張 夢(mèng)，何 曼，孫 強(qiáng)，陳 莉，曾 沙，趙 暉，楊 寒，劉茂倫，任 珊，徐海波

基于Hedgehog信號(hào)通路的熊果酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

張 夢(mèng)，何 曼，孫 強(qiáng)，陳 莉，曾 沙，趙 暉，楊 寒，劉茂倫，任 珊，徐海波*

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 藥理系，四川 成都 611137

研究熊果酸通過(guò)經(jīng)典Hedgehog信號(hào)通路影響人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的作用及其機(jī)制。通過(guò)顯微鏡觀察熊果酸對(duì)SW480細(xì)胞形態(tài)的影響；采用MTT比色法檢測(cè)熊果酸對(duì)細(xì)胞活力的影響；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)熊果酸對(duì)細(xì)胞遷移的影響；Hoechest/PI染色法觀察熊果酸對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；熒光探針?lè)z測(cè)熊果酸對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響；Caspase活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熊果酸對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Caspase-3、Caspase-9的影響；蛋白免疫印跡法檢測(cè)Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)蛋白SHh、Gli1、Ptch1、Smo、c-Myc、SuFu及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)水平。SW480細(xì)胞經(jīng)熊果酸給藥后形態(tài)發(fā)生改變；細(xì)胞遷移能力顯著下降；線粒體膜電位降低；細(xì)胞核出現(xiàn)致密濃染；Caspase-3、Caspase-9活性升高；SW480細(xì)胞發(fā)生凋亡；Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)蛋白SuFu的表達(dá)水平升高，SHh、Gli1、Ptch1、Smo、c-Myc的表達(dá)水平下降；細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)水平升高，Bcl-2的表達(dá)水平下降。熊果酸對(duì)SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖具有抑制作用，通過(guò)抑制Hedgehog信號(hào)通路的激活促進(jìn)SW480細(xì)胞凋亡。

熊果酸；Hedgehog信號(hào)通路；人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

隨著現(xiàn)代生活水平的提高，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升，其中在發(fā)達(dá)國(guó)家上升趨勢(shì)尤為顯著。結(jié)直腸癌常見(jiàn)于老年群體，但近年來(lái)逐漸趨向年輕化，在年輕人中的死亡率逐年上升[1-2]。臨床治療結(jié)直腸癌的方法包括手術(shù)、放療、化療等，現(xiàn)代治療多根據(jù)結(jié)直腸癌靶點(diǎn)、異質(zhì)性和耐藥性等特點(diǎn)采取廣譜療法。目前結(jié)直腸癌臨床治療的常用藥物如貝伐單抗、卡培他濱、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑等都已有較為深入的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用[3-5]，盡管?chē)?guó)內(nèi)外均對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)防和治療有大量的研究報(bào)道，為臨床眾多結(jié)直腸癌患者帶來(lái)福音，但對(duì)其分子機(jī)制和治療靶點(diǎn)的研究有待深入。

熊果酸是一類(lèi)具有顯著生物活性的五環(huán)三萜類(lèi)化合物，廣泛存在于多種水果、蔬菜中，同時(shí)也是中藥材白花蛇舌草、冬凌草、木瓜、夏枯草等的主要活性成分[6-9]，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗誘變等藥理活性[10-11]。目前已有大量關(guān)于熊果酸抗癌機(jī)制報(bào)道，包括結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌、皮膚癌[12-16]等。Hedgehog信號(hào)通路近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥性階段[17]，然而未見(jiàn)有關(guān)于熊果酸通過(guò)Hedgehog信號(hào)通路抑制結(jié)直腸癌的研究，因此本研究以人結(jié)直腸腫瘤SW480細(xì)胞為模型，檢測(cè)熊果酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移及細(xì)胞凋亡方面的影響，初步探索熊果酸通過(guò)Hedgehog信號(hào)通路對(duì)結(jié)直腸癌的作用效果，為臨床結(jié)直腸癌的治療提供更多的用藥選擇和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞與藥物

人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；熊果酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)MUST-18072310），購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，Hedgehog信號(hào)通路抑制劑GANT-61（C27H35N5，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)#21798），購(gòu)自美國(guó)Med Chem Express（MCE）公司。

1.2 試劑

DMEM低糖細(xì)胞培養(yǎng)基（批號(hào)SLBT7314），美國(guó)Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)121D039）、胰蛋白酶（批號(hào)HJ202410）、青霉素鏈霉素雙抗（批號(hào)HJ202605），索萊寶科技有限公司；胎牛血清（批號(hào)20180524），賽澳美細(xì)胞技術(shù)有限公司；抗熒光淬滅封片液（含Hoechst33324和碘化丙啶（propidium iodide，PI，批號(hào)121818191028）、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（批號(hào)100918190307）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)P1002）、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)P0006）、MTT試劑盒（批號(hào)C0009-2）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)071018190123）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-9）活性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)060618200415），碧云天科技有限公司；Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)抗體、音猬因子（sonic hedgehog，SHh）、GLI家族鋅指蛋白1（GLI family zinc finger protein 1，Gli1）、G蛋白偶聯(lián)受體蛋白（smoothened，Smo）、原癌基因蛋白（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）、蘇氨酸蛋白激酶Fused抑制因子（suppressor of Fused，SuFu），武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；表面受體（Patched，Ptch1），美國(guó)Immunoway公司。細(xì)胞凋亡相關(guān)抗體：B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），美國(guó)Immunoway公司；Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax），武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。內(nèi)參抗體：甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、山羊抗兔IgG二抗，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 儀器

3001多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；DMI3000B倒置顯微鏡、SP8 SR激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；QUOTQTION電泳儀、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）Forma3111CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；AllegraX?-12series離心機(jī)（美國(guó)BECK MAN Coulter）；CYT5MFV微孔板成像系統(tǒng)（美國(guó)BioTek公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SW480細(xì)胞用含有10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置于37 ℃、5% CO2的環(huán)境中。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，2～3 d更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)80%～90%時(shí)，按1∶2比例進(jìn)行傳代，傳至第5代后部分用于保存，部分用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞形態(tài)

取出處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞后，以1.0×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度，500 μL/孔的體積接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組更換含0.1%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、給藥組更換含不同濃度（5、10、20 μmol/L）熊果酸、陽(yáng)性藥組更換GANT-61（20 μmol/L）的培養(yǎng)基（100 μL/孔）處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，于微孔板成像系統(tǒng)中觀察記錄細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞形態(tài)。

2.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖

采用“2.2”項(xiàng)方法處理細(xì)胞，以1.0×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度，100 μL/孔的體積接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組更換含0.1% DMSO、給藥組更換含不同濃度（5、10、20、40、60、80、100、120、140 μmol/L）熊果酸的培養(yǎng)基（100 μL/孔）處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，更換含5 mg/mL MTT的培養(yǎng)基（100 μL/孔）處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，更換含5 mg/mL MTT的培養(yǎng)基（100 μL/孔）處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，更換DMSO（150 μL/孔）處理細(xì)胞結(jié)晶，振蕩10～15 min，待結(jié)晶物充分溶解后，在酶標(biāo)儀中測(cè)定波長(zhǎng)570 nm下的吸光度（）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝藥物/對(duì)照

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

采用“2.2”項(xiàng)方法處理細(xì)胞，以1.0×106個(gè)/mL的細(xì)胞密度，500 μL/孔的體積接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h待細(xì)胞高密度貼壁后，手持移液器，使槍尖垂直于培養(yǎng)板底部，水平劃線。然后對(duì)照組更換含0.1% DMSO、給藥組更換含不同濃度（5、10、20 μmol/L）熊果酸、陽(yáng)性藥組更換含GANT-61（20 μmol/L）的培養(yǎng)基（100 μL/孔）處理細(xì)胞，在加藥后0、12、24 h時(shí)間點(diǎn)于顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞劃痕的愈合情況。各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的劃痕面積采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)，以對(duì)照組（0 h）的劃痕面積為基準(zhǔn)，計(jì)算相對(duì)劃痕面積。

2.5 Hoechest/PI染色法觀察細(xì)胞凋亡

在細(xì)胞發(fā)生凋亡的初期階段，細(xì)胞膜還未破損，但細(xì)胞核染色質(zhì)開(kāi)始固縮，因此通過(guò)Hoechst/PI染色觀察初期細(xì)胞凋亡。采用“2.2”項(xiàng)方法處理細(xì)胞，以1.0×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度，1 mL/孔的體積接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組更換含0.1% DMSO、給藥組更換含不同濃度（5、10、20 μmol/L）熊果酸、陽(yáng)性藥組更換含GANT-61（20 μmol/L）的培養(yǎng)基（1 mL/孔）處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗后每孔加入50 μL含Hoechst 33324和PI的抗熒光淬滅封片液，然后于激光共聚焦顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞凋亡情況。

2.6 JC-1染色法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位

在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期階段，線粒體膜電位會(huì)發(fā)生改變，因此通過(guò)檢測(cè)線粒體膜電位的變化來(lái)考察細(xì)胞早期凋亡。采用“2.2”項(xiàng)方法處理細(xì)胞，以1.0×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度，500 μL/孔的體積接種24孔培養(yǎng)板于中，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組更換含0.1% DMSO、給藥組更換含不同濃度（5、10、20 μmol/L）熊果酸、陽(yáng)性藥組更換含GANT-61（20 μmol/L）的培養(yǎng)基（500 μL/孔）處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，按照線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1法）說(shuō)明書(shū)染色，在微孔板成像系統(tǒng)下觀察線粒體膜電位的變化。

2.7 Caspase-3、Caspase-9活性的檢測(cè)

采用“2.2”項(xiàng)方法處理細(xì)胞，以1.0×106個(gè)/mL的細(xì)胞密度，1 mL/孔的體積接種6孔培養(yǎng)板于中，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組更換含0.1% DMSO、給藥組更換含不同濃度（5、10、20 μmol/L）熊果酸、陽(yáng)性藥組更換含GANT-61（20 μmol/L）的培養(yǎng)基（1 mL/孔）處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，每個(gè)樣品加入200 μL裂解液，收集裂解液后部分采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度在1～3 mg/mL時(shí)，剩余樣品按照Caspase-3、Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒設(shè)定反應(yīng)體系，待體系顏色變化明顯時(shí)在酶標(biāo)儀中測(cè)定波長(zhǎng)405 nm下的值，并計(jì)算酶活力單位。

2.8 蛋白免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平

采用“2.2”項(xiàng)方法處理細(xì)胞，以5.0×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度，1 mL/孔的體積接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組更換含0.1% DMSO、給藥組更換含不同濃度（5、10、20 μmol/L）熊果酸、陽(yáng)性藥組更換含GANT-61（20 μmol/L）的培養(yǎng)基（1 mL/孔）處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，每個(gè)樣品加入200 μL預(yù)冷的增強(qiáng)型RIPA裂解液，收集裂解液后部分采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定蛋白濃度，剩余部分按4∶1加入5×蛋白上樣緩沖液，混勻后加熱制樣以備用。制備10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠，分離蛋白樣品，濕法轉(zhuǎn)膜，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉90 min，按比例加入相應(yīng)一抗后于4 ℃孵育過(guò)夜，次日更換二抗孵育90 min，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像，采用Image Lab軟件進(jìn)行蛋白條帶分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對(duì)SW480細(xì)胞形態(tài)的影響

微孔板成像系統(tǒng)明場(chǎng)模式下記錄的SW480細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1，與對(duì)照組相比，SW480細(xì)胞經(jīng)熊果酸和Hedgehog信號(hào)通路抑制劑GANT-61給藥處理后，細(xì)胞貼壁能力降低，形態(tài)發(fā)生明顯改變，逐漸皺縮變圓，且隨著熊果酸濃度的增加，細(xì)胞皺縮和碎片化的比例增加。

3.2 對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響

MTT比色法檢測(cè)熊果酸對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2，與對(duì)照組（0 μmol/L）相比，在40 μmol/L范圍內(nèi)，隨著熊果酸濃度增加，細(xì)胞存活率急劇降低，當(dāng)熊果酸濃度大于40 μmol/L時(shí)，對(duì)SW480細(xì)胞的存活率影響達(dá)到平穩(wěn)閾值。通過(guò)分析得出熊果酸干預(yù)24 h對(duì)SW480細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為18.16 μmol/L，基于IC50，后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定熊果酸對(duì)SW480細(xì)胞的干預(yù)濃度為5、10、20 μmol/L。

圖1 熊果酸對(duì)SW480細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2 熊果酸對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響()

3.3 對(duì)SW480細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞劃痕法檢測(cè)熊果酸對(duì)SW480細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3，與對(duì)照組及0 h相比，熊果酸處理后12 h和24 h時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞劃痕的愈合面積顯著減小（＜0.01、0.001），說(shuō)明熊果酸能夠抑制SW480細(xì)胞的遷移能力，且這種抑制作用隨著熊果酸干預(yù)濃度的增加而增強(qiáng)。

3.4 對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst/PI染色法觀察熊果酸誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡的情況，結(jié)果見(jiàn)圖4，與對(duì)照組相比，熊果酸干預(yù)后細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡早期染色質(zhì)固縮所致的致密濃染，顏色過(guò)于飽和，甚至有些發(fā)白，表明熊果酸能夠誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡，這種誘導(dǎo)作用隨著熊果酸干預(yù)濃度的增加而增強(qiáng)，值得注意的是，熊果酸高濃度（20 μmol/L）處理誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著高于Hedgehog信號(hào)通路抑制劑GANT-61（20 μmol/L）處理組。

3.5 對(duì)SW480細(xì)胞線粒體膜電位的影響

JC-1染色法觀察熊果酸對(duì)SW480細(xì)胞線粒體膜電位的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5，與對(duì)照組相比，熊果酸干預(yù)后細(xì)胞的紅色熒光減弱，綠色熒光增強(qiáng)，表明熊果酸能使SW480細(xì)胞的線粒體膜電位降低，且膜電位降低程度隨著熊果酸干預(yù)濃度的增加而增大。

3.6 對(duì)SW480細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響

試劑盒檢測(cè)熊果酸對(duì)SW480細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6，與對(duì)照組相比，熊果酸各劑量干預(yù)后細(xì)胞的Caspase-3活性顯著升高（＜0.05），熊果酸高劑量干預(yù)后細(xì)胞的Caspase-9活性顯著升高（＜0.05），表明熊果酸能夠增強(qiáng)SW480細(xì)胞的Caspase-3、Caspase-9活性。

圖3 熊果酸對(duì)SW480細(xì)胞遷移能力的影響()

圖4 熊果酸對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響()

圖5 熊果酸對(duì)SW480細(xì)胞線粒體膜電位的影響()

3.7 對(duì)SW480細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

蛋白免疫印跡法檢測(cè)熊果酸對(duì)SW480細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7，與對(duì)照組相比，熊果酸（20 μmol/L）能顯著升高SW480細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax表達(dá)量（＜0.05），熊果酸各劑量均能顯著降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量（＜0.05），表明熊果酸能夠綜合調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2水平，促進(jìn)SW480細(xì)胞發(fā)生凋亡。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05，圖7同

圖7 熊果酸對(duì)SW480細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響()

3.8 對(duì)SW480細(xì)胞Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

蛋白免疫印跡法檢測(cè)熊果酸對(duì)SW480細(xì)胞Hedgehog信號(hào)通路蛋白SHh、Gli1、Ptch1、Smo、c-Myc、SuFu表達(dá)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8，與對(duì)照組相比，熊果酸能顯著降低SHh、Gli1、Ptch1、Smo、c-Myc蛋白的表達(dá)量（＜0.05、0.01），顯著升高SuFu蛋白的表達(dá)量（＜0.05），表明熊果酸能夠抑制Hedgehog信號(hào)通路的激活。

4 討論

作為世界3大癌癥之一的結(jié)直腸癌，近年來(lái)隨著飲食的精細(xì)化、高熱量化和生活方式的久坐化、少運(yùn)動(dòng)化，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率居高不下[18]。20世紀(jì)80年代，細(xì)胞凋亡開(kāi)始作為癌癥治療的可行策略進(jìn)入人們的視線，此后的30多年，人們一直致力于探索細(xì)胞凋亡在癌癥治療中的應(yīng)用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡不僅能保護(hù)正常細(xì)胞，死亡的腫瘤細(xì)胞還能促進(jìn)臨床反應(yīng)，減少腫瘤復(fù)發(fā)的幾率，未來(lái)靶向細(xì)胞凋亡作為癌癥治療的手段仍舊意義重大[19]。Hedgehog信號(hào)通路是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要信號(hào)通路SHh與Ptch1結(jié)合，Ptch1對(duì)Smo的抑制解除，Smo被激活釋放，Smo激活是將SHh信號(hào)跨膜傳遞至細(xì)胞質(zhì)的關(guān)鍵步驟，Smo激活后，SuFu與Gli1蛋白分離，Gli1釋放出來(lái)，開(kāi)始轉(zhuǎn)錄靶基因[20]，導(dǎo)致引起細(xì)胞分裂和修復(fù)受損DNA的原癌基因表達(dá)水平上調(diào)[21]，此外SHh過(guò)表達(dá)和Gli1轉(zhuǎn)錄都能激活Bcl-2啟動(dòng)子，導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平上調(diào)[22-23]。熊果酸是中藥白花蛇舌草的主要活性成分，《廣西中藥志》中記載白花蛇舌草：“治小兒疳積，毒蛇咬傷，癌腫（腫瘤）”。此外熊果酸在抗腫瘤方面藥效顯著，對(duì)腸道、肺、肝、腎都具有良好的保護(hù)作用[24]。基于Hedgehog信號(hào)通路參與了腫瘤細(xì)胞的凋亡逃逸，因此，本實(shí)驗(yàn)將Hedgehog信號(hào)通路作為靶點(diǎn)，探索熊果酸通過(guò)Hedgehog信號(hào)通路抑制結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖的機(jī)制。

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明熊果酸對(duì)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞具有良好的細(xì)胞毒作用，在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響顯著，明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制Hedghog信號(hào)通路的激活，使得Hedgehog信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子SHh、Gli1和協(xié)助細(xì)胞規(guī)避凋亡的原癌基因c-Myc被抑制，凋亡蛋白家族Bcl-2表達(dá)下調(diào)，與僅含BH3區(qū)域蛋白（BH3-onlyproteins，BOPs）的結(jié)合減少，線粒體外膜開(kāi)始產(chǎn)生孔隙，逐漸通透化，膜電位下降；Bax表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)位到線粒體內(nèi)部，釋放細(xì)胞色素C，形成凋亡復(fù)合體，凋亡復(fù)合體的形成激活Caspase家族中的Caspase-9、Caspase-3等凋亡執(zhí)行者，從線粒體途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制SW480細(xì)胞的增殖。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熊果酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用優(yōu)于GANT-61，說(shuō)明在熊果酸誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，除Hedgehog信號(hào)通路參與外，其他通路也發(fā)揮了作用。因此，熊果酸通過(guò)綜合調(diào)控包括Hedgehog信號(hào)通路在內(nèi)的多種信號(hào)通路調(diào)控結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)、增殖、遷移，誘導(dǎo)其發(fā)生線粒體途徑的凋亡，對(duì)臨床上靶向癌細(xì)胞凋亡療法和信號(hào)通路阻滯療法具有重大意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究Hedgehog信號(hào)通路靶點(diǎn)在結(jié)直腸癌治療中的應(yīng)用提供了有效參考，為熊果酸在癌癥預(yù)防和治療方面的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism study on ursolic acid induced apoptosis of colorectal cancer SW480 cells based on Hedgehog signaling pathway

ZHANG Meng, HE Man, SUN Qiang, CHEN Li, ZENG Sha, ZHAO Hui, YANG Han, LIU Mao-lun, REN Shan, XU Hai-bo

Department of Pharmacology, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To investigate the effects and mechanisms of ursolic acid on proliferation and apoptosis of human colorectal cancer cell SW480 through canonical Hedgehog signaling pathway.The effect of ursolic acid on cell morphology was observed by microscope. MTT colorimetric method, cell scratch experiment and Hoechest/PI staining were used to detect the effect of ursolic acid on cell viability, cell migration and cell apoptosis. Fluorescent probe method was used to detect the effect of ursolic acid on mitochondrial membrane potential. The effects of ursolic acid on Caspase-3 and Caspase-9 were detected by Caspase activity detection kit. The expressions of Hedgehog signaling pathway-related proteins SHh, Gli1, Ptch1, Smo, c-Myc, SuFu and apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2 were detected by Western blotting.Ursolic acid significantly affected the morphology of human colorectal cancer cell SW480; The migration ability of SW480 cells was decreased markedly; Mitochondrial membrane potential was decreased; The nuclei were densely stained; The activity of Caspase-3 and Caspase-9 was increased; SW480 cell apoptosis was found; The expression levels of Hedgehog signaling pathway related protein SuFu and apoptosis-related protein Bax were increased; The expression levels of apoptosis-related protein Bcl-2 and Hedgehog signaling pathway-related proteins SHh, Gli1, Ptch1, Smo c-Myc were decreased.Ursolic acid enable to inhibit the growth and proliferation and promote apoptosis of SW480 cells by inactivating Hedgehog signaling pathway.

ursolic acid; Hedgehog signaling pathway; human colorectal cancer cells SW480; cell proliferation; cell apoptosis

R285

A

0253 - 2670(2021)08 - 2365 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.020

2020-11-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81573813）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81173598）；四川省教育廳省屬高校科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（18TD0017）；成都中醫(yī)藥大學(xué)“杏林學(xué)者”基金項(xiàng)目（YXRC2019002，ZRYY1917）；成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色中藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放研究基金資助項(xiàng)目（2020XSGG006）

張 夢(mèng)，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幚怼?/p>

徐海波，博士，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail: xuhb@hotmail.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]