陳啟軍，于 嵐，趙文文，許榮蓉，陳筱清，吳 霞，巴寅穎

遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠腸道菌群的作用研究

陳啟軍，于 嵐，趙文文，許榮蓉，陳筱清，吳 霞*，巴寅穎*

首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069

探討遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠腸道菌群的影響及其可能的作用機(jī)制。采用孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）方法建立抑郁大鼠模型，SD大鼠隨機(jī)分為對照組、空白給藥組、模型組、氟西汀（2 mg/kg）組和遠(yuǎn)志提取物高、中、低劑量（1.5、1.0、0.5 g/kg）組。觀察各組大鼠行為學(xué)并檢測海馬組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物水平；采用ELISA法檢測大鼠血清中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（corticotropin-releasing factor，CRF）、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）水平；采用透射電鏡（TEM）觀察大鼠十二指腸和結(jié)腸上皮的超微結(jié)構(gòu)變化；采用16S rRNA測序檢測大鼠糞便腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化。與模型組比較，遠(yuǎn)志提取物可明顯改善大鼠的抑郁樣行為（＜0.05、0.01、0.001），顯著升高海馬組織中去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、二羥基苯乙酸（dihydroxyphenyl acetic acid，DOPAC）和5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）水平（＜0.05、0.01、0.001），顯著降低血清中CRF、ACTH、CORT、IL-6和LPS水平（＜0.01、0.001），減輕其下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸的功能亢進(jìn)狀態(tài)；同時(shí)遠(yuǎn)志提取物對大鼠腸道內(nèi)的菌群失調(diào)具有調(diào)節(jié)作用。遠(yuǎn)志提取物可以通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)、恢復(fù)腸屏障功能、降低腸源性內(nèi)毒素釋放、減輕機(jī)體炎癥水平，從而發(fā)揮抗抑郁作用。

遠(yuǎn)志提取物；抑郁癥；慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激；腸道菌群；16S rRNA

抑郁癥是常見的情感障礙性精神疾病，其臨床表現(xiàn)為情緒低落、食欲不振、思維遲鈍、言語興趣減退、失眠等，患者嚴(yán)重時(shí)常有自殺傾向[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)顯示，預(yù)測到2030年，抑郁癥將成為全球疾病負(fù)擔(dān)的主要原因[2]。抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，通常認(rèn)為其與腦內(nèi)5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）等神經(jīng)遞質(zhì)減少以及下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸功能亢進(jìn)和免疫炎癥系統(tǒng)異常等因素有關(guān)[3]。研究表明，抑郁癥患者與健康人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異，抑郁癥患者腸道內(nèi)擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）相對豐度明顯升高，厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度顯著降低[4]。研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)腸道菌群能夠改善抑郁癥患者或抑郁模型動物的抑郁癥狀。腸道菌群的改變可通過HPA軸、免疫炎癥反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)信號傳導(dǎo)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展[4]。抑郁癥患者常伴有腸屏障功能障礙、壓力應(yīng)激和HPA軸功能亢進(jìn)，腸黏膜的通透性增加[5]。腸屏障受損不僅會破壞腸道菌群平衡，腸道菌群的失衡及腸黏膜通透性增加也會導(dǎo)致腸道內(nèi)毒素增加并大量進(jìn)入到血及組織中，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)釋放，進(jìn)一步加重腸道屏障損傷，同時(shí)啟動系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的神經(jīng)功能的改變在抑郁癥發(fā)病過程中起到重要作用[6]。

遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志W(wǎng)illd.或卵葉遠(yuǎn)志L.的干燥根，具有安神益智、交通心腎的功效，臨床上常用于治療失眠、多夢、心悸、神志恍惚等癥狀[7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，遠(yuǎn)志能夠通過影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)功能、拮抗HPA軸功能亢進(jìn)、上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase B，TrkB）表達(dá)等，從而發(fā)揮抗抑郁作用[8]。遠(yuǎn)志皂苷和遠(yuǎn)志寡糖酯類為遠(yuǎn)志提取物中的抗抑郁活性成分，但這2類成分吸收差、生物利用度低[9-12]，提示其可能通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)發(fā)揮抗抑郁作用。本研究采用孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)知溫和刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）建立抑郁大鼠模型，評價(jià)遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠行為學(xué)指標(biāo)、海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)水平、HPA軸功能、腸屏障功能及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，探討腸道菌群在遠(yuǎn)志治療抑郁癥中的作用，并以京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)進(jìn)行菌群功能預(yù)測分析，尋找顯著改變的代謝途徑，分析遠(yuǎn)志抗抑郁作用的可能通路，為進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠56只，6周齡，體質(zhì)量220～250 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SYXK（京）2010-0020。動物于溫度（24±1）℃、相對濕度（60±5）%、自然晝夜節(jié)律光照環(huán)境，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號AEEI-2015-054）。

1.2 藥材

遠(yuǎn)志飲片（批號18070101，產(chǎn)地為山西）購自北京人衛(wèi)中藥飲片廠，由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院羅容副教授鑒定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志W(wǎng)illd.的干燥根。

1.3 藥品與試劑

3,6′-二芥子?；崽牵ㄙ|(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號PRF8041747）、細(xì)葉遠(yuǎn)志苷A（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號PRF9011241）、遠(yuǎn)志皂苷B（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號PRF8112741）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；鹽酸氟西汀膠囊（批號J2017002，20 mg/粒）購自禮來蘇州制藥有限公司；大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（corticotropin-releasing factor，CRF）ELISA試劑盒（批號BG20190713RAC）、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）ELISA試劑盒（批號BG20190713RAC）、皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）ELISA試劑盒（批號BG20190713RAC）、大鼠脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）ELISA試劑盒（批號BG200831RAC）購自上海藍(lán)基生物科技有限公司；大鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號R200827-003a）購自欣博盛生物科技有限公司；糞便DNA提取試劑盒（批號51504）購自德國QIAGEN公司；5-HT（批號H9523）、NE（批號A7257）、多巴胺（dopamine，DA，批號H8502）購自美國Sigma-Aldrich公司；5-羥吲哚乙酸（5-hydroxy- indoleacetic acid，5-HIAA，批號H8876）、高香草酸（high vanillic acid，HVA，批號H1252）和二羥基苯乙酸（dihydroxyphenyl acetic acid，DOPAC，批號850217）對照品購自美國Sigma-Aldrich公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%。

1.4 儀器

HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA公司）；低溫冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）；DYY-7C電泳儀（北京六一儀器廠）；NanoDrop 1000紫外分光光度計(jì)、U3000超高液相色譜儀（美國Thermo公司）；GelDocXR凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；ELX800酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）；曠場實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司）；Waters 2965高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters公司）；HT7700透射電子顯微鏡（TEM，日本日立公司）。

2 方法

2.1 混合對照品的制備

分別取3,6′-二芥子?；崽恰⒓?xì)葉遠(yuǎn)志苷A、遠(yuǎn)志皂苷B對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.332、0.410、0.406 mg/mL的3,6′-二芥子?；崽恰⒓?xì)葉遠(yuǎn)志苷A、遠(yuǎn)志皂苷B儲備液。精密量取以上對照品儲備液，配制成3,6′-二芥子酰基蔗糖、細(xì)葉遠(yuǎn)志苷A、遠(yuǎn)志皂苷B質(zhì)量濃度分別為0.111、0.068、0.203 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2 遠(yuǎn)志提取物的制備

稱取遠(yuǎn)志飲片1.2 kg，加入8倍量60%乙醇回流提取1.5 h，共提取3次，合并提取液，濾過，回收乙醇得到遠(yuǎn)志提取物528 g，出膏率為44%。采用超高效液相色譜法（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）對遠(yuǎn)志提取物中3,6′-二芥子?；崽?、細(xì)葉遠(yuǎn)志苷A和遠(yuǎn)志皂苷B的含量進(jìn)行測定。色譜柱為Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～3 min，15%～20% A；3～8 min，20%～27% A；8～12 min，27%～36% A；12～30 min，36% A；體積流量為0.4 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測波長為330 nm。

2.3 CUMS模型建立、分組與給藥

SD大鼠隨機(jī)分為對照組、空白給藥組、模型組、鹽酸氟西?。? mg/kg）組和遠(yuǎn)志提取物高、中、低劑量（1.5、1.0、0.5 g/kg，分別相當(dāng)于臨床1.5倍劑量、臨床等效劑量、臨床0.5倍劑量），每組8只。除對照組和空白給藥組，其余各組采用孤養(yǎng)結(jié)合CUMS方法建立抑郁大鼠模型[13]。應(yīng)激方式包括禁水24 h、禁食24 h、潮濕墊料24 h、4 ℃冰水游泳5 min、夾尾1 min、束縛2 h、頻閃24 h、噪音24 h、光照24 h，每天隨機(jī)安排1～2種刺激，持續(xù)8周。遠(yuǎn)志提取物以蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為132、88、44 mg/mL的溶液，分別用作遠(yuǎn)志提取物高、中、低劑量組。造模同時(shí)，各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物（5 mL/kg），空白給藥組大鼠ig等體積高劑量遠(yuǎn)志提取物，對照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)8周，每2周記錄大鼠體質(zhì)量。

2.4 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠行為學(xué)的影響

參照文獻(xiàn)方法[14]，第8周測定大鼠的糖水偏好率、曠場行為（總移動距離、中央?yún)^(qū)逗留時(shí)間和直立次數(shù)）和強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間。

2.5 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠血清中CORT、CRF、ACTH、IL-6和LPS水平的影響

行為學(xué)測試結(jié)束后，大鼠ip戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，靜置1～2 h，4 ℃、3000 r/min離心15 min，收集血清，于?80 ℃保存。按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清中CRF、ACTH、CORT、IL-6和LPS水平。

2.6 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠海馬組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物水平的影響

行為學(xué)測試結(jié)束后，大鼠斷頭取海馬組織，稱定質(zhì)量，加入120 μL冰冷樣品預(yù)處理A液（0.4 mol/L高氯酸），冰浴中快速勻漿，靜置30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸取上清液90 μL，加入45 μL樣品預(yù)處理B液（20 mmol/L檸檬酸鉀、0.3 mol/L磷酸氫二鉀、2 mmol/L EDTA·2Na），渦旋混勻，冰浴靜置30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過。根據(jù)文獻(xiàn)方法[15]，使用Waters 2965高效液相色譜系統(tǒng)檢測海馬組織中DA、5-HT、NE、DOPAC、5-HIAA、HVA水平。色譜柱為Waters symmetry shield RP 18（150 mm×3.9 mm，5 μm）；流動相為緩沖鹽溶液（50 mmol/L單水檸檬酸、70 mmol/L無水乙酸鈉、10 mmol/L EDTA·2Na、180 mmol/L辛烷磺酸鈉）-甲醇（92∶8）；體積流量為0.8 mL/min；檢測電壓為0.6 V；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為40 μL。

2.7 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠十二指腸和結(jié)腸上皮超微結(jié)構(gòu)的影響

取大鼠十二指腸和結(jié)腸上皮組織，于2.5%戊二醛緩沖液中固定2 h，用0.1 mol/L PB緩沖液洗滌15 min，洗滌3次；于1%鋨酸中固定1 h，乙醇梯度脫水、環(huán)氧樹脂包埋后切片（厚50～70 nm）。于TEM下觀察十二指腸和結(jié)腸上皮的超微結(jié)構(gòu)變化。

2.8 腸道菌群16S rRNA基因測序分析

行為學(xué)測試結(jié)束后，收集大鼠新鮮糞便，于?80 ℃保存。采用糞便DNA提取試劑盒提取糞便樣品總DNA，NanoDrop1000測定DNA質(zhì)量濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量。采用引物338F和806R通過PCR擴(kuò)增樣品的V3～V4區(qū)域，進(jìn)行純化與定量后，構(gòu)建測序文庫。使用QIIME軟件，對有效序列按97%序列相似度進(jìn)行歸并和可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）劃分，以每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。將OTU的代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫（Release 13.8）中的模板序列進(jìn)行比對，得到所有OTU在微生物門、綱、目、科、屬、種分類水平下的菌群數(shù)信息。通過分類學(xué)組成分析、α多樣性分析、β多樣性分析和KEGG代謝途徑預(yù)測分析等方法對糞便腸道菌群進(jìn)行分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 遠(yuǎn)志提取物中3,6′-二芥子?；崽?、細(xì)葉遠(yuǎn)志苷A和遠(yuǎn)志皂苷B的含量

經(jīng)方法學(xué)考察，遠(yuǎn)志提取物中3,6′-二芥子?；崽?、細(xì)葉遠(yuǎn)志苷A和遠(yuǎn)志皂苷B分別在0.008 3～0.332 0、0.010 2～0.410 0、0.010 1～0.406 0 mg/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；3種成分的平均加樣回收率分別為101.22%、100.46%、99.70%，RSD分別為1.67%、2.81%、2.93%；精密度RSD分別為0.90%、1.27%、1.06%；重復(fù)性RSD分別為2.57%、2.66%、2.34%；24 h穩(wěn)定性RSD分別為1.56%、1.92%、2.03%。UPLC色譜圖見圖1，運(yùn)用該方法測得遠(yuǎn)志提取物中3,6′-二芥子?；崽恰⒓?xì)葉遠(yuǎn)志苷A和遠(yuǎn)志皂苷B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.77、3.89、15.94 mg/g。

1-3,6′-二芥子酰基蔗糖 2-細(xì)葉遠(yuǎn)志苷A 3-遠(yuǎn)志皂苷B

3.2 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠體質(zhì)量的影響

如圖2所示，與對照組比較，自第21天開始模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，自第35天開始氟西汀組大鼠體質(zhì)量明顯增加（＜0.05、0.001），遠(yuǎn)志提取物各劑量組大鼠體質(zhì)量呈升高趨勢。

3.3 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠抑郁樣行為的影響

糖水偏好實(shí)驗(yàn)、曠場實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)分別反映了大鼠的快感缺失程度、新環(huán)境探究欲望和行為絕望程度。如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠糖水偏好率、曠場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動總距離和直立次數(shù)顯著降低（＜0.001），強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間顯著升高（＜0.001），曠場中央?yún)^(qū)活動時(shí)間呈降低趨勢；與模型組比較，遠(yuǎn)志提取物各劑量組大鼠糖水偏好率、曠場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動總距離和直立次數(shù)均顯著升高（＜0.01、0.001），強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間顯著降低（＜0.001）；遠(yuǎn)志提取物高劑量組大鼠曠場中央?yún)^(qū)活動時(shí)間顯著增加（＜0.05）。

3.4 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠海馬中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物水平的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠海馬NE、5-HT、DA、DOPAC、5-HIAA水平明顯降低（＜0.05、0.01、0.001）；與模型組比較，遠(yuǎn)志提取物各劑量組大鼠海馬NE和5-HT水平明顯升高（＜0.01、0.001），遠(yuǎn)志提取物中劑量組大鼠海馬DOPAC和5-HIAA水平顯著升高（＜0.05、0.01），遠(yuǎn)志提取物低劑量組大鼠海馬5-HIAA水平顯著升高（＜0.05）。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

表1 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠海馬中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物水平的影響()

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001

##< 0.05##< 0.01###< 0.001control group;*< 0.05**< 0.01***< 0.001model group

3.5 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠HPA軸的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中CORT、ACTH和CRF水平均顯著升高（＜0.001），表明HPA軸功能呈亢進(jìn)狀態(tài)；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中CORT、ACTH和CRF水平均顯著降低（＜0.01、0.001），表明HPA軸功能亢進(jìn)狀態(tài)得到改善。

3.6 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠血清中IL-6和LPS水平的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-6和LPS水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，遠(yuǎn)志提取物高、中劑量組大鼠血清中IL-6和LPS水平顯著降低（＜0.01、0.001），遠(yuǎn)志提取物低劑量組大鼠血清中IL-6水平顯著降低（＜0.001）。

3.7 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠十二指腸和結(jié)腸上皮超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖5所示，對照組大鼠十二指腸和結(jié)腸上皮的絨毛豐富有序、結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間緊密連接正常；模型組大鼠十二指腸和結(jié)腸上皮黏膜嚴(yán)重受損，絨毛稀疏、萎縮甚至脫落，細(xì)胞間緊密連接的間隙增大，杯狀細(xì)胞明顯增多且呈空泡狀，排列紊亂、形態(tài)異常，杯狀細(xì)胞的黏蛋白顆粒分泌增多，顆粒缺乏包膜，主要為急性炎癥表現(xiàn)；遠(yuǎn)志提取物高劑量組大鼠腸黏膜損傷得到改善，十二指腸和結(jié)腸上皮的絨毛致密，排列整齊、結(jié)構(gòu)完整，緊密連接恢復(fù)正常，杯狀細(xì)胞較模型組減少，腸黏膜通透性降低。

圖3 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠血清中CORT、ACTH和CRF水平的影響()

圖4 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠血清中IL-6和LPS水平的影響()

圖5 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠十二指腸(A) 和結(jié)腸上皮(B) 超微結(jié)構(gòu)的影響

3.8 大鼠腸道菌群16S rRNA基因測序分析

3.8.1 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠腸道菌群多樣性的影響 如圖6所示，與對照組比較，空白給藥組大鼠的腸道菌群在屬水平的Shannon指數(shù)無明顯差異，模型組大鼠腸道菌群在屬水平的Shannon指數(shù)顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，氟西汀組和遠(yuǎn)志提取物高劑量組大鼠腸道菌群在屬水平的Shannon指數(shù)顯著降低（＜0.001），表明遠(yuǎn)志提取物能夠降低抑郁大鼠腸道菌群豐富度和多樣性。β多樣性分析通常從計(jì)算樣本之間的距離矩陣開始，以確定樣本之間微生物組成結(jié)構(gòu)的差異。主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）結(jié)果顯示，模型組大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)與對照組明顯分離，遠(yuǎn)志提取物組大鼠菌群結(jié)構(gòu)偏離模型組，向?qū)φ战M靠近，氟西汀組大鼠腸道菌群與對照組存在明顯差異，空白給藥組大鼠腸道菌群與對照組無明顯差異。

3.8.2 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠腸道菌群生物分類組成的影響 如圖7-A所示，在門水平上，各組大鼠糞便中厚壁菌門和擬桿菌門是最豐富的菌群。如圖7-B所示，與對照組比較，模型組大鼠腸道內(nèi)厚壁菌門和放線菌門相對豐度明顯降低（＜0.05、0.01），擬桿菌門和變形桿菌門相對豐度顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，遠(yuǎn)志提取物高劑量組腸道內(nèi)厚壁菌門和放線菌門相對豐度明顯升高（＜0.05、0.001），擬桿菌門和變形桿菌門相對豐度顯著降低（＜0.001）。

圖6 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠腸道菌群Shannon指數(shù)和PCoA的影響(n = 6)

圖7 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠腸道菌群在門水平上的物種相對豐度(A) 和顯著變化菌群相對豐度(B) 的影響(n = 6)

如圖8所示，在科水平上，模型組大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)與對照組明顯不同，遠(yuǎn)志提取物高劑量組大鼠的腸道菌群與對照組聚為一類，表明遠(yuǎn)志提取物高劑量組與對照組的腸道菌群結(jié)構(gòu)相似性較高。與對照組比較，模型組大鼠腸道內(nèi)瘤胃菌科（Ruminococcaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）相對豐度明顯降低（＜0.05、0.001），S24-7科（Muribaculaceae）和乳桿菌科（Lactobacillaceae）相對豐度顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，遠(yuǎn)志提取物高劑量組大鼠腸道內(nèi)瘤胃菌科和毛螺菌科相對豐度明顯升高（＜0.05、0.01），S24-7科和乳桿菌科相對豐度顯著降低（＜0.05）。

如圖9所示，在屬水平上，模型組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與對照組明顯不同，遠(yuǎn)志提取物高劑量組與對照組大鼠腸道菌群聚為一類，相似性較高。與對照組比較，模型組大鼠腸道內(nèi)乳桿菌屬Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcaceae_UCG_005_group和羅氏菌屬相對豐度明顯降低（＜0.05、0.001），擬桿菌屬顫桿菌屬和腸單胞球菌屬相對豐度顯著升高（＜0.001），Ruminococcaceae_UCG_014相對豐度呈降低趨勢；與模型組比較，遠(yuǎn)志提取物高劑量組大鼠腸道內(nèi)Ruminococcaceae_UCG_014、Lachnospiraceae_ NK4A136_group和_ group相對豐度明顯升高（＜0.01、0.001），擬桿菌屬、顫桿菌屬和腸單胞球菌屬相對豐度顯著降低（＜0.001）。

3.8.3 標(biāo)志菌群分析 采用線性判別分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）在不同組間定位具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)志菌群（＜0.01、lg(LefSe評分)＞4.0）。如圖10所示，LefSe分析發(fā)現(xiàn)了21個(gè)已鑒定的標(biāo)志菌群，其中Ruminococcaceae_UCG_014是模型組的標(biāo)志菌群，Lachnospiraceae_NK4A136_group是遠(yuǎn)志提取物高劑量組的標(biāo)志菌群。

圖8 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠腸道菌群在科水平上的熱圖分析(A) 和顯著變化菌群相對豐度(B) 的影響(n = 6)

圖9 遠(yuǎn)志提取物對抑郁大鼠腸道菌群在屬水平上的熱圖分析(A) 和顯著變化菌群相對豐度(B) 的影響(n = 6)

3.8.4 腸道菌群KEGG分析 如圖11所示，與模型組比較，遠(yuǎn)志提取物高劑量組大鼠腸道菌群的脂質(zhì)代謝、脂肪酸代謝和糖代謝途徑存在明顯差異（＜0.05）。

圖10 標(biāo)志菌群LefSe分析

圖11 腸道菌群KEGG分析

4 討論

抑郁癥是常見的、反復(fù)發(fā)作的精神心理障礙性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。應(yīng)激因素在抑郁癥的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用，長期壓力應(yīng)激是形成抑郁的主要因素。本研究采用孤養(yǎng)結(jié)合CUMS方法建立抑郁大鼠模型，大鼠隨機(jī)給予多變性和不可預(yù)測性應(yīng)激因子刺激，與人類抑郁癥的致病過程存在相似性。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠體質(zhì)量降低，表現(xiàn)出快感缺失、絕望行為增加、自主活動性降低以及對新環(huán)境的探索欲望降低的抑郁樣行為，海馬組織中DA、5-HT、NE、DOPAC、5-HIAA水平明顯降低，神經(jīng)遞質(zhì)功能減退，并出現(xiàn)了HPA軸功能亢進(jìn)；遠(yuǎn)志提取物能夠改善抑郁大鼠的抑郁樣行為，增強(qiáng)大鼠海馬組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平，并下調(diào)HPA軸CORT、ACTH和CRF水平，具有良好的抗抑郁作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志提取物具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。在腸道菌群結(jié)構(gòu)分析中，α多樣性主要用來反映菌群物種豐富度和均勻度。抑郁癥患者及抑郁模型動物腸道菌群的豐富度和多樣性增加[16]。PCoA用可視化方法直接觀察了不同組別間菌群的差異，本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，遠(yuǎn)志提取物使大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)更接近對照組，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

研究表明，抑郁癥患者或抑郁模型動物腸道菌群的物種組成發(fā)生顯著變化；在門水平上，抑郁模型動物腸道內(nèi)擬桿菌門和變形桿菌門相對豐度增加，厚壁菌門和放線菌門相對豐度降低，放線菌門可能是氯胺酮抗抑郁的標(biāo)志菌群[17-18]。本研究結(jié)果顯示，遠(yuǎn)志提取物能夠顯著降低抑郁大鼠腸道內(nèi)擬桿菌門和變形桿菌門相對豐度，顯著升高厚壁菌門和放線菌門相對豐度，表明遠(yuǎn)志提取物可以調(diào)節(jié)抑郁大鼠的腸道菌群組成并改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。

屬水平的菌群物種組成分析結(jié)果顯示，抑郁模型大鼠腸道內(nèi)乳桿菌屬Ruminococcaceae_UCG_ 014、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcaceae_UCG_005_group和羅氏菌屬相對豐度降低，上述菌屬均與維護(hù)腸屏障功能有關(guān)。其中羅氏菌屬、Ruminococcaceae_UCG_014和Lachnospiraceae_ NK4A136_group能夠產(chǎn)生短鏈脂肪酸[19-20]，短鏈脂肪酸是腸道菌群及其宿主腸上皮細(xì)胞的重要能量來源，能夠維持腸道酸堿平衡、修復(fù)腸黏膜損傷、緩解腸道炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)宿主腸道免疫并抑制有害病原菌生長[21]。羅氏菌屬和Lachnospiraceae_ NK4A136_group是產(chǎn)生丁酸鹽的主要菌屬[22-23]，富含這2個(gè)菌屬的小鼠腸上皮氧化和炎癥損傷會減少[24]。Lachnospiraceae_NK4A136_group與維護(hù)腸屏障完整性的因素呈正相關(guān)，與結(jié)腸中的促炎因子（LPS、IL-6）呈負(fù)相關(guān)[25]；_group相對豐度越低，腸道屏障越容易被破壞[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腸道內(nèi)上述腸屏障保護(hù)功能菌相對豐度減少，腸屏蔽功能受損，腸黏膜炎癥反應(yīng)加重；遠(yuǎn)志提取物能夠升高抑郁大鼠腸道內(nèi)上述菌群相對豐度，恢復(fù)腸屏障功能。此外，本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腸道內(nèi)擬桿菌屬和顫桿菌屬相對豐度顯著增加。嚴(yán)重抑郁癥和躁郁癥患者腸道內(nèi)顫桿菌屬相對豐度增加[27]。擬桿菌屬是一種革蘭陰性菌，能夠釋放LPS，LPS在腸屏障功能受損后更易被吸收入血，進(jìn)而誘導(dǎo)外周和中樞促炎癥細(xì)胞因子釋放[28]；促炎癥因子在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用，抑郁癥患者體內(nèi)的促炎癥因子水平高于健康人群[29]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，抑郁模型大鼠血清中LPS和促炎因子IL-6水平顯著升高；遠(yuǎn)志提取物組大鼠腸道內(nèi)擬桿菌屬和顫桿菌屬相對豐度降低，血清中LPS、IL-6水平顯著降低，提示遠(yuǎn)志提取物的抗抑郁作用可能與增加腸屏障保護(hù)功能菌、改善腸屏障功能，進(jìn)而降低腸源性內(nèi)毒素釋放、減輕機(jī)體炎癥水平有關(guān)。

研究表明，腸道菌群與HPA軸的功能和神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)關(guān)系密切。HPA軸亢進(jìn)會引起皮質(zhì)醇分泌增多，進(jìn)而增加腸黏膜通透性并使腸道菌群組成發(fā)生變化，升高血清中LPS水平；將正常動物的糞菌移植到抑郁模型動物中，能夠改善抑郁模型動物的HPA軸功能[30]。腸道菌群不僅能夠直接合成或分泌5-HT、NE、DA等神經(jīng)遞質(zhì)，還能通過調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞功能影響神經(jīng)遞質(zhì)的生成，神經(jīng)遞質(zhì)可能通過循環(huán)系統(tǒng)和迷走神經(jīng)影響中樞神經(jīng)遞質(zhì)功能[31-32]。但遠(yuǎn)志提取物改善HPA軸功能、增強(qiáng)神經(jīng)遞質(zhì)水平與菌群間的聯(lián)系需要進(jìn)一步研究。

通過KEGG功能代謝途徑分析可知，遠(yuǎn)志提取物主要影響脂質(zhì)代謝、脂肪酸代謝和糖代謝等途徑，其中脂肪酸代謝途徑可能與遠(yuǎn)志提取物增加抑郁大鼠腸道中能夠產(chǎn)生短鏈脂肪酸的菌群相對豐度有關(guān)。不飽和脂肪酸可通過影響多種神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞過程改善海馬功能，對情緒變化和抑郁癥狀具有調(diào)節(jié)作用[33]。Zheng等[34]發(fā)現(xiàn)抑郁樣獼猴外周和中樞鞘脂代謝失調(diào)與腸道菌群相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，糖代謝紊亂與抑郁癥相關(guān)。抑郁患者前額葉皮質(zhì)葡萄糖代謝減少[35]；抑郁模型動物小腸吸收葡萄糖的能力下降[36]；抑郁大鼠骨骼肌的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖儲存功能被低血糖及胰島素抑制[37]；抑郁大鼠丘腦葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體3表達(dá)降低[38]。

綜上所述，遠(yuǎn)志提取物具有抗抑郁作用，能夠調(diào)節(jié)抑郁大鼠腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)，并能改善菌群失調(diào)引起的腸屏障功能損傷、LPS吸收入血量增加及其誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect ofextract on gut microbiota of depression rat

CHEN Qi-jun, YU Lan, ZHAO Wen-wen, XU Rong-rong, CHEN Xiao-qing, WU Xia, BA Yin-ying

Beijing Key Lab of TCM Collateral Disease Theory Research, School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China

To explore the effect and mechanism of Yuanzhi () extract on gut microbiota of depressed rats.Orphans and chronic unpredictable mild stress (CUMS) were used to establish depression rats model. SD rats were randomly divided into control group, control administration group, model group, fluoxetine (2 mg/kg) group and extract ofhigh-, medium- and low-dose (1.5, 1.0, 0.5 g/kg) groups. Behavior of rats in each group were observed and levels of monoamine neurotransmitters and their metabolites in hippocampus were detected; ELISA were used to detect levels of corticotropin-releasing factor (CRF), adrenocorticotropic hormone (ACTH), corticosterone (CORT), interleukin-6 (IL-6) and lipopolysaccharide (LPS) in serum of rats; Transmission electron microscopy (TEM) was used to observe ultrastructural changes of duodenum and colon epithelium of rats; 16S rRNA sequencing was used to detect structural changes of gut microbiota in feces of rats.Compared with model group, depression-like behaviors of rats inextract groups were significantly improved (< 0.05, 0.01, 0.001); Levels of norepinephrine (NE) and 5-hydroxytryptamine (5-HT), dihydroxyphenyl acetic acid (DOPAC) and 5-hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA) in hippocampus were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001); Levels of CRF, ACTH, CORT, IL-6 and LPS in serum were significantly reduced (< 0.01, 0.001), hyperfunction of hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis was alleviated;extract had a regulatory effect on imbalance of gut microbiota flora in rats.extract plays an antidepressant effect by improving structure of gut microbiota, restoring intestinal barrier function, reducing release of intestinal endotoxin and inhibiting inflammation.

extract; depression; chronic unpredictable mild stress; gut microbiota; 16S rRNA

R285.5

A

0253 - 2670(2021)08 - 2313 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.014

2020-10-23

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81703670）

陳啟軍（1994—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: qijun@ccmu.edu.cn

吳 霞，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)與新藥研發(fā)。E-mail: wuxia6710@163.com

巴寅穎，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)與新藥研發(fā)。E-mail: bayinying@ccmu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]