炎癥等級的評分 在100 倍及400 倍顯微鏡下觀察各組織HE 切片組織，并給予炎癥等級評分測定。0 分：無炎癥，或有散在炎細(xì)胞；1 分：少量（＜30%）炎細(xì)胞浸潤；2 分：介于1 和3 分之間；3 分：大量（＞60%）炎細(xì)胞浸潤。具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 炎癥分級評分標(biāo)準(zhǔn)［4］Table 1 Inflammation grading score criteria［4］

1.5.3 上皮平均厚度測定 在100 倍顯微鏡下采集各組織HE 切片組織的5 幅圖像。每張圖像在10 個不同部位用Imageplus6.0 軟件測量上皮厚度，得到平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 24.0 軟件，對所有檢測指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用頻數(shù)表示，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。炎癥等級評分采用Kruskal?Wallis 檢驗和Mann?Whitney U 檢驗；愈合率、上皮平均厚度采用單因素方差分析和析因設(shè)計方差分析；若總體方差齊，用Bonferroni 檢驗進(jìn)行組間兩兩比較；若總體方差不齊，則采用Games?Howell 檢驗。檢驗水準(zhǔn)為α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 黏膜缺損平均厚度

PRF 組黏膜缺損平均厚度為（2.28±0.29）mm，ADM 組為（2.21 ± 0.53）mm，Autograft 組為（2.18 ±0.16）mm，Control 組為（2.26 ± 0.20）mm；經(jīng)SNK 檢驗，F(xiàn)＝0.13，P＝0.93，各組黏膜缺損平均厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，可以進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 創(chuàng)面愈合率

經(jīng)Bonferroni 校正的多重比較結(jié)果顯示：①PRF 組、ADM 組與Autograft 組各時間點的創(chuàng)面愈合率均高于Control 組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；②PRF 組與ADM 組在各時間點的創(chuàng)面愈合率比較無顯著差異（P＞0.05）；③PRF 組、ADM 組在各時間點的創(chuàng)面愈合率均低于Autograft 組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（PRF 組：P7d＜0.001，P14d＜0.001，P21d＜0.001；ADM 組：P7d＜0.001，P14d＜0.001，P21d＜0.001）。見表2、圖2。

2.3 HE 染色結(jié)果

將建模時切取的硬腭黏膜做HE 染色，能在顯微鏡下看到硬腭黏膜的全部組織結(jié)構(gòu)，可以認(rèn)為缺損處無黏骨膜附著，完整切取了硬腭黏骨膜，可以進(jìn)行后續(xù)實驗。

表2 各組創(chuàng)面愈合率比較Table 2 Comparison of wound healing rate in each group±s，n=3

表2 各組創(chuàng)面愈合率比較Table 2 Comparison of wound healing rate in each group±s，n=3

#：compared with Control group，P ＜0.05；*：compared with Autograft group，P ＜0.05；△：compared with ADM group，P ＜0.05；PRF：platelet rich fibrin；ADM：acellular dermal matrix；Autograft：autolo?gous connective tissue transplantation;Control:blank control

Group PRF ADM Autograft Control FP Wound healing rate（%）7 d 66.13±2.36#*64.43±2.85*#89.06±3.80#△29.63±2.31 215.047＜0.001 14 d 87.63±2.20#*86.56±1.13*#99.16±0.76#△65.23±2.90 158.569＜0.001 21 d 97.06±0.73#*95.40±1.21*#99.83±0.28#△89.03±1.38 62.636＜0.001

術(shù)后7 d：Control 組可見組織內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，組織結(jié)構(gòu)紊亂，新生血管較少；其余三組細(xì)胞開始修復(fù)，可見結(jié)締組織增值，可見新生毛細(xì)血管，炎性細(xì)胞數(shù)量較Control 組少；ADM 組結(jié)締組織排列更為規(guī)則、致密（與ADM 本身的結(jié)締組織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)系）；Autograft 仍有上皮釘突存在。術(shù)后14 d：Control 組上皮開始修復(fù)，但多處組織仍有大量炎性細(xì)胞浸潤；Autograft 組上皮呈現(xiàn)完整連續(xù)狀態(tài)；PRF 組與ADM 組仍有新生肉芽組織向表面生長，上皮不完全連續(xù)，且ADM 組上皮與PRF 組相比較厚。術(shù)后21 d：Control 組炎癥減輕，其余三組上皮完整，且厚度基本一致。見圖3。

Figure 2 Wound healing of hard palate mucosal defects in each group圖2 各組硬腭黏膜缺損術(shù)后創(chuàng)面愈合情況

2.4 炎癥等級評分

Bonferroni 校正的Mann?Whitney U 檢驗結(jié)果顯示，①PRF 組、ADM 組、Autograft 組分別與Control 組在術(shù)后各時間點的炎癥等級評分比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；②PRF 組、ADM 組與Auto?graft 組在術(shù)后各時間點的炎癥等級評分兩兩之間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.5 上皮厚度

Figure 3 HE staining of hard palate mucosa in each group after operation圖3 各組硬腭黏膜術(shù)后HE 染色

表3 各組炎癥等級評分Table 3 Inflammation grade score of each group n=3

經(jīng)Bonferroni 校正的多重比較結(jié)果顯示：①PRF 組、ADM 組與Autograft 組在術(shù)后各時間點的上皮厚度均比Control 組高（P＜0.05）；②ADM 組在術(shù)后7、14 d 的上皮厚度比PRF 組高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P7d＜0.001，P14d＜0.001）；③ADM 組在術(shù)后各時間點的上皮厚度與Autograft 組相比無顯著差異（P＞0.05）；④PRF 組在術(shù)后7、14 d 的上皮厚度均低于Autograft 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P7d＜0.001，P14d＜0.001）。見表4。

表4 各組術(shù)后上皮厚度比較Table 4 Comparison of postoperative epithelial thickness in each group ±s，n=3

表4 各組術(shù)后上皮厚度比較Table 4 Comparison of postoperative epithelial thickness in each group ±s，n=3

#：compared with Control group，P ＜0.05；*：compared with Auto?graft group，P ＜0.05；△：compared with ADM group，P ＜0.05；PRF：platelet rich fibrin；ADM：acellular dermal matrix；Autograft：autologous connective tissue transplantation;Control:blank control

Group PRF ADM Autograft Control FP Epithelial thickness（μm）7 d 129.33±17.84#*△189.77±7.13#192.60±10.93#0 154.58＜0.001 14 d 221.20±18.31#*△292.10±20.09#316.30±21.51#129.37±14.43 59.96＜0.001 21 d 278.13±8.29#280.67±6.45#291.33±1.65#232.07±10.00 38.68＜0.001

3 討 論

本實驗選擇兔作為實驗對象，主要考慮以下原因：①兔硬腭咀嚼黏膜相對充足，且組織學(xué)結(jié)構(gòu)與人的口腔黏膜類似；②對于兔來說10 mL 采血量被認(rèn)為是安全可行的，滿足本次實驗制備PRF 的采血要求。對實驗動物制備軟組織缺損目前國內(nèi)外無明確統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本實驗應(yīng)用10 mm 的標(biāo)準(zhǔn)化器械，可認(rèn)為是具有科學(xué)性、重復(fù)性、可靠性、標(biāo)準(zhǔn)化口腔軟組織缺損動物模型，符合實驗的條件，可以保證實驗的順利進(jìn)行［5］。

PRF 是以富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）為基礎(chǔ)研制的新一代血小板濃縮制品，是自體全血離心的產(chǎn)物，被認(rèn)為是一種自體移植物［6］。收集自體血立即3 000 rpm 離心10 min，可得到去血小板血漿、PRF 凝膠和紅細(xì)胞碎片，其分別位于離心管的上、中、下層；制備過程不添加抗凝劑和外部化學(xué)物質(zhì)。PRF 疏松的結(jié)構(gòu)能夠容納大量的血小板及生長因子，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor?β，TGF?β）和血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）等。在這些生長因子的作用下，軟組織愈合和成熟的三個關(guān)鍵步驟（血管生成、免疫和上皮覆蓋）可以被同時支持，從而大大加快軟組織的愈合［7］，因PRF 的以上特性，其被應(yīng)用于眾多領(lǐng)域中。在外科手術(shù)中，PRF 的應(yīng)用可加速愈合，減少不良反應(yīng)并改善預(yù)后［8］。PRF 被證實可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和創(chuàng)面愈合［9］。在口腔醫(yī)學(xué)中，PRF 已被證實能夠促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞的黏附、遷移及增殖，還能在愈合過程中高效地表達(dá)I 型膠原蛋白［10］。近些年來，隨著對PRF 制備流程的改良，又成功制取出了i?PRF（injectable platelet rich fibrin，i?PRF）等基于PRF 的衍生物，其可以更加有效且長期的釋放生長因子，進(jìn)一步加快了軟組織的愈合［11］。

ADM 是通過特殊處理，去除了所有細(xì)胞成分的一種組織移植物。由于這些機(jī)械加工的生物支架能快速結(jié)合到生物組織中，因此被廣泛應(yīng)用于各種外科手術(shù)中，且已被提議作為治療口腔黏膜創(chuàng)傷的一種方法。ADM 處理過程為去除含角蛋白的表皮后，處理真皮層以去除所有的脫氧核糖核酸，而不破壞膠原基質(zhì)，故ADM 具有充分的空間供宿主細(xì)胞浸潤、促進(jìn)新生血管形成和加速上皮形成［12］。Xu 等［13］的動物實驗結(jié)果顯示ADM 對于兔硬腭軟組織缺損可刺激輕微的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)出快速的上皮化和血管重建，并伴有VEGF 和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（glucose transporter type 1，GLUT1）的增加，促進(jìn)缺損部位的組織生長。無論是在牙周整形或是口腔種植手術(shù)中，ADM 都顯示出了與結(jié)締組織移植物（connective tissue graft，CTG）相當(dāng)?shù)难例l退縮減少和軟組織厚度增加，而且能獲得與CTG 相同的舒適度［14］。目前國外對ADM 的使用較為廣泛，應(yīng)用于眾多領(lǐng)域，如外科、乳腺外科、燒傷整形科等；在口腔治療中應(yīng)用于頜面外科、牙周科、口腔種植科等。然而在國內(nèi)，ADM 仍未被廣泛使用，在口腔治療中僅被應(yīng)用于牙周手術(shù)，充當(dāng)上皮下結(jié)締組織瓣［15］。

在本實驗中，筆者比較了ADM、PRF 和自體結(jié)締組織移植物對黏膜缺損的修復(fù)效果，結(jié)果顯示，與PRF 相比，ADM 在術(shù)后2 周以內(nèi)的上皮厚度增量方面更具有優(yōu)勢，但在3 周后，PRF 與ADM 的上皮厚度增量效果無顯著差異。ADM 對上皮厚度增量的影響主要涉及以下機(jī)制：①ADM 具有的纖維三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠起調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)、促進(jìn)作用，為宿主成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等的和增生提供網(wǎng)狀空間，局部形成新生血管和上皮，容納并支撐細(xì)胞的生長；②PRF 降解期為2～3 周，而ADM 在體內(nèi)可存在數(shù)月，更有利于萎縮組織的再生，更適合應(yīng)用于牙周科對于牙齦退縮的治療；③ADM 可以和人體結(jié)締組織實現(xiàn)整合，有利于ADM 的固定。

本實驗結(jié)果顯示，ADM 可以獲得與CTG 接近的軟組織增量效果。但是ADM 仍然存在不足之處：①雖然有證據(jù)表明ADM 移植可以取得與CTG相似的結(jié)果［16］，但是最近的一項長達(dá)15 年的臨床研究結(jié)果顯示，盡管ADM 長期的美學(xué)效果較優(yōu)，但效果并不如結(jié)締組織移植物穩(wěn)定，存在少量的組織萎縮［17］；②在創(chuàng)面愈合初期，ADM 組與血液提取物組相比CD68 陽性細(xì)胞較少，且CD31 染色顯示創(chuàng)口邊緣處新生血管較少［18］；③ADM 組與宿主自生的結(jié)締組織仍有差異，在ADM 內(nèi)可觀察到毛細(xì)血管和小血管［19］；④ADM 很難完全去除所有細(xì)胞殘余物。隨著技術(shù)的不斷改善，新的方法不斷應(yīng)用到ADM 的制備中，ADM 的安全性在不斷提高，但其仍有疾病傳播的理論風(fēng)險，這是所有異體移植制劑都存在的問題。

【Author contributions】Wang CY performed the experiments and wrote the article. Fan YW designed the study and reviewed the article.Wang J directed the data collection and analysis. All authors read and approved the final manuscript as submitted.