張 夢,何 曼,孫 強,陳 莉,曾 沙,趙 暉,楊 寒,劉茂倫,任 珊,徐海波
基于Hedgehog信號通路的熊果酸誘導結(jié)直腸癌SW480細胞凋亡的機制研究
張 夢,何 曼,孫 強,陳 莉,曾 沙,趙 暉,楊 寒,劉茂倫,任 珊,徐海波*
成都中醫(yī)藥大學藥學院 藥理系,四川 成都 611137
研究熊果酸通過經(jīng)典Hedgehog信號通路影響人結(jié)直腸癌SW480細胞增殖和凋亡的作用及其機制。通過顯微鏡觀察熊果酸對SW480細胞形態(tài)的影響;采用MTT比色法檢測熊果酸對細胞活力的影響;細胞劃痕實驗檢測熊果酸對細胞遷移的影響;Hoechest/PI染色法觀察熊果酸對細胞凋亡的影響;熒光探針法檢測熊果酸對細胞線粒體膜電位的影響;Caspase活性檢測試劑盒檢測熊果酸對細胞凋亡相關因子Caspase-3、Caspase-9的影響;蛋白免疫印跡法檢測Hedgehog信號通路相關蛋白SHh、Gli1、Ptch1、Smo、c-Myc、SuFu及細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的表達水平。SW480細胞經(jīng)熊果酸給藥后形態(tài)發(fā)生改變;細胞遷移能力顯著下降;線粒體膜電位降低;細胞核出現(xiàn)致密濃染;Caspase-3、Caspase-9活性升高;SW480細胞發(fā)生凋亡;Hedgehog信號通路相關蛋白SuFu的表達水平升高,SHh、Gli1、Ptch1、Smo、c-Myc的表達水平下降;細胞凋亡相關蛋白Bax的表達水平升高,Bcl-2的表達水平下降。熊果酸對SW480細胞的生長、增殖具有抑制作用,通過抑制Hedgehog信號通路的激活促進SW480細胞凋亡。
熊果酸;Hedgehog信號通路;人結(jié)直腸癌SW480細胞;細胞增殖;細胞凋亡
隨著現(xiàn)代生活水平的提高,結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升,其中在發(fā)達國家上升趨勢尤為顯著。結(jié)直腸癌常見于老年群體,但近年來逐漸趨向年輕化,在年輕人中的死亡率逐年上升[1-2]。臨床治療結(jié)直腸癌的方法包括手術、放療、化療等,現(xiàn)代治療多根據(jù)結(jié)直腸癌靶點、異質(zhì)性和耐藥性等特點采取廣譜療法。目前結(jié)直腸癌臨床治療的常用藥物如貝伐單抗、卡培他濱、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑等都已有較為深入的開發(fā)和應用[3-5],盡管國內(nèi)外均對結(jié)直腸癌的預防和治療有大量的研究報道,為臨床眾多結(jié)直腸癌患者帶來福音,但對其分子機制和治療靶點的研究有待深入。
熊果酸是一類具有顯著生物活性的五環(huán)三萜類化合物,廣泛存在于多種水果、蔬菜中,同時也是中藥材白花蛇舌草、冬凌草、木瓜、夏枯草等的主要活性成分[6-9],具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗誘變等藥理活性[10-11]。目前已有大量關于熊果酸抗癌機制報道,包括結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌、皮膚癌[12-16]等。Hedgehog信號通路近年來被發(fā)現(xiàn)參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥性階段[17],然而未見有關于熊果酸通過Hedgehog信號通路抑制結(jié)直腸癌的研究,因此本研究以人結(jié)直腸腫瘤SW480細胞為模型,檢測熊果酸對細胞生長、增殖、遷移及細胞凋亡方面的影響,初步探索熊果酸通過Hedgehog信號通路對結(jié)直腸癌的作用效果,為臨床結(jié)直腸癌的治療提供更多的用藥選擇和實驗數(shù)據(jù)基礎。
人結(jié)直腸癌SW480細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所;熊果酸(質(zhì)量分數(shù)>98%,批號MUST-18072310),購自成都曼斯特生物科技有限公司,Hedgehog信號通路抑制劑GANT-61(C27H35N5,質(zhì)量分數(shù)>98%,批號#21798),購自美國Med Chem Express(MCE)公司。
DMEM低糖細胞培養(yǎng)基(批號SLBT7314),美國Sigma公司;磷酸鹽緩沖液(PBS,批號121D039)、胰蛋白酶(批號HJ202410)、青霉素鏈霉素雙抗(批號HJ202605),索萊寶科技有限公司;胎牛血清(批號20180524),賽澳美細胞技術有限公司;抗熒光淬滅封片液(含Hoechst33324和碘化丙啶(propidium iodide,PI,批號121818191028)、線粒體膜電位檢測試劑盒(批號100918190307)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號P1002)、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(批號P0006)、MTT試劑盒(批號C0009-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性檢測試劑盒(批號071018190123)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-9)活性檢測試劑盒(批號060618200415),碧云天科技有限公司;Hedgehog信號通路相關抗體、音猬因子(sonic hedgehog,SHh)、GLI家族鋅指蛋白1(GLI family zinc finger protein 1,Gli1)、G蛋白偶聯(lián)受體蛋白(smoothened,Smo)、原癌基因蛋白(cellular-myelocytomatosis viral oncogene,c-Myc)、蘇氨酸蛋白激酶Fused抑制因子(suppressor of Fused,SuFu),武漢三鷹生物技術有限公司;表面受體(Patched,Ptch1),美國Immunoway公司。細胞凋亡相關抗體:B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2),美國Immunoway公司;Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax),武漢三鷹生物技術有限公司。內(nèi)參抗體:甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、山羊抗兔IgG二抗,杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司。
3001多功能酶標儀(美國Thermo公司);SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司);DMI3000B倒置顯微鏡、SP8 SR激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司);QUOTQTION電泳儀、化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)Forma3111CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);AllegraX?-12series離心機(美國BECK MAN Coulter);CYT5MFV微孔板成像系統(tǒng)(美國BioTek公司)。
SW480細胞用含有10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),放置于37 ℃、5% CO2的環(huán)境中。根據(jù)細胞生長情況,2~3 d更換新鮮培養(yǎng)基,待細胞生長面積達80%~90%時,按1∶2比例進行傳代,傳至第5代后部分用于保存,部分用于后續(xù)實驗。
取出處于對數(shù)生長期的SW480細胞,經(jīng)胰蛋白酶消化并收集細胞后,以1.0×105個/mL的細胞密度,500 μL/孔的體積接種于24孔細胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后,對照組更換含0.1%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、給藥組更換含不同濃度(5、10、20 μmol/L)熊果酸、陽性藥組更換GANT-61(20 μmol/L)的培養(yǎng)基(100 μL/孔)處理細胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,于微孔板成像系統(tǒng)中觀察記錄細胞生長情況和細胞形態(tài)。
采用“2.2”項方法處理細胞,以1.0×104個/mL的細胞密度,100 μL/孔的體積接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后,對照組更換含0.1% DMSO、給藥組更換含不同濃度(5、10、20、40、60、80、100、120、140 μmol/L)熊果酸的培養(yǎng)基(100 μL/孔)處理細胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,更換含5 mg/mL MTT的培養(yǎng)基(100 μL/孔)處理細胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,更換含5 mg/mL MTT的培養(yǎng)基(100 μL/孔)處理細胞,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,更換DMSO(150 μL/孔)處理細胞結(jié)晶,振蕩10~15 min,待結(jié)晶物充分溶解后,在酶標儀中測定波長570 nm下的吸光度()值,并計算細胞存活率。
細胞存活率=藥物/對照
采用“2.2”項方法處理細胞,以1.0×106個/mL的細胞密度,500 μL/孔的體積接種于24孔細胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)12 h待細胞高密度貼壁后,手持移液器,使槍尖垂直于培養(yǎng)板底部,水平劃線。然后對照組更換含0.1% DMSO、給藥組更換含不同濃度(5、10、20 μmol/L)熊果酸、陽性藥組更換含GANT-61(20 μmol/L)的培養(yǎng)基(100 μL/孔)處理細胞,在加藥后0、12、24 h時間點于顯微鏡下觀察并記錄細胞劃痕的愈合情況。各組細胞不同時間點的劃痕面積采用Image J軟件統(tǒng)計,以對照組(0 h)的劃痕面積為基準,計算相對劃痕面積。
在細胞發(fā)生凋亡的初期階段,細胞膜還未破損,但細胞核染色質(zhì)開始固縮,因此通過Hoechst/PI染色觀察初期細胞凋亡。采用“2.2”項方法處理細胞,以1.0×105個/mL的細胞密度,1 mL/孔的體積接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)12 h,待細胞貼壁后,對照組更換含0.1% DMSO、給藥組更換含不同濃度(5、10、20 μmol/L)熊果酸、陽性藥組更換含GANT-61(20 μmol/L)的培養(yǎng)基(1 mL/孔)處理細胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,吸棄培養(yǎng)基,PBS清洗后每孔加入50 μL含Hoechst 33324和PI的抗熒光淬滅封片液,然后于激光共聚焦顯微鏡下觀察記錄細胞凋亡情況。
在細胞發(fā)生凋亡的早期階段,線粒體膜電位會發(fā)生改變,因此通過檢測線粒體膜電位的變化來考察細胞早期凋亡。采用“2.2”項方法處理細胞,以1.0×105個/mL的細胞密度,500 μL/孔的體積接種24孔培養(yǎng)板于中,培養(yǎng)12 h,待細胞貼壁后,對照組更換含0.1% DMSO、給藥組更換含不同濃度(5、10、20 μmol/L)熊果酸、陽性藥組更換含GANT-61(20 μmol/L)的培養(yǎng)基(500 μL/孔)處理細胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集細胞,按照線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)說明書染色,在微孔板成像系統(tǒng)下觀察線粒體膜電位的變化。
采用“2.2”項方法處理細胞,以1.0×106個/mL的細胞密度,1 mL/孔的體積接種6孔培養(yǎng)板于中,培養(yǎng)12 h,待細胞貼壁后,對照組更換含0.1% DMSO、給藥組更換含不同濃度(5、10、20 μmol/L)熊果酸、陽性藥組更換含GANT-61(20 μmol/L)的培養(yǎng)基(1 mL/孔)處理細胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集細胞,每個樣品加入200 μL裂解液,收集裂解液后部分采用Bradford法測定蛋白濃度,當?shù)鞍踪|(zhì)量濃度在1~3 mg/mL時,剩余樣品按照Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒設定反應體系,待體系顏色變化明顯時在酶標儀中測定波長405 nm下的值,并計算酶活力單位。
采用“2.2”項方法處理細胞,以5.0×105個/mL的細胞密度,1 mL/孔的體積接種于6孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)12 h,待細胞貼壁后,對照組更換含0.1% DMSO、給藥組更換含不同濃度(5、10、20 μmol/L)熊果酸、陽性藥組更換含GANT-61(20 μmol/L)的培養(yǎng)基(1 mL/孔)處理細胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集細胞,每個樣品加入200 μL預冷的增強型RIPA裂解液,收集裂解液后部分采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測定蛋白濃度,剩余部分按4∶1加入5×蛋白上樣緩沖液,混勻后加熱制樣以備用。制備10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠,分離蛋白樣品,濕法轉(zhuǎn)膜,5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)室溫封閉90 min,按比例加入相應一抗后于4 ℃孵育過夜,次日更換二抗孵育90 min,使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像,采用Image Lab軟件進行蛋白條帶分析。
微孔板成像系統(tǒng)明場模式下記錄的SW480細胞形態(tài)見圖1,與對照組相比,SW480細胞經(jīng)熊果酸和Hedgehog信號通路抑制劑GANT-61給藥處理后,細胞貼壁能力降低,形態(tài)發(fā)生明顯改變,逐漸皺縮變圓,且隨著熊果酸濃度的增加,細胞皺縮和碎片化的比例增加。
MTT比色法檢測熊果酸對SW480細胞增殖的影響,結(jié)果見圖2,與對照組(0 μmol/L)相比,在40 μmol/L范圍內(nèi),隨著熊果酸濃度增加,細胞存活率急劇降低,當熊果酸濃度大于40 μmol/L時,對SW480細胞的存活率影響達到平穩(wěn)閾值。通過分析得出熊果酸干預24 h對SW480細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為18.16 μmol/L,基于IC50,后續(xù)實驗設定熊果酸對SW480細胞的干預濃度為5、10、20 μmol/L。
圖1 熊果酸對SW480細胞形態(tài)的影響
圖2 熊果酸對SW480細胞增殖的影響()
細胞劃痕法檢測熊果酸對SW480細胞遷移的影響,結(jié)果見圖3,與對照組及0 h相比,熊果酸處理后12 h和24 h時間點的細胞劃痕的愈合面積顯著減?。ǎ?.01、0.001),說明熊果酸能夠抑制SW480細胞的遷移能力,且這種抑制作用隨著熊果酸干預濃度的增加而增強。
Hoechst/PI染色法觀察熊果酸誘導SW480細胞凋亡的情況,結(jié)果見圖4,與對照組相比,熊果酸干預后細胞呈現(xiàn)凋亡早期染色質(zhì)固縮所致的致密濃染,顏色過于飽和,甚至有些發(fā)白,表明熊果酸能夠誘導SW480細胞凋亡,這種誘導作用隨著熊果酸干預濃度的增加而增強,值得注意的是,熊果酸高濃度(20 μmol/L)處理誘導的細胞凋亡數(shù)量顯著高于Hedgehog信號通路抑制劑GANT-61(20 μmol/L)處理組。
JC-1染色法觀察熊果酸對SW480細胞線粒體膜電位的影響,結(jié)果見圖5,與對照組相比,熊果酸干預后細胞的紅色熒光減弱,綠色熒光增強,表明熊果酸能使SW480細胞的線粒體膜電位降低,且膜電位降低程度隨著熊果酸干預濃度的增加而增大。
試劑盒檢測熊果酸對SW480細胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響,結(jié)果見圖6,與對照組相比,熊果酸各劑量干預后細胞的Caspase-3活性顯著升高(<0.05),熊果酸高劑量干預后細胞的Caspase-9活性顯著升高(<0.05),表明熊果酸能夠增強SW480細胞的Caspase-3、Caspase-9活性。
圖3 熊果酸對SW480細胞遷移能力的影響()
圖4 熊果酸對SW480細胞凋亡的影響()
圖5 熊果酸對SW480細胞線粒體膜電位的影響()
蛋白免疫印跡法檢測熊果酸對SW480細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達的影響,結(jié)果見圖7,與對照組相比,熊果酸(20 μmol/L)能顯著升高SW480細胞中促凋亡蛋白Bax表達量(<0.05),熊果酸各劑量均能顯著降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達量(<0.05),表明熊果酸能夠綜合調(diào)控凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2水平,促進SW480細胞發(fā)生凋亡。
與對照組比較:*P<0.05,圖7同
圖7 熊果酸對SW480細胞凋亡相關蛋白的影響()
蛋白免疫印跡法檢測熊果酸對SW480細胞Hedgehog信號通路蛋白SHh、Gli1、Ptch1、Smo、c-Myc、SuFu表達的影響,結(jié)果見圖8,與對照組相比,熊果酸能顯著降低SHh、Gli1、Ptch1、Smo、c-Myc蛋白的表達量(<0.05、0.01),顯著升高SuFu蛋白的表達量(<0.05),表明熊果酸能夠抑制Hedgehog信號通路的激活。
作為世界3大癌癥之一的結(jié)直腸癌,近年來隨著飲食的精細化、高熱量化和生活方式的久坐化、少運動化,結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率居高不下[18]。20世紀80年代,細胞凋亡開始作為癌癥治療的可行策略進入人們的視線,此后的30多年,人們一直致力于探索細胞凋亡在癌癥治療中的應用,促進腫瘤細胞凋亡不僅能保護正常細胞,死亡的腫瘤細胞還能促進臨床反應,減少腫瘤復發(fā)的幾率,未來靶向細胞凋亡作為癌癥治療的手段仍舊意義重大[19]。Hedgehog信號通路是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要信號通路SHh與Ptch1結(jié)合,Ptch1對Smo的抑制解除,Smo被激活釋放,Smo激活是將SHh信號跨膜傳遞至細胞質(zhì)的關鍵步驟,Smo激活后,SuFu與Gli1蛋白分離,Gli1釋放出來,開始轉(zhuǎn)錄靶基因[20],導致引起細胞分裂和修復受損DNA的原癌基因表達水平上調(diào)[21],此外SHh過表達和Gli1轉(zhuǎn)錄都能激活Bcl-2啟動子,導致抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平上調(diào)[22-23]。熊果酸是中藥白花蛇舌草的主要活性成分,《廣西中藥志》中記載白花蛇舌草:“治小兒疳積,毒蛇咬傷,癌腫(腫瘤)”。此外熊果酸在抗腫瘤方面藥效顯著,對腸道、肺、肝、腎都具有良好的保護作用[24]。基于Hedgehog信號通路參與了腫瘤細胞的凋亡逃逸,因此,本實驗將Hedgehog信號通路作為靶點,探索熊果酸通過Hedgehog信號通路抑制結(jié)直腸癌SW480細胞增殖的機制。
與對照組比較:*<0.05**<0.01
*< 0.05**< 0.01control group
本實驗結(jié)果證明熊果酸對結(jié)直腸癌SW480細胞具有良好的細胞毒作用,在一定劑量范圍內(nèi)對細胞形態(tài)的影響顯著,明顯抑制細胞的生長、遷移,誘導細胞凋亡,其機制可能是通過抑制Hedghog信號通路的激活,使得Hedgehog信號通路中的關鍵因子SHh、Gli1和協(xié)助細胞規(guī)避凋亡的原癌基因c-Myc被抑制,凋亡蛋白家族Bcl-2表達下調(diào),與僅含BH3區(qū)域蛋白(BH3-onlyproteins,BOPs)的結(jié)合減少,線粒體外膜開始產(chǎn)生孔隙,逐漸通透化,膜電位下降;Bax表達上調(diào),轉(zhuǎn)位到線粒體內(nèi)部,釋放細胞色素C,形成凋亡復合體,凋亡復合體的形成激活Caspase家族中的Caspase-9、Caspase-3等凋亡執(zhí)行者,從線粒體途徑誘發(fā)細胞凋亡,進而抑制SW480細胞的增殖。此外,本實驗發(fā)現(xiàn)熊果酸誘導細胞凋亡的作用優(yōu)于GANT-61,說明在熊果酸誘導SW480細胞凋亡的過程中,除Hedgehog信號通路參與外,其他通路也發(fā)揮了作用。因此,熊果酸通過綜合調(diào)控包括Hedgehog信號通路在內(nèi)的多種信號通路調(diào)控結(jié)直腸癌SW480細胞的形態(tài)、生長、增殖、遷移,誘導其發(fā)生線粒體途徑的凋亡,對臨床上靶向癌細胞凋亡療法和信號通路阻滯療法具有重大意義。本實驗結(jié)果為進一步研究Hedgehog信號通路靶點在結(jié)直腸癌治療中的應用提供了有效參考,為熊果酸在癌癥預防和治療方面的應用提供了科學依據(jù)。
利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突
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Mechanism study on ursolic acid induced apoptosis of colorectal cancer SW480 cells based on Hedgehog signaling pathway
ZHANG Meng, HE Man, SUN Qiang, CHEN Li, ZENG Sha, ZHAO Hui, YANG Han, LIU Mao-lun, REN Shan, XU Hai-bo
Department of Pharmacology, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China
To investigate the effects and mechanisms of ursolic acid on proliferation and apoptosis of human colorectal cancer cell SW480 through canonical Hedgehog signaling pathway.The effect of ursolic acid on cell morphology was observed by microscope. MTT colorimetric method, cell scratch experiment and Hoechest/PI staining were used to detect the effect of ursolic acid on cell viability, cell migration and cell apoptosis. Fluorescent probe method was used to detect the effect of ursolic acid on mitochondrial membrane potential. The effects of ursolic acid on Caspase-3 and Caspase-9 were detected by Caspase activity detection kit. The expressions of Hedgehog signaling pathway-related proteins SHh, Gli1, Ptch1, Smo, c-Myc, SuFu and apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2 were detected by Western blotting.Ursolic acid significantly affected the morphology of human colorectal cancer cell SW480; The migration ability of SW480 cells was decreased markedly; Mitochondrial membrane potential was decreased; The nuclei were densely stained; The activity of Caspase-3 and Caspase-9 was increased; SW480 cell apoptosis was found; The expression levels of Hedgehog signaling pathway related protein SuFu and apoptosis-related protein Bax were increased; The expression levels of apoptosis-related protein Bcl-2 and Hedgehog signaling pathway-related proteins SHh, Gli1, Ptch1, Smo c-Myc were decreased.Ursolic acid enable to inhibit the growth and proliferation and promote apoptosis of SW480 cells by inactivating Hedgehog signaling pathway.
ursolic acid; Hedgehog signaling pathway; human colorectal cancer cells SW480; cell proliferation; cell apoptosis
R285
A
0253 - 2670(2021)08 - 2365 - 09
10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.020
2020-11-15
國家自然科學基金項目(81573813);國家自然科學基金項目(81173598);四川省教育廳省屬高??蒲袆?chuàng)新團隊建設計劃項目(18TD0017);成都中醫(yī)藥大學“杏林學者”基金項目(YXRC2019002,ZRYY1917);成都中醫(yī)藥大學西南特色中藥資源重點實驗室開放研究基金資助項目(2020XSGG006)
張 夢,碩士研究生,研究方向為中藥藥理。
徐海波,博士,教授,博士生導師。E-mail: xuhb@hotmail.com
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